陳湖芳，姚新轉(zhuǎn)，王璐，張寶會(huì)，呂立堂,※

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院山地植物資源與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）是中國(guó)特有植物，屬于杜仲科杜仲屬落葉喬木，原產(chǎn)黃河以南，目前主要分布在我國(guó)中緯度地區(qū)，在醫(yī)藥、工業(yè)和綠化等方面有重要作用[1-3]。杜仲膠是一種天然高分子聚合物，其主要成分為反式-l,4-聚異戊二烯。天然橡膠主要成分為順式-l,4-聚異戊二烯，杜仲膠化學(xué)成分與天然橡膠相同，但分子結(jié)構(gòu)不同，它們互為同分異構(gòu)體，且杜仲膠合成過(guò)程與天然橡膠合成過(guò)程區(qū)別為反式異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（TPT）負(fù)責(zé)引發(fā)底物的合成，所摻入的C5單體呈反式構(gòu)型，形成杜仲膠；順式-異戊烯轉(zhuǎn)移酶（CPT）負(fù)責(zé)催化異戊二烯單體（IPP）多聚化，形成橡膠，所摻入的C5單體呈順式構(gòu)型。我們?cè)诤芏嘀参镏邪l(fā)現(xiàn)了異戊烯類化合物，它在植物代謝過(guò)程中有重要作用，例如IPPS（異戊烯基二磷酸合酶，又稱異戊烯基轉(zhuǎn)移酶）催化IPP與DMAPP（二甲基烯丙基焦磷酸）縮合反應(yīng)，形成GPP（牻牛兒基焦磷酸），合成各種異戊烯類的化合物[4]。

天然橡膠主要由順式-1,4-異戊二烯組成的高分子量的生物聚合物，它們由緊密結(jié)合在橡膠粒子上的酶定向運(yùn)輸IPP而形成橡膠分子[5,6]。順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是天然橡膠合成的關(guān)鍵酶，催化IPP多聚化，形成長(zhǎng)鏈橡膠，是橡膠生物合成的最后一步；此外，它還決定橡膠分子的大小、產(chǎn)膠量和橡膠的理化性質(zhì)等[7]。據(jù)文獻(xiàn)記載，最早被人們分離出來(lái)的CPT是擬南芥的ACPT（順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶），研究表明該酶雖然可以催化合成聚異戊二烯（大小為5.4 103～6.8 103Da），但無(wú)法形成分子量大于1 106Da的天然橡膠[8]。通過(guò)Northern blot雜交，結(jié)果顯示克隆的基因能夠在膠乳中大量地表達(dá)，但在橡膠樹(shù)的葉片中不表達(dá)，也不受乙烯的誘導(dǎo)。Schmidt等從蒲公英橡膠草（T.brevicorniculatum）克隆了TkCPT1-3基因，在釀酒酵母和煙草中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，結(jié)果為TkCPT1-3催化T.brevicornicu橡膠合成過(guò)程中IPP的多聚化過(guò)程，且TkCPT1-3的功能可能基本相同[9,10]。Post等[11]通過(guò)RNAi實(shí)驗(yàn)干涉T.brevicornicu中TkCPT1-3基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株橡膠含量變低，形成橡膠粒子的數(shù)量減少，同時(shí)三萜含量和菊糖合成量增加明顯，HMGR蛋白活性下降。

CPT與UPPS（十一異戊烯基二磷酸合酶）屬于IPPS[4]。IPPS有2種，即催化合成反式雙鍵的E-IPPS（反式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶）和催化合成順式雙鍵的Z-IPPS（順式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶）。CPT屬于Z-IPPS[Cis(Z)-Isoprenyl Diphosphate Synthases]超級(jí)家族。在原核生物中，橡膠轉(zhuǎn)移酶是天然橡膠合成的重要參與者，催化IPP多聚化過(guò)程。根據(jù)產(chǎn)物鏈長(zhǎng)度，CPT分為3個(gè)亞家族：短鏈（C15）、中鏈（C50-C55）和長(zhǎng)鏈（C70-C120）。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，橡膠草和其他產(chǎn)橡膠植物的CPT具有強(qiáng)烈的保守性，所以TkCPT1、TkCPT2和TkCPT3有助于橡膠草中的橡膠生物合成。雖然各種產(chǎn)膠植物物種之間有一定差異，但天然橡膠生物合成的基本機(jī)制是相似的，都涉及了酶與膠乳中的橡膠粒子結(jié)合的過(guò)程，橡膠粒子是植物體內(nèi)天然橡膠的生物合成發(fā)生的場(chǎng)所，是一個(gè)非常繁雜的生物合成過(guò)程，因此，研究橡膠轉(zhuǎn)移酶的性質(zhì)及其生物學(xué)功能，對(duì)揭示橡膠生物合成的分子機(jī)理及橡膠分子量大小的決定機(jī)制具有重要意義[12]。本實(shí)驗(yàn)嘗試通過(guò)超量表達(dá)TkCPT1基因使合成反式-1,4-聚異戊二烯橡膠的杜仲合成順式-1,4-聚異戊二烯橡膠。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

