王慧慧，孫藝茹，陳心怡，位雪，謝雪晴，王春梅

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029）

壁虎又稱天龍、守宮、蟾蛇，包括多疣壁虎（Gekko japonicus Dumerilet Biron）、蹼趾壁虎或無蹼壁虎（Gekko swinhonis Guenther）及其他幾種壁虎的干燥全體，其中無蹼壁虎產(chǎn)于我國東北與華北[1-3]。壁虎作為傳統(tǒng)中藥始載于《本草綱目》，《四川中藥志》稱其具有“驅(qū)風(fēng)，破血積包塊，治腫瘤”之功效[4]。近年來也在臨床得以廣泛應(yīng)用，尤其對消化系統(tǒng)癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、結(jié)核病和骨髓炎等卓有療效，毒副作用小[5]。壁虎以其顯著的療效已廣泛用于多種癌癥的臨床治療，如以鮮守宮入藥的金龍膠囊，可用于治療原發(fā)性肝癌、大腸癌和食道癌等多種癌癥；后續(xù)有研究表明，壁虎其可提高艾滋病患者的免疫力，提高患者的存活率[6]；以中藥壁虎入藥的牛黃天龍膠囊可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用，對子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌有顯著療效[7]；由壁虎與其他傳統(tǒng)中藥配成的香龍散含藥血清通過誘導(dǎo)癌細胞凋亡治療胃癌[8]。與此同時，壁虎的人工養(yǎng)殖也越發(fā)成熟，但考慮綜合養(yǎng)殖成本，對其最佳入藥采收時期未有明確研究。此前已有大量研究表明植物類中藥材活性與其采收期密切相關(guān)[9-11]，動物藥相關(guān)研究較少。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）廣泛分布于人體的骨、肝、腸及胎盤等組織中，患阻塞性黃疸、原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌和膽汁淤積性肝炎時，肝細胞會過度制造ALP，因此ALP活力檢測已發(fā)展成為上述疾病的常規(guī)檢查指標[12]。本課題組前期[13]發(fā)現(xiàn)壁虎水提粗蛋白體內(nèi)外抗腫瘤活性一致性較好，其發(fā)揮抗腫瘤活性途徑之一是誘導(dǎo)腫瘤細胞分化，且ALP活力與癌細胞分化活性具有直接相關(guān)性。因此本實驗比較5種生長期壁虎水提物可溶性蛋白分子量分布及含量，體外實驗MTT法檢測水提物癌細胞增殖抑制活性，并檢測用藥后癌細胞ALP活力指標變化，以此反映腫瘤細胞分化狀態(tài)，共同表征壁虎的抗腫瘤活性，為確定最佳入藥采收時機提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 鮮壁虎

無蹼壁虎鮮品，購自山東濟南市中九頂山天然養(yǎng)殖場，由北京中醫(yī)藥大學(xué)張冰教授鑒定。

1.2 細胞株

Bel-7402人肝癌細胞株，購買于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，由北京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥系保存。

1.3 儀器

恒溫干燥箱（上海一恒），低溫高速離心機（Sigma），高速萬能粉碎機（泰斯特，F(xiàn)W800），紫外分光光度計（Ultraviolet-2100型，上海龍尼柯），垂直電泳槽（Bio-Rad），酶標儀（EPOCH,Biotek,USA），倒置顯微鏡（Nikon Eclipse TE2000,Japan）。

1.4 試劑

SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京索萊寶），BCA蛋白定量試劑盒（北京蘭博利德），ALP定量試劑盒（北京蘭博利德），RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco,Life Technologies,USA），噻唑藍（MTT）、牛血清白蛋白和二甲基亞砜（DMSO,Sigma,USA）；Tris、氨芐青霉素、鏈霉素（拜耳迪生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 壁虎水提物的制備

