陳丹，羅丹，白曦晨，向極釬，樊建元，劉衛(wèi),5※

(1.武漢百思凱瑞生物科技有限公司，湖北 武漢 430075；2.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074；3.恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 4450993；4.恩施思慧益臣生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，湖北 恩施 445099；5.華中科技大學(xué)國家納米藥物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075）

糖尿病是臨床常見的代謝性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國糖尿病患者人群中，Ⅱ型糖尿病占據(jù)糖尿病總?cè)藬?shù)的90%以上[1]。Ⅱ型糖尿病與機(jī)體氧化損傷有著密切關(guān)聯(lián)，Ⅱ型糖尿病患者機(jī)體的抗氧化水平顯著低于正常人體[2,3]。因此，提高機(jī)體抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激損傷可預(yù)防或延緩Ⅱ型糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。青錢柳[Cyclocarya paliurus(Batal)Ijinskaja]為我國特有的單種屬植物，民間多將其制成茶葉飲用，用于防御疾病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，青錢柳具有降血糖、降血脂和抗氧化等功效；另外，青錢柳葉中也含有抗氧化活性的微量元素，如有機(jī)鍺、硒[4]。硒是人體必需的重要營養(yǎng)元素，是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成部分，可以有效清除自由基[5]。黃精（Polygonatum sibirifum Red.）為百合科黃精屬植物，藥理實(shí)驗(yàn)表明，黃精具有抗病原微生物、抗疲勞、抗氧化和抗病毒等作用，對于血糖的控制也有一定作用[6]。本研究以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，遵循配伍理論與原則，在前期富硒青錢柳多糖降血糖研究工作基礎(chǔ)上[7]，將富硒青錢柳提取物和黃精提取物進(jìn)行復(fù)配制成的富硒青錢柳-黃精復(fù)方（Selenium-enriched Cyclocarya paliurus and Polygonatum sibirifum combined extract，Se-CPPS）作為受試樣品，通過建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，研究Se-CPPS的體內(nèi)降血糖和抗氧化作用，同時(shí)探究其體外抑制糖代謝相關(guān)酶和清除自由基的能力，為Se-CPPS的研究和開發(fā)提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼料

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量225～258 g，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、普通維持料及高脂飼料由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供；自制高脂高糖飼料（普通維持料52.6%、膽固醇1.2%、豬油10%、酪蛋白5%、蔗糖15%、蛋黃粉15%、膽酸鈉0.2%、Ca（HCO3）2 0.6%、石粉0.4%）。

1.2 藥物與試劑

Se-CPPS（湖北恩施思慧生物科技有限公司）；消渴丸（廣州白云山中一藥業(yè)有限公司）；阿卡波糖片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；維生素C（VC）片（浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ）[上海阿拉丁生化科技股份有限公司，溶解于0.1 mol/L（pH4.4）檸檬酸鹽緩沖液，臨用前配制]；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒，總抗氧化能力檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；魚躍血糖試紙（上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；-淀粉酶、-葡萄糖苷酶、4-硝基苯--D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）（美國Sigma公司）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司）。

1.3 主要儀器

血糖儀（上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；BS 124S分析天平（Sartorius公司）；SHJ-A6水浴恒溫磁力攪拌器（金壇市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠）；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；紫外-可見分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表公司）；多標(biāo)記分析儀（美國Perkin Elmer）。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將60只雄性SPF級的SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)，設(shè)置正常組（灌胃蒸餾水）、模型組（灌胃蒸餾水）和Se-CPPS低、中、高劑量組（給藥劑量根據(jù)人體推薦劑量換算得到，分別為0.27、0.81、2.43 g/kg），陽藥組（0.36 g/kg消渴丸）作為陽性對照組，各組大鼠均為10只。實(shí)驗(yàn)期間，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)。以蒸餾水配制各樣品，根據(jù)大鼠的體質(zhì)量，按每1 mL/100g體重進(jìn)行給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥42 d。

1.5 糖尿病大鼠模型建立

喂養(yǎng)第21天，各組均禁食不禁水過夜。模型組、陽藥組和Se-CPPS低、中、高劑量組大鼠腹腔注射1%STZ（無菌pH 4.4的檸檬酸緩沖溶液配制，劑量為45 mg/kg），正常組腹腔注射等體積的0.1 mol/L檸檬酸緩沖溶液。3 d后，測定大鼠空腹血糖，空腹血糖在11.1～33.3 mmol/L之間的大鼠選為造模成功的大鼠。造模未成功的大鼠待血糖穩(wěn)定后補(bǔ)打一次STZ，方法同上，并于3 d后再次測其空腹血糖。

