卜研，馮楚楚，閆喜軍，薛向紅

（中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林 長春 130112）

犬瘟熱（Canine Distemper,CD）是由犬瘟熱病毒（Canine Distemper Virus,CDV）感染多種肉食動物而引起的一種急性熱性、高度接觸性傳染病[1]。犬瘟熱病毒對不同宿主的易感性和致病性不同，死亡率為50%～100%。半個多世紀以來，犬瘟熱防控主要依賴于疫苗免疫，犬瘟熱弱毒活疫苗已經在世界范圍內被廣泛應用，且防控效果不錯。然而，近年來，世界各地出現(xiàn)了多起野生動物和家養(yǎng)動物感染犬瘟熱發(fā)生死亡的報道[2-5]，其發(fā)生機制尚不清楚。犬瘟熱病毒弱毒疫苗株是通過連續(xù)雞胚和細胞系傳代致弱獲得的，其基因型屬于美洲I型[3]。我國犬瘟熱病毒流行毒株主要是亞洲I型，并呈現(xiàn)多基因型流行的特征[6]。

犬瘟熱病毒屬于副黏病毒科麻疹病毒屬成員，其基因組是單股負鏈非分節(jié)段的RNA，從3'到5'端依次編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大聚合酶蛋白（L）6個結構蛋白，以及V和C兩個非結構蛋白[7]。其中，F(xiàn)和H蛋白暴露于病毒囊膜表面，決定著犬瘟熱病毒的細胞嗜性和致病性，同時也是關鍵的保護性抗原[8,9]。反向遺傳技術的發(fā)展和成熟，為我們系統(tǒng)性地研究病毒結構與功能、感染與免疫機制提供了強有力的支撐。Veronika von Messling等[10]將犬瘟熱病毒疫苗株Onderstepoort的H基因替換為強毒CDV5804株的H基因，比較了其與親本毒株形成的合胞體大小、F和H蛋白表達量以及病毒生長動力。結果顯示，H蛋白決定了病毒感染細胞的趨向性和致病性。2010年Bevan Sawatsky和Veronika von Messling[10]構建了將強毒株CDV5804的H基因替換為onderstepoort H基因的重組病毒5804P-HOL，發(fā)現(xiàn)此重組病毒雖然與親本強毒CDV5804保持了基本一致的生長特性，但卻對雪貂完全減毒或無毒。

因此，本研究為了明確我國流行分離的犬瘟熱病毒強毒HBF-1的毒力決定基因及其致病機制，利用此前已建立的犬瘟熱病毒強毒HBF-1株的反向遺傳操作系統(tǒng)，將CDV強毒HBF-1的H基因替換為疫苗毒Onderstepoort的H基因，拯救獲得了表達疫苗毒H基因的嵌合病毒rHBF-vacH，該病毒可在Vero-dSlam中穩(wěn)定傳代，且病毒滴度穩(wěn)定達到107.0 TCID50/mL，超過親本毒株rHBF-1 105.0 TCID50/mL的滴度。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞、質粒

犬瘟熱病毒強毒rHBF-1和疫苗毒Onderstepoort，表達犬源Slam受體的非洲綠猴腎細胞（Vero-dSlam）和倉鼠腎細胞（BSR），質粒pcCDV3.2-HBF-1、pcCDV3.1-N、pcCDV3.1-P和pcCDV3.1-L，均由中國農業(yè)科學院特產研究所動物傳染病防控創(chuàng)新團隊保存。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；轉染試劑X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent購自Roche公司；DL 15 000 DNA Marker、DL 2 000 DNA Marker購自TaKaRa；DNA凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒均購自Axygen；總RNA提取試劑盒RNeasy mini kit購自QIAGEN；高保真酶Trans start Fast Pfu DNA polymerase、載體pEASY-Blunt cloning kit和2 Trans StartFast Pfu PCR Super Mix均購自北京全式金生物技術有限公司；各種限制性內切酶和T4 DNA連接酶均購自Thermo公司；CDV N單克隆抗體（MAB）購自VMRD；綠色熒光（FITC）標記的羊抗鼠的二抗購自Proteintech公司；AF6000熒光顯微鏡購自Leica公司。

1.3 引物的設計與合成

以GenBank公布的犬瘟熱病毒疫苗毒Onderstepoort（AF378705）的H基因序列為參考，利用Primer Premier 6.0設計特異性引物見表1，用于擴增疫苗毒Onderstepoort的H基因，引物送上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 Onderstepoort株基因的擴增引物Table 1 Primers of thegene of Onderstepoort strain for a full-length cDNA clone construction

表1 Onderstepoort株基因的擴增引物Table 1 Primers of thegene of Onderstepoort strain for a full-length cDNA clone construction

注：下劃線部分為Pme I酶切位點，加粗部分為Pac I酶切位點。Note:The underlined are Pme I site,and the bold are Pac I site.