以置于﹣80℃超低溫冰箱保存的新鮮壁虎為實驗材料。稱取相同克重的壁虎化凍，用粉碎機勻漿后按照壁虎和蒸餾水比為1∶4（w/v）制得勻漿液。勻漿液于﹣80℃和20℃條件下反復(fù)凍融5次，破裂組織細胞得壁虎組織液。組織液通過4層紗布過濾除大塊組織，雙層濾紙抽濾去除部分油脂和沉淀物，取濾液在12 000 rpm、20 min、4℃條件下高速離心，收集上清液，先后經(jīng)0.45m、0.22m濾膜除菌4℃保存?zhèn)溆?，制得生藥?.25 g mL-1鮮壁虎水提粗蛋白。3月齡、5月齡、8月齡、1年齡和3年齡壁虎組別分別命名為I、II、III、IV、V組別。

2.2 水溶性蛋白質(zhì)濃度及多樣性測定

按照BCA法蛋白定量試劑盒說明書測定水溶性蛋白質(zhì)濃度。采用SDS-PAGE法測定水溶性蛋白質(zhì)多樣性差異，上樣樣品稀釋至1 mg mL-1，分離膠濃度設(shè)為10%，濃縮膠濃度為5%。

2.3 MTT法評估各樣品抑制Bel-7402細胞增殖活性

將指數(shù)生長期的Bel-7402細胞（單位體積細胞個數(shù)為3 104/mL，每孔100L）接種到96孔板中，使細胞自然生長24 h，后暴露于100L各濃度稀釋樣品中。I、II、III、IV加藥組分別用相應(yīng)比例的蒸餾水、5 RPMI-1640培養(yǎng)基及FPS將水提物稀釋為2～50倍的活性待測液作用于Bel-7402細胞，空白對照組Bel-7402細胞使用不含水提物含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于培養(yǎng)箱孵育24 h、48 h和72 h，37℃、5%CO2，每組3個重復(fù)。用倒置顯微鏡觀察并拍照監(jiān)測形態(tài)變化。每孔加入100L含0.5 mg mL-1MTT的PBS再孵育4 h，除去上清液，加入150L DMSO并搖動15 min。使用酶標儀測量570 nm處吸光度。細胞抑制率計算式：抑制率＝（1-A處理/A對照）100%

2.4 比較樣品對Bel-7402細胞ALP活力影響

將指數(shù)生長期Bel-7402細胞（7 104個/孔）接種到6孔板中，使細胞自然生長24 h后暴露于1 mL/孔各濃度稀釋樣品中。用前述方法分別配置將I、II、III、IV組水提物稀釋為2倍、4倍、6倍、9倍的樣品待測液作用細胞，空白對照組更換含10%FPS的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后倒掉上清液，用胰酶消化收集細胞，使用ALP定量試劑盒檢測Bel-7402細胞ALP活力變化情況。

2.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及t檢驗進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同生長期壁虎外觀形態(tài)對比

如圖1所示，壁虎生長前期的發(fā)育主要體現(xiàn)在身體的縱向伸長，隨著年齡的增大伸長速度有所衰減，成熟后壁虎主要體現(xiàn)為肢體增粗。從外觀看，無蹼壁虎通體呈灰棕色，頭、頸、軀干、尾及四肢均有深或淺的色斑，頸及軀干背面形成6～7條橫斑，尾背面形成11～14條橫斑，其深淺程度和花紋與生活環(huán)境相關(guān)，本實驗樣品未見花紋深淺與年齡有密切相關(guān)性。如表1數(shù)據(jù)所示，3月齡幼體壁虎體長介于6～6.5 cm，5月齡幼體壁虎體長介于9～9.5 cm，8月齡亞成體壁虎體長介于11～11.5 cm，8月齡后伸長速度顯著減慢但橫寬明顯增大。1年齡成體壁虎體長介于11.5～12 cm，此后身長增長趨于停滯，主要體現(xiàn)在頭部比重增大。