1.6 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測

給藥后，每周測定大鼠的體質(zhì)量，自由攝食，自由飲水，觀察大鼠狀態(tài)。腹腔注射STZ造模后，于第3、7、14、21天，大鼠禁食不禁水過夜，尾端采血測定空腹血糖（FBG）。末次灌胃給藥后，各組大鼠禁食12 h，大鼠稱重，腹主動(dòng)脈取血后處死，3 000 r/min離心15 min取血清，測定SOD、GSH-Px和MDA指標(biāo)。解剖取大鼠肝臟、腎臟、脾臟和胸腺，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。

1.7 糖代謝相關(guān)酶活性的檢測

1.8 體外氧化指標(biāo)的檢測

1.8.1 DPPH自由基清除率測定 將0.25 mmol/L DPPH溶液2.0 mL和不同濃度的Se-CPPS乙醇溶液2.0 mL依次加入到試管中，搖勻后，避光30 min，以無水乙醇作空白對照，于517 nm波長測定吸光度值，平行測定5次。DPPH自由基清除率=（A0 As）/A0 100%，其中A0是空白對照吸光度，As為樣品吸光度。

1.8.2 OH清除率測定 將4 mmol/L硫酸亞鐵和4 mmol/L水楊酸醇溶液各取2.0 mL加入試管內(nèi)，依次加入2.0 mL不同濃度的Se-CPPS乙醇溶液搖勻，繼續(xù)加入4 mmol/L雙氧水2.0 mL，混合搖勻，于37℃水浴加熱30 min后，以純化水作空白對照，于510 nm波長測定吸光度值，計(jì)算羥基自由基清除率。羥基自由基清除率=（A0 As）/A0 100%，其中A0是空白對照吸光度，As為樣品吸光度。

1.8.3 總抗氧化能力測定 采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。將1 mL試劑1和0.1 mL不同濃度的Se-CPPS水溶液加入試管中，作為測試管，依次加入2 mL試劑2和0.5 mL試劑3應(yīng)用液，充分混勻，37℃水浴30 min，加入0.1 mL試劑4，混勻，放置10 min。另設(shè)對照管，對照管中0.1 mL Se-CPPS水溶液于水浴后加入。于520 nm波長處測定各管吸光度，計(jì)算總抗氧化能力。定義：在37℃時(shí)，每分鐘每毫升樣品使反應(yīng)體系的吸光度每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位（U），總抗氧化能力（U/mL）=（As A0）/（0.01 30），其中As為測定管吸光度，A0為對照管吸光度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以表示。先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊則進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著后采用LSD法進(jìn)行組間多重比較，P＜0.05差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠生長狀況和體質(zhì)量的變化

大鼠體質(zhì)量變化的結(jié)果見表1。大鼠糖尿病造模前，除正常組大鼠外，其他組大鼠采用高脂飼料飼養(yǎng)。飼養(yǎng)3周后，注射STZ造模前，模型組和給藥組大鼠體質(zhì)量明顯高于正常組（P＜0.01或P＜0.05）。給藥3周后，注射STZ建立大鼠Ⅱ型糖尿病模型，隨著病程進(jìn)展，造模組體質(zhì)量較正常減輕明顯，且毛發(fā)無光澤，而陽藥組大鼠癥狀隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程體質(zhì)量下降逐漸減輕，給藥42 d大鼠體質(zhì)量明顯高于模型組（P＜0.05）。在實(shí)驗(yàn)后期，模型組有3只大鼠下肢出現(xiàn)水腫，可能為糖尿病并發(fā)癥，其他給藥組大鼠未出現(xiàn)水腫癥狀。

表1 Se-CPPS對糖尿病大鼠體質(zhì)量的影響Table 1 The effect of Se-CPPS on the weight change of diabetic rats

2.2 各組大鼠空腹血糖的比較

實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠空腹血糖變化見表2。造模前，所有大鼠空腹血糖均小于6.0 mmol/L。造模組大鼠腹腔注射STZ的第3天后，空腹血糖均大于11.1 mmol/L，提示此次造模成功。STZ通過選擇性破壞動(dòng)物胰島細(xì)胞，阻斷胰島素分泌，使血糖升高，常用來建立糖尿病動(dòng)物模型[9]。造模后第3天和第7天，模型組和給藥組大鼠空腹血糖明顯高于正常組（P＜0.01）。造模后第14天和第21天，造模組大鼠空腹血糖仍明顯高于正常組（P＜0.01），但陽藥組和Se-CPPS低、中、高劑量組大鼠空腹血糖明顯低于模型組（P＜0.01）。與造模后第14天相比，造模后21 d陽藥組和Se-CPPS低、中、高劑量大鼠空腹血糖下降更明顯。綜上所述，陽性藥消渴丸對降低Ⅱ型糖尿病大鼠空腹血糖有顯著效果，而Se-CPPS各劑量組也可有效降低Ⅱ型糖尿病大鼠空腹血糖水平。

