馮 航，方一帆，劉心越，湯小勝

(湖北師范大學(xué) a.食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,b.生物學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,c.生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石435002)

黃嘌呤氧化酶(XO)是一種重要的胞漿酶，可以催化次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，并進(jìn)一步催化黃嘌呤氧化為尿酸。XO功能異常會(huì)導(dǎo)致高尿酸血癥、痛風(fēng)等多種疾病[1]。別嘌呤醇、別嘌硫醇和3,5-二取代-1,2,4-三唑是傳統(tǒng)的XO抑制劑[2]。這些抑制劑因具有進(jìn)行性腎功能衰竭、皮膚問題、史蒂文斯-約翰遜綜合征和重型肝炎等許多不良副作用而被限制使用[3-4]。因此，需要從天然產(chǎn)物提取物中制備出副作用小、療效好的XO抑制劑[5-6]。

天然產(chǎn)物提取物中含有生物活性化合物，其中，異黃酮類化合物是葛根提取液中的主要活性成分，對(duì)抗氧化性、高血壓和糖尿病具有諸多益處[7-8]。然而，由于天然產(chǎn)物提取物的成分復(fù)雜、活性成分分離困難且費(fèi)時(shí)，使其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制[9]。超濾與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UF-LC-MS)是從天然化合物等復(fù)雜混合物中篩選生物活性化合物的一種有效和廣泛應(yīng)用的技術(shù)[10]。

本文借助UF-LC-MS法從葛根提取液中篩選XO抑制劑，對(duì)4種與XO有結(jié)合活性的化合物進(jìn)行鑒定，并通過測(cè)定IC50驗(yàn)證其抑制性。通過評(píng)價(jià)細(xì)胞活性、細(xì)胞內(nèi)ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)釋放和細(xì)胞凋亡等指標(biāo)，研究4種抑制劑對(duì)過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的人正常胃上皮細(xì)胞(GES-1細(xì)胞)氧化應(yīng)激模型的保護(hù)作用，旨在為葛根提取液對(duì)XO抑制作用和氧化應(yīng)激保護(hù)方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及藥品

XO購(gòu)自源葉生物科技有限公司(上海)；葛根購(gòu)自老百姓藥房(長(zhǎng)沙)；乙睛購(gòu)自德國(guó)Merck公司(色譜純)；超純水由ELGA凈水系統(tǒng)制備(電阻率為18.2 MΩ·cm)；其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)。

1.2 葛根提取液的制備

將葛根粉碎，并在4 ℃下貯藏，采用微波輔助萃取法提取葛根。稱取30.0 g葛根粉末轉(zhuǎn)移到裝有200 mL 90%乙醇溶液(V∶V)的燒杯中，微波爐中以60%的功率提取該溶液3次，每次提取6 min。將3次的提取液合并，并在真空下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)掉溶劑。將2.08 g殘留物溶解在水中，并在4 ℃下儲(chǔ)存。

1.3 抑制實(shí)驗(yàn)

首先，將20 μL 1 mg/mL的XO溶液和樣品混合在石英比色皿中。然后，添加1 mL 1 mg/mL的嘌呤溶液開始酶反應(yīng)。將比色皿快速移入紫外可見分光光度計(jì)(型號(hào)為UV2700，日本)中，在295 nm處測(cè)定其吸光度值。相同條件下，用等量的水代替樣品作為空白對(duì)照。樣品的抑制作用是以抑制了50% 酶活性所需的樣品濃度(IC50)來表示，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。XO抑制率計(jì)算公式為：

抑制率=(1-ΔAs/ΔAb)×100%

(1)

式(1)中，ΔAs和ΔAb分別為樣品和空白吸光度的增加值。

1.4 XO抑制劑的篩選

將250 μL 0.75 mg/mL 的XO溶液與250 μL 100 mg/mL的葛根提取液在試管中混合，25 ℃下用恒溫振蕩器孵育30 min。孵育后，將混合物轉(zhuǎn)移到超濾過濾器(型號(hào)為YM-30，截止分子量為10 kDa)中， 4 ℃下13 000 r/min離心20 min。為了去除非特異性結(jié)合，向過濾器中加入500 μL水，相同條件下繼續(xù)離心。此外，向過濾器中添加250 μL 80%甲醇溶液，洗脫與XO結(jié)合的抑制劑， 4 ℃下13 000 r/min離心20 min。收集濾液，用HPLC和LC-MS對(duì)濾液進(jìn)行分析。以高溫處理后的變性酶為替代物，相同條件下進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.5 所篩選化合物的HPLC分析與鑒定