圖1 不同生長期無蹼壁虎長度及外觀形態(tài)Fig.1 Appearances of Guenther with different growth stages

表1 不同生長期無蹼壁虎壁虎體長和體重（，n=10）Table 1 The length and weight of Guentherwith different growth stage（s，n=10）

表1 不同生長期無蹼壁虎壁虎體長和體重（，n=10）Table 1 The length and weight of Guentherwith different growth stage（s，n=10）

組別 Group 體長（cm）Lengh 體重（g）Weight Group I 6.35±0.20 0.66±0.15 Group II 9.23±0.15 1.25±0.10 Group III 11.37±0.15 2.50±0.13 Group IV 11.77±0.15 5.10±0.10 Group V 12.30±0.15 6.20±0.12

3.2 樣品水溶性蛋白質(zhì)濃度和多樣性隨年齡增大而降低

如圖2 c，隨著壁虎體型的不斷增大，其水溶性蛋白質(zhì)含量有所降低。3月齡（I）和5月齡（II）水提物中水溶性蛋白質(zhì)含量最高可達12.58 mg mL-1，5月齡（II）之后同等生藥量水提物樣品水溶性蛋白含量顯著下降（P＜0.001）。

在蛋白多樣性變化方面，如圖2 a、2 b紅框標示區(qū)域，不同生長期壁虎可溶性蛋白分子量大小分布有明顯差異。各組上樣樣品為相同生藥量時（圖2 a），隨著生長期延長蛋白條帶數(shù)減少，分子量分布多樣性降低，其中15～25 kD蛋白條帶溶出減弱最為明顯。將上樣蛋白質(zhì)濃度調(diào)整至相同后（圖2 b），發(fā)現(xiàn)3個分子量區(qū)間蛋白質(zhì)條帶的變化較為明顯：隨著生長期的延長，35 kD左右蛋白條帶和15～25 kD區(qū)域蛋白條帶減少甚至消失，而區(qū)間40～60 kDa蛋白質(zhì)條帶灰度加深，特別是45kD左右，表明該分子量區(qū)間蛋白所占比重增加。另外，含量最高的蛋白質(zhì)始終集中在40～60 kDa及10～15 kDa區(qū)域。結(jié)果表明，壁虎機體成熟伴隨著某些水溶性蛋白的持續(xù)衰減，使另一部分蛋白質(zhì)比重相對增高。

圖2 不同生長期壁虎水提物中可溶性蛋白的濃度和蛋白分子組成差異Fig.2 Concentration and component difference of soluble proteins in AG of Guenther with different growth stages

3.3 不同生長期壁虎對人肝癌細胞Bel-7402體外增殖抑制差異

5種生長期壁虎的不同濃度水提物分別作用于Bel-7402細胞24 h（圖3 a）、48 h（圖3 b）和72 h（圖3 c）后皆表現(xiàn)出時間和濃度正相關(guān)增殖抑制活性。壁虎生長至8月齡（III）后細胞增殖抑制活性開始顯著高于3月齡（I）和5月齡（II），且該差距與用藥濃度負相關(guān)，用藥濃度越低該差距越明顯。

在同一濃度下，3月齡（I）和5月齡（II）組對Bel-7402細胞的增殖抑制作用沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），8月齡（III）、1年齡（IV）和3年齡（V）組沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見圖3。該統(tǒng)計學(xué)差異結(jié)果與相同生藥量可溶性蛋白含量相一致，說明5～8月齡之間是壁虎的迅速生長期，8月齡之后壁虎生長變化趨于穩(wěn)定，抑制率最高可達88.94%±6.68%（IV/72h），在同一條件下，3月齡（I）和5月齡（II）組抑制率僅為41.89%±3.85%（I）和39.97%±4.66%（II）。