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1.4 替換疫苗毒H基因的全長重組質粒的構建

根據QIAGEN總RNA試劑盒的說明，提取病毒Onderstepoort細胞培養(yǎng)懸液的總RNA，對總RNA進行反轉錄，獲得cDNA。使用引物HBF-ORF3-F/R（表1），以Onderstepoort的反轉錄產物cDNA為模板，用高保真DNA聚合酶進行擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小正確后凝膠回收。將回收純化的H基因目的片段連接至pEASY-Blunt載體上，獲得重組質粒pEASY-Blunt-HBF-ORF3；酶切鑒定正確的質粒，送上海生工生物工程技術股份有限公司測序。測序正確的質粒pEASY-Blunt-HBF-ORF3和全長質粒pcCD V3.2-HBF-1分別用限制性內切酶Pme I和Pac I雙酶切，之后分別回收純化目的片段與載體片段，并使用T4連接酶將二者連接，獲得的重組連接子用Pme I和Pac I雙酶切鑒定，鑒定正確的陽性連接子送至上海生工生物工程技術股分有限公司測序。將測序正確的全長重組質粒命名為pcCDV3.2-HBF-vacH（圖1）。

圖1 嵌合病毒rHBF-vacH的全長質粒示意圖Fig.1 The schematic of a full-length cDNA recombinant plasmid with a replaced H gene of Onderstepoort strain

1.5 嵌合病毒的拯救

轉染前1d，于6孔板中接種2 105個BSR細胞/孔，第2天當細胞生長密度達60%以上時開始轉染，將全長重組質粒pcCDV3.2-HBF-vacH與輔助質粒pcCD V3.1-N、pcCDV3.1-P和pcCDV3.1-L分別按5g、1g、0.8g和0.5g的比例進行共轉染，使用X-treme GENE HP DNA轉染試劑22L，具體轉染方法參照說明操作，共轉染3 h，更換為含10%FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，取細胞懸液大約300L添加至密度約為80%的Vero-dSlam細胞上，35℃、5%CO2培養(yǎng)5～10 d，觀察CDV引起的典型合胞體病變（CPE）。待出現(xiàn)CPE后，凍融收集細胞及上清液，并繼續(xù)接種Vero-dSlam細胞進行傳代，將獲得的重組病毒命名為rHBF-vacH。

1.6 rHBF-vacH的RT-PCR鑒定

利用RNA提取試劑盒，分別提取wtHBF-1、rHBF-1和rHBF-vacH病毒懸液的總RNA，反轉錄合成cDNA，根據普通PCR試劑盒2 Trans StartFast Pfu PCR SuperMix的說明操作，利用引物F3-F：TTCCTTCAAAAGCGTTTAAACTGCAACAAATAGTGGCG和F3-R：GGATTAATTAACACGGTCATCATCCCTCAGTTCAATTGA擴增wtHBF-1和rHBF-1的H基因，用引物HBF-ORF3-F/R擴增rHBF-vacH的H基因，PCR反應總體系50L，其中2 Trans StartFast Pfu PCR Super Mix 25L，上游引物1L，下游引物1L，病毒cDNA 2L，ddH2O補齊至50L；PCR程序為95℃2 min，95℃20 s，59℃20 s，72℃30 s，40個循環(huán)；72℃7 min，將3個PCR產物分別回收純化后，用限制酶Cpo I酶切。Onderstepoort H基因中有Cpo I酶切位點，而wtHBF-1、rHBF-1的H基因中無此識別位點，同時，對從rHBF-vacH擴增獲得的H基因片段進行序列測定，確定其來源于Onderstepoort毒株。

1.7 rHBF-vacH的免疫熒光鑒定

將收獲的rHBF-vacH病毒懸液接種于Vero-dSlam細胞，待細胞出現(xiàn)CPE后，以多聚甲醛固定，一抗用抗CDV N蛋白單克隆抗體孵育1 h，二抗用FITC標記羊抗鼠IgG染色，最后在熒光顯微鏡的藍紫光下觀察綠色熒光。

1.8 rHBF-vacH的傳代特性

為確定嵌合病毒rHBF-vacH在體外是否穩(wěn)定遺傳，我們將rHBF-vacH在Vero-dSlam細胞上傳代9次，取每一代病毒液300L，測定其TCID50，使用軟件GrapPad Prism 6.0繪制病毒傳代圖譜。

2 結果

2.1 嵌合病毒rHBF-vacH的RT-PCR鑒定結果

用1%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴增后酶切產物的條帶大小，結果顯示，wtHBF-1、rHBF-1的H基因PCR產物不能被限制酶Cpo I切開，酶切產物仍然為2000 bp大小條帶，而因為Onderstepoort疫苗株的H基因含有Cpo I酶切位點，因此，嵌合病毒rHBF-vacH的H基因擴增產物被切為兩個條帶，分別是1 400 bp和600 bp（如圖2）。

圖2 rHBF-vacH的RT-PCR鑒定Fig.2 Digestion identifications of gene of rHBF-vacH

2.2 嵌合病毒rHBF-vacH的免疫熒光鑒定結果

將嵌合病毒rHBF-vacH感染Vero-dSlam細胞，觀察到典型細胞病變情況（圖3 A），同時空白對照細胞無病變（圖3 B），用犬瘟熱N蛋白單克隆抗體為一抗、FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗，進行間接免疫熒光檢測，結果顯示，發(fā)生病變的細胞能與CDV N蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性結合，發(fā)出綠色熒光，呈陽性信號（圖3 C），而空白對照細胞無熒光，為陰性（圖3 D）。