采用C18反相色譜柱250×4.6 mm i.d. ，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，在高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent 1260，購(gòu)自美國(guó))上完成樣品的定性分析和結(jié)合度的計(jì)算。以0.1%醋酸水溶液和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(0～10 min乙腈濃度為10%和10～40 min乙腈濃度為10%～55%)。使用0.45 μm膜過濾后注入5.0 μL樣品，在波長(zhǎng)為254 nm處記錄色譜圖。在LC-MS系統(tǒng)(Agilent 6460，購(gòu)自美國(guó))上完成篩選出的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。

HPLC分析與鑒定的條件與上述條件相同。采用電噴霧離子源(ESI)的正負(fù)離子模式。質(zhì)量檢測(cè)模式設(shè)置為100～1 000 M/z全掃描模式。

1.6 所篩選化合物對(duì)GES-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

1.6.1細(xì)胞培養(yǎng)

人正常胃上皮細(xì)胞(GES-1細(xì)胞)購(gòu)自玉溪生物技術(shù)有限公司，將GES-1細(xì)胞放在含有10%胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基(澳大利亞吉布科市)中培養(yǎng)。37 ℃下，在帶有5% CO2的孵化器中進(jìn)行孵育。

1.6.2細(xì)胞毒性測(cè)試

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)評(píng)估4種篩選化合物存在下H2O2對(duì)GES-1誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。將GES-1細(xì)胞懸浮液(每個(gè)孔2×105～3×105細(xì)胞)接種到96孔板中并預(yù)孵育過夜。將GES-1細(xì)胞在4種篩選化合物存在下暴露于250 μmol/ L H2O2中72 h，4種篩選化合物濃度分別為10，25，50，100 μmol/ L。暴露后，每孔加入10 μL CCK-8反應(yīng)液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀(購(gòu)自美國(guó))測(cè)量每個(gè)孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度。以沒有暴露在H2O2中的GES-1細(xì)胞作為空白對(duì)照。

1.6.3細(xì)胞內(nèi)ROS和SOD的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[11]，用二氫乙啶探針(DHE，購(gòu)自中國(guó)南通碧云天生物技術(shù)研究所)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的過氧化合物ROS。將GES-1細(xì)胞在4種篩選化合物存在下暴露于250 μmol/ L H2O2中72 h，4種篩選化合物濃度分別為10，25，50，100 μmol/ L。暴露后，在含有5 μmol/L DHE的培養(yǎng)基中孵化30 min，測(cè)定紅色ROS產(chǎn)物的量。然后，在激發(fā)波長(zhǎng)為530 nm下，用酶標(biāo)儀讀取細(xì)胞在600 nm處的熒光光譜。

SOD活性采用總超氧化物歧化酶試劑盒(WST-8，購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所)來測(cè)定[12]。將20 μL樣品溶液、160 μL WST-8/酶測(cè)試液(含1 μL酶溶液、151 μL SOD檢測(cè)緩沖液、8 μL WST-8)與20 μL反應(yīng)引發(fā)液(由1 μL反應(yīng)工作儲(chǔ)備液加入39 μL SOD緩沖液稀釋而成)混合。37 ℃下孵育30 min后，使用酶標(biāo)儀記錄波長(zhǎng)450 nm處樣品的吸光度值。所有實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定3次。

1.6.4 LDH釋放測(cè)定

細(xì)胞膜受損時(shí)，細(xì)胞質(zhì)會(huì)釋放LDH，采用LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所)對(duì)LDH完成定量分析，評(píng)價(jià)細(xì)胞膜的完整性[13]。將GES-1細(xì)胞在4種篩選化合物存在下暴露于250 μmol/ L H2O2中72 h，4種篩選化合物濃度分別為10，25，50，100 μmol/ L。暴露后，將細(xì)胞板離心5 min，輕輕抽吸培養(yǎng)基。然后，向細(xì)胞中加入150 μL乳酸脫氫酶釋放試劑，孵育1 h。最后，移出離心5 min后的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液用于LDH測(cè)定。在各細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中加入60 μL檢測(cè)液，細(xì)胞板避光孵育30 min，采用光化學(xué)法，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度值。對(duì)照組LDH活性按LDH活性百分比計(jì)算。