圖3 用藥24 h（a）、48 h（b）、72 h（c）后5種生長期壁虎水提物對人肝癌Bel-7402細胞的增殖抑制影響（，n=3）Fig.3 The proliferation inhibition activity of five kinds of AG(aqueous extracts of fresh gecko)on Bel-7402 cells was evaluated by MTT assays with the same crude drug content for 24 h(a),48 h(b),72 h(c).（，n=3）

3.4 不同生長期壁虎對Bel-7402細胞ALP活力抑制差異

不同濃度不同生長期壁虎水提物作用癌細胞24 h后，表現(xiàn)出不同程度地對Bel-7402細胞ALP活力的濃度相關(guān)性抑制，8月齡（III）及以上成體壁虎的水提物具有更強的ALP活力抑制活性（圖4）。3月齡（I）與5月齡（II）組在稀釋至9倍時，細胞ALP活力與空白組無統(tǒng)計學(xué)差異，其余樣品組均與空白對照組存在顯著性差異（P＜0.05）。當用藥濃度最高時，III、IV、V組細胞ALP活力降為61.76±5.64 Kat、52.16±9.68 Kat、56.18±4.73 Kat，與III組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對Bel-7402細胞增殖抑制率分別為52.62%、59.98%和56.90%，相同濃度無統(tǒng)計學(xué)差異。壁虎水提物對Bel-7402細胞ALP活力抑制在8月齡達到最強，后并無顯著增強。

圖4 用藥24 h后不同生長期壁虎對Bel-7402 ALP活性的影響Fig.4 Effects of different growth stages of Gecko on the ALP activity of Bel7402 cells for 24 h

4 討論

動植物中藥的采收時機對其活性影響較大，目前多以藥用活性成分的含量評價其最佳采收期。如野葛的總異黃酮含量與生長時長成正比，后期較初期含量可增加53%，其抗氧化活性也隨之增大，12月份時達到峰值[14]；對忍冬葉不同生長期9種活性成分定量研究顯示，6月份抗菌活性最好，為其最佳采收期[15]。對動物藥采收時期與活性關(guān)系也進行了一些探索，如傳統(tǒng)全身入藥動物藥地龍夏、秋季體型達峰值后，其體內(nèi)降血壓活性成分血小板活化因子含量最高[16]；入藥全蝎的蝎齡越大牛磺酸含量越高，且養(yǎng)殖品種優(yōu)于野生品種[17]；日本醫(yī)蛭在夏、秋成體時收獲入藥，抗凝血酶含量最高，不低于120 U g-1[18]；中國林蛙，其最佳入藥體為經(jīng)過兩年生長期25 g以上的成蛙[19]。由此可見，作為藥用動物采收時機對其藥用價值的影響較大，隨著動物藥養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，最佳采收期成為值得研究的問題。

本課題組[13]前期已通過體內(nèi)外實驗證明鮮壁虎水提肽類物質(zhì)具有高抗腫瘤活性及體內(nèi)外活性一致性，Bel-7402細胞活性與其ALP活力具有正相關(guān)性，可由此評估癌細胞分化抑制程度。本實驗選取5種生長期壁虎制備水提物進行比較，結(jié)果顯示，5月齡前的幼年壁虎可溶性蛋白含量相對較高，主要由于生長前期脂肪積累程度低，隨著年齡的增長，壁虎可溶性蛋白含量和種類逐漸減少，主要表現(xiàn)在15～20 kDa和30～35 kDa分子減少（圖2），區(qū)間40～60 kDa蛋白含量增加，活性蛋白是否位于此區(qū)段有待進一步研究。體外MTT實驗結(jié)果和Bel-7402細胞ALP活性變化顯示，壁虎生長至8月齡（III）后，抗腫瘤活性達到最高且繼續(xù)成熟后無顯著性差異變化，體外增值抑制率表現(xiàn)出濃度和時間相關(guān)性，最高可達88%左右。考慮到養(yǎng)殖成本與養(yǎng)殖時長成正比，無蹼壁虎生長至8月齡時入藥，可發(fā)揮抗腫瘤藥性。