表2 Se-CPPS對糖尿病大鼠空腹血糖的影響Table 2 The effect of Se-CPPS on the FBG in diabetic rats

2.3 各組大鼠血清抗氧化指標(biāo)的比較

高糖環(huán)境使機(jī)體內(nèi)多種抗氧化酶活性減弱，發(fā)生氧化應(yīng)激而導(dǎo)致臟器細(xì)胞凋亡及組織病理損傷。Se-CPPS對Ⅱ型糖尿病大鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響，見表3。結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中SOD的活性和GSHPx的活性較正常組顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，各給藥組SOD的活性和GSH-Px的活性明顯升高（P＜0.01），Se-CPPS不同劑量組之間沒有明顯差異。Ⅱ型糖尿病大鼠血清中的丙二醛（MDA）水平較正常組升高（P＜0.01），給藥組血清中的MDA水平較模型組降低，其中陽藥組有顯著差異（P＜0.05），Se-CPPS低、中、高劑量組與模型組差異極顯著（P＜0.01）。綜上所述，Se-CPPS可提高血液中SOD和GSH-Px的活性，顯著降低血液中脂質(zhì)過氧化物MDA的水平，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。

表3 Se-CPPS對糖尿病大鼠血清中SOD、GSH-Px、MDA的影響Table 3 The effect of Se-CPPS combined extract on the SOD,GSH-Px and MDA in serum of diabetic rats

2.4 各組大鼠臟器指數(shù)的比較

臟器指數(shù)可用來衡量和反映動(dòng)物的功能狀態(tài)[10]。Se-CPPS對Ⅱ型糖尿病大鼠臟器指數(shù)的影響見表4。結(jié)果顯示，與正常組相比，Ⅱ型糖尿病大鼠肝臟指數(shù)明顯上升（P＜0.01），各給藥組之間肝臟指數(shù)沒有明顯差異。正常組大鼠和糖尿病大鼠腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)沒有明顯差異。模型組大鼠胸腺指數(shù)較正常組下降（P＜0.05），Se-CPPS低劑量組大鼠胸腺指數(shù)較模型組明顯增高（P＜0.05），提示Se-CPPS可改善糖尿病大鼠的免疫功能。

表4 Se-CPPS對糖尿病大鼠臟器指數(shù)的影響Table 4 The effect of Se-CPPS on the organ index of diabetic rats

2.5 糖代謝相關(guān)酶活性的檢測

表5 Se-CPPS對-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制作用及其量效關(guān)系數(shù)學(xué)模型Table 5 Inhibitory activities agains-amylase and-glucosidase and mathematical model of dose-effect relationship of Se-CPPS

圖1 Se-CPPS對-淀粉酶的抑制作用Fig.1 The inhibitory activity of Se-CPPS against-amylase

圖2 Se-CPPS對-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.2 The inhibitory activity of Se-CPPS against-glucosidasel

2.6 體外抗氧化作用的結(jié)果

Se-CPPS和VC清除DPPH自由基和OH的擬合方程、相關(guān)系數(shù)和IC50值，見表6。

表6 Se-CPPS的抗氧化作用及其量效關(guān)系數(shù)學(xué)模型Table 6 The antioxidant activity and the mathematical model of dose-effect relationship of Se-CPPS

2.6.1 對DPPH自由基清除率的影響 由圖3可見，Se-CPPS顯示出一定的DPPH自由基清除能力，并且其清除活性具有劑量依賴性。當(dāng)提取物濃度為0.2mg/mL時(shí)，Se-CPPS的DPPH自由基清除率可達(dá)到99.39%，表現(xiàn)出良好的DPPH自由基清除能力。由表6可知，Se-CPPS和VC的IC50分別為0.075 4和0.000 9 mg/mL。

圖3 Se-CPPS的DPPH自由基清除能力Fig.3 The DPPH radical-scavenging activity of Se-CPPS

2.6.2 對OH自由基清除率的影響 由圖4可見，Se-CPPS具有清除OH的能力。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著Se-CPPS濃度的增大，OH清除率逐漸升高。當(dāng)提取物濃度為10 mg/mL時(shí)，Se-CPPS的OH清除率可達(dá)到85.89%，表現(xiàn)出良好的OH清除能力。由表6可知，Se-CPPS和VC的IC50分別為5.274 6和0.041 6 mg/mL。