1.6.5 GES-1細(xì)胞凋亡測(cè)定

將GES-1細(xì)胞在4種篩選化合物存在下暴露于250 μmol/ L H2O2中72 h，4種篩選化合物濃度分別為10，25，50，100 μmol/ L。孵育結(jié)束后，收集細(xì)胞并用冷的PBS洗滌2次。將細(xì)胞重新懸浮在300 μL的結(jié)合緩沖液中，用5 μL膜聯(lián)蛋白異硫氰酸V-熒光素(V-FITC)和10 μL碘化丙錠(PI)避光染色15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析凋亡率。

2 結(jié)果與討論

2.1 葛根提取液中XO抑制劑的篩選

2.1.1高效液相色譜條件的優(yōu)化

XO抑制劑篩選前首先測(cè)試葛根提取液對(duì)XO的抑制作用，其水提取液的IC50值為96.0 μg/ mL，表明葛根提取液中含有XO抑制劑。通過超濾和水洗后，用HPLC分析含XO抑制劑的甲醇洗脫液。同時(shí)以變性酶在相同條件下進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

超濾后的葛根提取液和洗脫液的色譜圖如圖1所示。從圖1可以看出，葛根提取液的色譜圖(a)中主峰分離，可以清晰地觀察到葛根提取液中幾種XO抑制劑的峰形和峰寬。在洗脫液的色譜圖(b)中可以清晰地找到4個(gè)峰，在相同保留時(shí)間下，這4個(gè)峰也出現(xiàn)在葛根提取液的色譜圖中。同時(shí)對(duì)照組洗脫液的色譜圖顯示，在40 min內(nèi)沒有出現(xiàn)峰，證實(shí)了圖1中4個(gè)標(biāo)有數(shù)字的峰與XO特異結(jié)合。因此，有必要對(duì)這4個(gè)峰進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定和分析。

圖1 超濾后的葛根提取液和洗脫液的色譜圖

2.1.2篩選出的XO抑制劑的鑒定

通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、紫外數(shù)據(jù)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和比較，采用HPLC-MS進(jìn)行鑒定，確定了4種抑制劑的結(jié)構(gòu)，分別為葛根素(Puerarin)、黃豆苷(Daidzin)、黃豆苷元(Daidzein)和染料木黃酮(Genistein)[14-15]。4種篩選抑制劑的識(shí)別信息見表1。4種抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品及葛根提取液的色譜圖如圖2所示。從圖2可以看出，葛根提取液中4種XO抑制劑的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間是相同的，表明這4個(gè)峰的鑒別是可信的。

表1 4種篩選抑制劑的識(shí)別信息

圖2 4種抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品及葛根提取液的色譜圖

由表1可以看出，這4種篩選抑制劑在波長(zhǎng)255 nm處有最大吸收，在波長(zhǎng)320 nm處有二次吸收，這是異黃酮衍生物典型的吸收光譜。在正模式和負(fù)模式下，化合物1和2的去質(zhì)子化分子離子峰[M+H]+和[M -H]-分別為417和415 M/z，化合物3的去質(zhì)子化分子離子峰[M + H]+和[M -H]-分別為255和253 M/z，化合物4的去質(zhì)子化分子離子峰[M + H]+和[M -H]-分別為271和269 M/z。此外，化合物2還有一個(gè)分子離子峰[M+CH3COOH-H]-為475 M/z，對(duì)于化合物3的分子離子峰[2M -H]-為507 M/z。

2.1.3篩選出的XO抑制劑的抑制作用

從葛根提取液中篩選、鑒定出4種XO抑制劑后，對(duì)4種XO抑制劑的抑制作用進(jìn)行測(cè)試，葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮的IC50值分別為30.8，5.31，14.5，3.02 μg/mL。結(jié)果表明，這4種化合物對(duì)XO有抑制作用。同時(shí)，其他研究者也報(bào)道了這4種化合物對(duì)XO的抑制作用[2,16-17]，表明所篩選的化合物確實(shí)對(duì)XO有抑制作用。

2.2 篩選出的抑制劑對(duì)GES-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.2.1 GES-1的細(xì)胞毒性