圖3 rHBF-vacH的免疫熒光鑒定Fig.3 Immunofluorescence identifications of the rHBF-vacH in Vero-dSlam cells

2.3 rHBF-vacH的形態(tài)鑒定

重組病毒rHBF-vacH的細胞感染懸液通過復染，在電子顯微鏡下觀察，結果可見，一個視野下，有直徑約為150 nm左右的多個病毒粒子，病毒粒子表面有一層囊膜包裹，因此，可認為是副黏病毒（圖4）。

圖4 rHBF-vacH粒子的電鏡形態(tài)Fig.4 The morphology of rHBF-vacHin the electron microscope

2.4 rHBF-vacH在Vero-dSlam細胞上的穩(wěn)定傳代

rHBF-vacH重組病毒可在Vero-dSlam細胞上穩(wěn)定傳代，重組病毒在第2代時有明顯病毒滴度的增高。目前，傳到第9代時，病毒滴度最高可穩(wěn)定達到107.0 TCID50/mL（圖5），而親本毒株rHBF-1和野生毒株wtHBF-1的病毒滴度穩(wěn)定在105.0 TCID50/mL。

圖5 rHBF-vacH在Vero-dSlam細胞的傳代Fig.5 The virus titers of rHBF-vacH in Vero-dSlam over passages.

3 討論

近年來，在世界范圍內，犬瘟熱病毒不斷進化，頻繁地跨宿主傳播，而且致病性呈增長趨勢[3]。犬瘟熱病毒的H蛋白是各個結構蛋白和兩個非結構蛋白中遺傳變異能力最大的，不同毒株H基因的核苷酸變異率達到11%[11]。從死亡的恒河猴分離的CDV Monkey-BJ01-DV株，是由犬科動物傳播的，CDV H蛋白特定的氨基酸突變導致病毒適于在猴子體內增殖感染[2]。有研究表明，犬瘟熱病毒在動物體內的選擇壓力下，使CDV H蛋白與Slam受體相互作用的附近位點發(fā)生有意義突變，因此認為犬瘟熱病毒流行毒株H基因的變異可能是導致疫苗免疫失敗的原因[12]。在CDV H蛋白上發(fā)現(xiàn)了大多數的中和表位，研究證明，CDV H蛋白上的抗原決定部位，在麻疹病毒屬中的其他病毒中也被證明是免疫優(yōu)勢表位[13]。H蛋白作為病毒的囊膜蛋白，是誘導保護性中和抗體的關鍵抗原[14]，常被作為開發(fā)疫苗的靶標。Yanping Jiang等[15]開發(fā)了一種表達CDV H蛋白重組益生菌疫苗，用于鼻內接種，誘發(fā)黏膜免疫，動物體內的評價效果較好。Lina Yan等[16]以非復制完全型腺病毒為載體，構建了表達犬瘟熱病毒H蛋白和狂犬病毒G蛋白的重組腺病毒rAd5-GH，其在小鼠和狐貍體內激發(fā)了穩(wěn)定持久的保護性免疫應答。H蛋白還是CDV重要的毒力因子，有研究將CDV強毒5804P的H基因替換為疫苗毒株的H基因，獲得的重組病毒維持了CDV強毒5804P的生長動力，但卻對雪貂完全不致死。該減毒重組病毒在感染初期仍然具有輕微的免疫抑制，與疫苗株相比，減毒重組病毒產生的抗體水平較低[10]。

因此，本研究利用已建立的犬瘟熱病毒強毒HBF-1的反向遺傳系統(tǒng)，將強毒HBF-1的H基因替換為疫苗毒Onderstepoort的H基因，通過病毒拯救，獲得了一株嵌合病毒rHBF-vacH。實驗結果表明，嵌合病毒rHBF-vacH的基因組中攜帶著疫苗毒Onderstepoort的H基因，嵌合病毒rHBF-vacH可以很快適應VerodSlam細胞，從第2代開始，病毒滴度顯著提高，之后在Vero-dSlam細胞傳代培養(yǎng)，嵌合病毒rHBF-vacH的病毒滴度一直非常穩(wěn)定，可穩(wěn)定達到107.0 TCID50/mL。而親本毒株rHBF-1和wtHBF-1在Vero-dSlam細胞上的病毒滴度穩(wěn)定維持在105.0 TCID50/mL左右。犬瘟熱病毒借助其表面的H蛋白與宿主細胞Slam受體相結合，促進病毒囊膜與細胞膜融合，使犬瘟熱病毒的核衣殼侵入細胞[17]。嵌合病毒比親本病毒的滴度高，其原因可能是疫苗毒的H蛋白與Slam受體親和力較高，促使攜帶疫苗毒H基因的嵌合病毒rHBF-vacH更容易在Vero-dSlam間傳播增殖。未來，我們將在體內評價比較分離株wtHBF-1和嵌合病毒rHBF-vacH的致病性，為后續(xù)犬瘟熱疫苗的精準設計提供參考。