圖4 Se-CPPS的OH清除能力Fig.4 The OH radical-scavenging activity of Se-CPPS

2.6.3 對總抗氧化能力的影響 總抗氧化能力是評價(jià)抗氧化劑能力的綜合性指標(biāo)，可反應(yīng)出生物體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的抗氧化能力，在總體上反映機(jī)體防御體系抗氧化能力的強(qiáng)弱[11]。當(dāng)Se-CPPS的濃度為0.1、1.0和10.0 mg/mL時(shí)，總抗氧化能力分別為9.62、22.69和57.23 U/mL。

3 討論

糖尿病是由于人體內(nèi)缺乏胰島素所引起的以血糖升高為主要特征的慢性代謝性疾病，并可伴有蛋白質(zhì)、脂肪、水及電解質(zhì)的代謝紊亂[12]。糖尿病與人體內(nèi)硒元素的缺乏具有一定的關(guān)系，適量補(bǔ)硒對于糖尿病的預(yù)防與治療具有重要意義，本課題前期研究結(jié)果表明，富硒青錢柳具有較好的降血糖效果[13]。本研究選取高脂高糖飼料加低劑量STZ腹腔注射的方法構(gòu)建Ⅱ型糖尿病模型大鼠，初步考察Se-CPPS對Ⅱ型糖尿病大鼠降血糖作用。陽性藥選取消渴丸作為供試藥，該藥對降低Ⅱ型糖尿病大鼠空腹血糖有顯著效果，而Se-CPPS各劑量組也可有效降低Ⅱ型糖尿病大鼠空腹血糖水平。糖尿病導(dǎo)致機(jī)體血糖利用不足，脂肪過多消耗，體重下降，Se-CPPS對糖尿病引起的體重下降有一定的改善作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，Se-CPPS降血糖的機(jī)制可能與抑制-淀粉酶和-葡萄糖苷酶作用相關(guān)。另外，模型組大鼠出現(xiàn)下肢水腫癥狀，而陽藥組和Se-CPPS組大鼠未發(fā)生此并發(fā)癥，說明Se-CPPS可降低糖尿病的血糖水平，同時(shí)減少并發(fā)癥的發(fā)生。

糖尿病的發(fā)生也與體內(nèi)過量活性氧物質(zhì)有關(guān)，氧化應(yīng)激是Ⅱ型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素[14]。高血糖引起氧化應(yīng)激，體內(nèi)過量的活性氧物質(zhì)破壞胰島細(xì)胞，加重胰島素抵抗，降低體內(nèi)胰島素水平，使血糖升高，形成惡性循環(huán)，同時(shí)累及其他臟器，如肝臟、腎臟等[15]。糖尿病模型組血清中SOD、GSH-Px的活性下降，MDA的含量上升。Se-CPPS可有效提高Ⅱ型糖尿病大鼠血清中SOD、GSH-Px的活性，清除血清中MDA的水平堆積，從而有效提高糖尿病動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激程度。體外抗氧化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Se-CPPS濃度越大，自由基的清除率愈高，提示Se-CPPS的體、內(nèi)外作用具有一定關(guān)聯(lián)性。臟器指數(shù)能衡量疾病和藥物對臟器功能的影響，本研究中糖尿病模型組大鼠肝臟指數(shù)增加，胸腺指數(shù)下降。胸腺和脾臟作為中樞及外周免疫器官，其質(zhì)量變化反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞免疫功能[16]。糖尿病大鼠經(jīng)Se-CPPS給藥后，胸腺指數(shù)有上升趨勢，且低劑量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Se-CPPS可預(yù)防與改善高血糖導(dǎo)致的機(jī)體氧化應(yīng)激，對于緩解糖尿病臟器損傷具有重要意義。

本研究以我國特有植物青錢柳為原材料，采用葉面噴施有機(jī)硒肥的方式使青錢柳富集硒元素[5]。從富硒青錢柳葉中提取分離獲得富硒青錢柳多糖，可降低糖尿病小鼠餐后血糖，增強(qiáng)糖尿病小鼠SOD和GSHPx的活性[7,13]。此外，黃精多糖可降低糖尿病小鼠血糖，糾正血清和肝臟中T-SOD和GSH-Px的活性以及MDA的含量異常變化，幫助恢復(fù)機(jī)體正常的抗氧化能力[17]。本研究在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，按照配伍的原則，將富硒青錢柳提取物和黃精提取物進(jìn)行科學(xué)復(fù)配，得到的Se-CPPS可有效降低Ⅱ型糖尿病大鼠血糖，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減輕活性氧對臟器的損傷，提高免疫器官的臟器指數(shù)。體外研究證明，Se-CPPS可抑制糖代謝相關(guān)酶-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的活性，且有效清除DPPH自由基和OH?？傊?，Se-CPPS降血糖和抗氧化作用顯著，是具有開發(fā)潛力和研究價(jià)值的保健食品新原料。