為了評(píng)價(jià)4種抑制劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，以GES-1細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)。4種抑制劑對(duì)GES-1細(xì)胞活力的影響如圖3所示。從圖3(a)可以看出，在濃度為250 μmol/L H2O2存在的72 h內(nèi)，GES-1細(xì)胞活力降低至75.0% 。然而，當(dāng)有葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮這4種抑制劑(濃度范圍分別為10，25，50，100 μmol/L)存在時(shí)，細(xì)胞活力顯著提高，且隨著濃度的增加，保護(hù)效果增強(qiáng)。每一種抑制劑都存在一個(gè)最佳濃度，在此濃度下，保護(hù)效果最佳。為了排除4種化合物的細(xì)胞毒性，對(duì)正常GES-1細(xì)胞進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn)。從圖3(b)可以看出，在相同濃度下，4種抑制劑的存在會(huì)引起細(xì)胞活力小幅下降。結(jié)果表明葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮均能改善H2O2誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞氧化損傷，且不會(huì)帶來額外的細(xì)胞毒性。

(a) H2O2誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞

(b) 正常GES-1細(xì)胞

2.2.2細(xì)胞內(nèi)ROS水平

4種抑制劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響如圖4所示。由圖4可以看出， H2O2處理后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯高于對(duì)照組。葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮的加入均能顯著降低ROS水平，呈劑量相關(guān)性。在濃度為100 μmol/L的葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮存在下孵育72 h后，ROS的相對(duì)生成量最低，ROS水平幾乎降至正常水平。

圖4 4種抑制劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

2.2.3細(xì)胞內(nèi)SOD水平

SOD的表達(dá)和活性在清除細(xì)胞內(nèi)的自由基以調(diào)節(jié)ROS水平方面起著重要作用[18]。4種抑制劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)SOD水平的影響如圖5所示。從圖5可以看出，與對(duì)照組相比，過氧化氫顯著阻礙了SOD的活性。但是，葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮對(duì)氧化應(yīng)激下SOD活性降低具有恢復(fù)作用，呈劑量相關(guān)性。結(jié)果表明葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮是通過清除H2O2誘導(dǎo)的ROS積累和激活抗氧化酶，從而保護(hù)GES-1細(xì)胞的抗氧化性。

圖5 4種抑制劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)SOD水平的影響

2.2.4細(xì)胞內(nèi)LDH釋放

胞漿釋放的LDH濃度能反映細(xì)胞膜的完整性。4種抑制劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞LDH釋放的影響如圖6所示。從圖6可以看出，GES-1細(xì)胞暴露于250 μmol/L H2O272 h后，培養(yǎng)基中的LDH濃度幾乎是對(duì)照組的2.5倍。葛根素、黃豆苷、黃豆苷元、染料木黃酮與H2O2共孵育細(xì)胞后，LDH釋放量顯著降低，且呈劑量相關(guān)性。當(dāng)4種抑制劑的濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比，未檢測(cè)到LDH釋放水平的差異。結(jié)果表明葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞膜損傷有明顯的保護(hù)作用。

圖6 4種抑制劑對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞LDH釋放的影響

2.2.5細(xì)胞凋亡測(cè)定

為了進(jìn)一步研究4種抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，用流式細(xì)胞儀測(cè)定了GES-1的細(xì)胞凋亡率。不同濃度下4種抑制劑對(duì)GES-1細(xì)胞凋亡速率的影響見表2；4種抑制劑對(duì)GES-1細(xì)胞凋亡的影響如圖7所示。

(a) 對(duì)照細(xì)胞 (b) 250 μmol/L H2O2 (c) 100 μmol/L葛根素和H2O2

(d) 100 μmol/L黃豆苷和H2O2 (e) 100 μmol/L黃豆苷元和H2O2 (f) 100 μmol/L染料木黃酮和H2O2

表2 不同濃度下4種抑制劑對(duì)GES-1細(xì)胞凋亡速率的影響

從表2和圖7可以看出，在暴露于250 μmol/L H2O272 h后，早期和晚期凋亡細(xì)胞的百分率較高，分別從0.1%增加到11.4%和63.3%。葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡呈劑量相關(guān)。隨著4種抑制劑濃度增加，早期和晚期凋亡細(xì)胞的百分率呈下降趨勢(shì)。在H2O2存在時(shí)，采用濃度為100 μmol/L葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮處理后，早期和總凋亡細(xì)胞的百分率顯著下降。因此，在葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮的存在下，GES-1細(xì)胞能夠抵抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

3 結(jié)論

UF-LC-MS法可有效地從復(fù)雜混合物中篩選和鑒定酶抑制劑，葛根素、黃豆苷、黃豆苷元和染料木黃酮對(duì)XO具有抑制作用，其IC50值分別為30.8，5.31，14.5和3.02 μg/mL。能有效提高細(xì)胞活力，減輕氧化應(yīng)激對(duì)GES-1細(xì)胞的損傷。