外植體：杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）下胚軸，由無(wú)菌的杜仲苗得到，用于遺傳轉(zhuǎn)化材料。遺傳轉(zhuǎn)化菌株：農(nóng)桿菌（菌株LBA4404）、大腸桿菌（菌株DH5E）；雙子葉植物表達(dá)載體pSH737，報(bào)告基因?yàn)間us::nptII。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 用無(wú)菌刀片將杜仲無(wú)菌苗下胚軸切成0.5 cm左右莖段備用，重懸液重新懸浮農(nóng)桿菌，使菌液與下胚軸充分接觸，侵染30 min。

將杜仲下胚軸從菌液中迅速取至無(wú)菌濾紙，吸干菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25℃黑暗培養(yǎng)2～3 d。轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待抗性芽形成。

對(duì)照組：未浸染農(nóng)桿菌下胚軸，置于WT培養(yǎng)基中，WT培養(yǎng)基中不添加抗生素，其他條件都相同。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因杜仲煉苗與移栽 選取長(zhǎng)勢(shì)良好的杜仲抗性芽，與無(wú)菌苗嫁接，25℃培養(yǎng)1個(gè)月，待有新芽長(zhǎng)出，進(jìn)行7 d的煉苗處理（期間保證葉片不能失水），洗凈嫁接苗根部培養(yǎng)基，移栽至溫室（相對(duì)濕度：80%～90%，溫度：20～28℃）中培養(yǎng)，并搭建透氣透光的遮陽(yáng)網(wǎng)對(duì)其進(jìn)行遮陽(yáng)保護(hù)。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學(xué)染色 剪取杜仲葉片、莖、根和愈傷組織，放入離心管中，添加適量GUS染色液使其完全浸沒(méi)，真空泵真空5min；37℃培養(yǎng)箱中放置過(guò)夜；倒掉GUS染液，用乙醇溶液對(duì)染色組織進(jìn)行梯度脫色至綠色褪去（梯度：50%-70%-95%-99.99%的無(wú)水乙醇）。體式顯微鏡下觀察GUS染色情況，并拍照。

1.2.4 杜仲植株DNA提取與PCR鑒定 杜仲基因組DNA提取參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)（天根生化科技有限公司）。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因杜仲與野生型杜仲代謝組

1.2.5.1 樣品信息 待測(cè)樣本信息：轉(zhuǎn)基因組和野生型組，每組選用1個(gè)株系，6份生物學(xué)重復(fù)，樣本見(jiàn)表1，具體方法參考Benton的研究[13]，表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample informations

1.2.5.2 樣本預(yù)處理方法 80℃取出杜仲轉(zhuǎn)基因苗，液氮研磨至粉末，稱取60 mg，1 mL甲醇乙腈水溶液（2:2:1，體積比）渦旋60s，低溫2次超聲，30min/次，20℃沉淀蛋白1 h，過(guò)濾管過(guò)濾，14 000 rcf，4℃離心20 min，取上清液，冷凍干燥，80℃保存樣本。

1.2.5.3 色譜-質(zhì)譜分析

（1）色譜分析

色譜系統(tǒng)：Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)（UHPLC）；色譜柱：HILIC；柱溫25℃；流速0.3 mL/min。

流動(dòng)相：A相：水+25 mM乙酸銨+25 mM氨水；B相：乙腈。

梯度洗脫程序：測(cè)量樣品和QC樣品隊(duì)列隨機(jī)混合進(jìn)行分析，QC樣品用于監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性。進(jìn)樣溫度為4℃，具體步驟見(jiàn)表2。

表2 色譜條件Table 2 Chromatographic conditions

（2）Q-TOF質(zhì)譜分析：

采用電噴霧電離（ESI）正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。樣品經(jīng)UHPLC分離后用Agilent 6550質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，具體參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 質(zhì)譜條件Table 3 Mass spectrometry conditions

代謝物鑒定：樣本檢測(cè)完畢后，采取AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定，采集QC樣品的一級(jí)、二級(jí)譜圖。ESI源條件見(jiàn)表4。

表4 ESI源條件Table 4 ESI source conditions

二級(jí)質(zhì)譜分析：二級(jí)質(zhì)譜采用information dependent acquisition（IDA）的high sensitivity模式，具體條件見(jiàn)表5。

表5 二級(jí)質(zhì)譜條件Table 5 Secondary MS conditions

數(shù)據(jù)采集按質(zhì)量范圍進(jìn)行分段，每個(gè)方法每段采集4個(gè)重復(fù)。所采集獲得的數(shù)據(jù)，使用自建MetDDA和LipDDA方法，進(jìn)行代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.6 杜仲膠結(jié)構(gòu)的測(cè)定

1.2.6.1 杜仲膠的提取 采用多個(gè)株系混樣提取：本實(shí)驗(yàn)是由12個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因杜仲進(jìn)行混樣提膠，野生型同轉(zhuǎn)基因方法一致，杜仲膠采用傳統(tǒng)堿煮法提取橡膠[14]：將干燥的杜仲莖葉放入0.1%的NaOH溶液中，置于磁力攪拌器上于50℃攪拌浸煮3 h，篩洗后干燥，粉碎后過(guò)60目篩，取5 g樣品在索氏提取器中石油醚回流提取2 h，得到橡膠。

1.2.6.2 實(shí)驗(yàn)方法 紅外光譜法測(cè)定：用丙酮從樣品中提取抽提物，在室溫下用氯仿將足量的抽提后的橡膠溶解，得到濃縮溶液。在碘化鉀鹽片上滴幾滴濃縮溶液，讓溶劑揮發(fā)完全，紅外光譜儀記錄4 000～600 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜。確認(rèn)光譜圖中沒(méi)有溶劑吸收帶存在，同時(shí)譜帶沒(méi)有偏差或者吸收太弱，以野生型杜仲為對(duì)照組，轉(zhuǎn)基因杜仲為實(shí)驗(yàn)組。

2 結(jié)果分析

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

外植體采用杜仲無(wú)菌苗葉片和莖，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)下胚軸轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化杜仲，在對(duì)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化后，確定統(tǒng)一的遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因杜仲抗性芽的獲得，嫁接到杜仲無(wú)菌苗上，嫁接后的杜仲在無(wú)菌環(huán)境下25℃培養(yǎng)1個(gè)月，待嫁接接穗的再生芽有新葉長(zhǎng)出且杜仲苗生長(zhǎng)穩(wěn)定后，將穩(wěn)定的嫁接苗植株進(jìn)行煉苗處理，使其適應(yīng)外在環(huán)境，煉苗過(guò)程中應(yīng)避免葉片水分散失。煉苗3～4 d，將根部培養(yǎng)基洗凈，移栽到溫室土壤中培養(yǎng)，具體培養(yǎng)過(guò)程如圖1所示。

圖1 轉(zhuǎn)基因杜仲的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.1 Genetic transformation of Oliver with gene

杜仲苗移栽植株成活后剪取嫩葉和莖進(jìn)行-葡糖苷酶（-glucosidase,Gus）組織化學(xué)染色，初步鑒定轉(zhuǎn)基因情況（圖2 A和2 F），選取Gus染色結(jié)果為藍(lán)色的植株，提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定（圖2 G），最終獲得杜仲轉(zhuǎn)基因植株76株。

圖2 轉(zhuǎn)基因杜仲的鑒定Fig.2 The identification of Oliver with gene

2.2.1 偏最小二乘判別分析（PLS-DA）為了探究WT和轉(zhuǎn)基因株系之間的次生代謝物差異情況，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系（TP-2）和野生型杜仲進(jìn)行代謝組檢測(cè)，選擇偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares Discrimination Analysis,PLS-DA）來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測(cè)。用PLS-DA對(duì)TP組與WT組進(jìn)行模型分析，建立PLSDA模型進(jìn)行7次循環(huán)交互驗(yàn)證，PLS-DA模型評(píng)價(jià)參數(shù)結(jié)果：正離子模式參數(shù)R2X、R2Y和Q2分別為0.513、0.99和0.757；負(fù)離子模式參數(shù)R2X、R2Y和Q2分別為0.74、0.996和0.927。R2Y和Q2接近1，表明此模型穩(wěn)定可靠。得分圖結(jié)果表明，TP組與WT組分布在2個(gè)不同的區(qū)域，因此當(dāng)前建立的PLS-DA模型揭示了兩組之間存在明顯的代謝差異，見(jiàn)圖3。

圖3 樣品PLS-DA得分圖Fig.3 Sample PLS-DA score charts

2.2.2 差異代謝物的篩選 過(guò)濾掉與模型分類無(wú)關(guān)的信息，采用單維檢驗(yàn)P值與OPLS-DA模型差異貢獻(xiàn)值（VIP:Variable importance in the projection）尋找差異性表達(dá)代謝物（顯著差異代謝物：P＜0.05且VIP＞1）。對(duì)轉(zhuǎn)基因樣品（TP）和野生型樣品（WT）進(jìn)行分析，共鑒定出58種顯著性差異代謝物，TP相對(duì)于WT上調(diào)的物質(zhì)有43種，下調(diào)的物質(zhì)有15種，其中氨基酸類物質(zhì)占顯著差異代謝物總量的36.21%，且都為上調(diào)。表6為部分重要差異代謝物的鑒定結(jié)果（倍數(shù)FC：TP/WT的比值）。結(jié)果表明，差異代謝物集中分布在蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、消化吸收和嘌呤嘧啶代謝以及氨基酸代謝等生物反應(yīng)過(guò)程中。我們檢測(cè)與橡膠合成相關(guān)的差異代謝物倍半萜化合物（脫落酸）、三萜化合物（山楂酸和齊墩果酸）呈下調(diào)趨勢(shì)，而存在兩個(gè)單萜物質(zhì)（紫蘇醇和7,8-二氫--紫羅蘭酮）上調(diào)，這些萜類代謝物和橡膠有相同的合成前體物質(zhì)IPP。此外，還有兩個(gè)IPP合成前體物質(zhì)（D-赤蘚糖-4-磷酸和甲羥戊酸）含量也有所下降，見(jiàn)圖4。

表6 部分重要顯著差異代謝物的鑒定結(jié)果Table 6 Identification results of some important and significant metabolites

圖4 橡膠合成通路Fig.4 Rubber synthesis pathways

2.3 紅外光譜檢測(cè)轉(zhuǎn)基因杜仲與野生型杜仲膠的結(jié)構(gòu)

為進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)TkCPT1基因是否影響杜仲所產(chǎn)生橡膠的結(jié)構(gòu)，使用紅外光譜測(cè)定橡膠中聚異戊二烯的結(jié)構(gòu)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。不同結(jié)構(gòu)分子吸收峰的位置不同，圖5 A為野生型杜仲的紅外光譜，圖5 B為轉(zhuǎn)基因杜仲的紅外光譜，波長(zhǎng)數(shù)841 cm-1、842 cm-1為異戊二烯的反式-1,4-結(jié)構(gòu)雙鍵上碳-氫鍵變角振動(dòng)吸收峰，波長(zhǎng)數(shù)1 385cm-1為異戊二烯的反式-1，4-結(jié)構(gòu)雙鍵碳上甲基結(jié)構(gòu)的彎曲振動(dòng)吸收峰，而轉(zhuǎn)基因反式-1,4-結(jié)構(gòu)的峰附近都有一個(gè)區(qū)別于野生型的峰，波數(shù)也極 為相近，分別是1 351 cm-1和830 cm-1。

圖5 杜仲膠的紅外光譜圖Fig.5 The Infrared spectrum of Eu-rubber

3 討論

根據(jù)Canli[15]和Barbulova[16]的報(bào)道，我們選擇了農(nóng)桿菌LB4404來(lái)介導(dǎo)杜仲的遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)PCR驗(yàn)證獲得76株抗性杜仲，煉苗移栽共存活45株。

采用LC-MS/MS檢測(cè)分析轉(zhuǎn)基因杜仲與野生型杜仲代謝物差異，結(jié)果顯示，兩者之間存在58個(gè)顯著性差異代謝物，其中43個(gè)上調(diào)、15個(gè)下調(diào)。上調(diào)的顯著性差異代謝物主要為氨基酸，占總比的36.21%，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因與野生型樣品之間氨基酸組成存在顯著差異。在顯著性下調(diào)物質(zhì)中，海藻糖是一種對(duì)植物有保護(hù)作用的糖類，研究顯示海藻糖在細(xì)胞內(nèi)的積累更有助于植物體抵抗外界惡劣環(huán)境[17]，而轉(zhuǎn)基因杜仲中海藻糖下降反映出轉(zhuǎn)基因杜仲相對(duì)于野生型杜仲更難存活。代謝組檢測(cè)到與杜仲膠生物合成相關(guān)的代謝物總共有7種，其中甲羥戊酸和D-赤蘚糖-4-磷酸分別是MVA與MEP途徑中的關(guān)鍵物質(zhì)，MVA與MEP途徑是IPP合成的前體物[18,19]，IPP異構(gòu)化或聚合進(jìn)一步形成各種萜類物質(zhì)、橡膠，轉(zhuǎn)基因植株中甲羥戊酸和D-赤蘚糖-4-磷酸的下調(diào)，推測(cè)為生成IPP，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入CPT從而使消耗增加，導(dǎo)致甲羥戊酸和D-赤蘚糖-4-磷酸消耗增加。5種萜類差異物質(zhì)中兩個(gè)單萜（紫蘇醇和7,8-二氫--紫羅蘭酮）出現(xiàn)含量上升，一個(gè)半倍萜（脫落酸）、兩個(gè)三萜（山楂酸和齊墩果酸）含量下降，說(shuō)明TkCPT1對(duì)杜仲的萜類含量產(chǎn)生了影響。脫落酸是一種植物抵抗外界不良環(huán)境的調(diào)節(jié)激素，脫落酸含量的下降體現(xiàn)出植物的自我保護(hù)能力減弱。

紅外光譜檢測(cè)異戊二烯的反式-1,4-結(jié)構(gòu)特征峰位于1 385 cm-1、843 cm-1，順式-1,4-結(jié)構(gòu)特征峰位于1 376 cm-1、836 cm-1[20]（異戊二烯順式結(jié)構(gòu)與反式結(jié)構(gòu)的吸收峰十分接近），在轉(zhuǎn)基因杜仲的紅外光譜圖中我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與反式結(jié)構(gòu)十分接近的峰，與順式-1,4-結(jié)構(gòu)的波數(shù)相差25個(gè)和6個(gè)單位，推測(cè)原因?yàn)槌勘磉_(dá)TkCPT1基因使原本產(chǎn)生反式橡膠的杜仲中產(chǎn)生了順式的橡膠[21]，代謝組中IPP合成前體減少，IPP向橡膠合成的方向變化則進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果。由于橡膠與杜仲膠分子結(jié)構(gòu)式相同導(dǎo)致檢測(cè)難度大，目前還沒(méi)有明確的檢測(cè)方法，還有待進(jìn)行更深入細(xì)致地研究，采用更靈敏、分辨率更高的方法來(lái)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合轉(zhuǎn)基因植株中基因表達(dá)量的高低來(lái)推測(cè)杜仲中是否合成了順式聚異戊二烯（橡膠）。

轉(zhuǎn)基因杜仲TkCPT1基因的表達(dá)，引起了杜仲中原有的代謝物發(fā)生變化，紅外檢測(cè)轉(zhuǎn)基因杜仲植株產(chǎn)生了2個(gè)區(qū)別于野生型的特征峰，且與順式-1,4-異戊二烯特征峰距離接近，推測(cè)超量表達(dá)TkCPT1基因可能在杜仲中產(chǎn)生順式聚異戊二烯，具體還需要進(jìn)一步探索檢測(cè)方法。通過(guò)后續(xù)深入研究，繼續(xù)證實(shí)在轉(zhuǎn)基因杜仲植株產(chǎn)生順式-1,4-聚異戊二烯以及對(duì)杜仲膠顆粒大小進(jìn)行對(duì)比，對(duì)闡明杜仲的產(chǎn)膠機(jī)制具有重要意義。