焦瑞寶，唐吉斌，周佳麗，朱娟娟，陳繼中

（皖南醫(yī)學(xué)院附屬銅陵市人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，安徽 銅陵 244000）

心腦血管疾病具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，腦血管疾病已經(jīng)超越心血管疾病、惡性腫瘤，成為我國(guó)居民首位致死原因，在我國(guó)，腦卒中的發(fā)病率為1 114.8/10萬(wàn)，其中缺血性腦卒中（又稱腦梗死）占69.6%[1]。目前，由于不良生活習(xí)慣（抽煙、酗酒、低運(yùn)動(dòng)量、高糖和高脂飲食）的廣泛存在，我國(guó)心腦血管疾病高發(fā)狀況仍沒(méi)有緩解的跡象，并有低齡化的趨勢(shì)。血小板異常聚集可導(dǎo)致動(dòng)脈血栓形成，而血栓形成是心腦血管疾病的主要病理生理學(xué)誘因。阿司匹林具有最充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)、最佳的經(jīng)濟(jì)效益比、最廣泛的適應(yīng)癥，被世界各國(guó)醫(yī)學(xué)指南一致推薦為抗血小板治療的一線藥物，在我國(guó)已被廣泛應(yīng)用于血栓性疾病、心血管疾病的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防。但是，相關(guān)臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，有5%～45%的患者對(duì)阿司匹林治療不敏感，即存在阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）[2]。目前，AR的確切機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，部分基因位點(diǎn)多態(tài)性與AR有關(guān)[3]。2019年底，我國(guó)糖尿病患者已經(jīng)達(dá)到1.16億例，長(zhǎng)期、反復(fù)高血糖很容易誘發(fā)心腦血管疾病，甚至出現(xiàn)糖尿病性腦猝死或腦血管意外。本研究擬探討阿司匹林藥效相關(guān)血小板膜糖蛋白GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)在心腦血管疾病和糖尿病患者中的多態(tài)性分布，為臨床抗血小板個(gè)體化治療提供遺傳學(xué)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年9月—2020年10月銅陵市人民醫(yī)院行阿司匹林藥效相關(guān)血小板膜糖蛋白GPⅠa基因G873A和C807T位點(diǎn)檢測(cè)的住院患者811例，其中心血管疾病患者106例（心血管疾病組），男71例、女35例，年齡（71.65±11.03）歲，包括冠心病、心肌梗死、高血壓病、心功能不全等；腦血管疾病患者597例（腦血管疾病組），男359例、女238例，年齡（63.12±12.03）歲，包括腦梗死、腦卒中、椎基底動(dòng)脈綜合征、短暫性腦缺血發(fā)作等；糖尿病患者108例（糖尿病組），男70例、女38例，年齡（64.12±10.43）歲，包括2型糖尿病、2型糖尿病性周圍神經(jīng)病等。

1.2 主要儀器和試劑

ETC811基因擴(kuò)增儀（蘇州東勝公司），PyroMark Q24 MDx實(shí)時(shí)定量焦磷酸序列分析儀、MX-M型混勻儀（德國(guó)凱捷公司），D3024型高速離心機(jī)、MX-S型漩渦震蕩器（美國(guó)賽洛捷克公司），脫氧核糖核苷三磷酸（日本TakaRa公司），DNA提取試劑盒、測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒（長(zhǎng)沙三濟(jì)公司）。

1.3 方法

采集所有研究對(duì)象靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鈉抗凝，采用硅膠柱提取、純化基因組DNA。將提取的DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性25 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。采用PyroMark Q24 MDx實(shí)時(shí)定量焦磷酸序列分析儀測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)的基因多態(tài)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素ANOVA方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)量資料以例（率）表示，組間基因型及等位基因分布狀況比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3個(gè)組一般特征比較

3個(gè)組之間性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；心血管疾病組、腦血管疾病組、糖尿病組年齡依次升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3個(gè)組一般特征比較

2.2 3個(gè)組GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)分布

GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)的野生型、雜合突變型和純合突變型均同步出現(xiàn)，3個(gè)基因型在3個(gè)組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。糖尿病組純合突變型高于心血管疾病組和腦血管疾病組（P＜0.01），雜合突變型低于心血管疾病組和腦血管疾病組（P＜0.01）。心血管疾病組、腦血管疾病組和糖尿組之間等位基因A、T分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。GPⅠa基因G873A、C807T雜合突變型和純合突變型合計(jì)為47.17%～53.27%，等位基因A和T均為24.53%～31.48%。見(jiàn)表2。

表2 3個(gè)組GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)基因多態(tài)性分布 例（%）

2.3 3個(gè)組不同性別患者GPⅠa基因G873A、C807T基因型及等位基因分布

心血管疾病組男性與女性之間GPⅠa基因G873A、C807T位點(diǎn)基因型和等位基因分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.734、P=0.737）；腦血管疾病組男性與女性基因型和等位基因分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.927、P=0.749）；糖尿病組男性與女性基因型和等位基因分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.138、P=0.283）。見(jiàn)表3、表4和表5。

表3 不同性別心血管疾病患者基因型和等位基因分布比較 例（%）

表4 不同性別腦血管疾病患者基因型和等位基因分布比較 例（%）

2.4 3個(gè)組不同年齡患者基因型、等位基因分布比較

按照年齡將811例患者分為29～60歲組（228例）、61～70歲組（197例）、71～80歲組（273例）、81～94歲組（113例）4個(gè)年齡亞組，4個(gè)年齡組患者基因型、等位基因分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.530、P=0.941）。見(jiàn)表6。

表6 3個(gè)組不同年齡患者基因型和等位基因分布比較 例（%）

3 討論

血栓形成是心腦血管疾病的主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，當(dāng)血管內(nèi)皮受損時(shí)，機(jī)體通常會(huì)啟動(dòng)血小板激活和聚集機(jī)制。首先，血小板內(nèi)皮膠原蛋白被激活，血液流速變慢，血小板表面的GPⅠa與血管性血友病因子（vascular von Willebrand factor，VWF）結(jié)合，血小板上的膠原蛋白受體活化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，促進(jìn)血小板的變形和脫顆粒，而后血小板釋放花生四烯酸（arachidonic acid，AA），環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）-1催化AA使其形成血栓素A2（thromboxane，TXA2）。阿司匹林可直接且不可逆地抑制COX-1和COX-2，抑制血小板合成TXA2[4]，TXA2具有強(qiáng)大的促血小板聚集作用，其生成減少最終會(huì)導(dǎo)致血小板聚集功能受到抑制。同時(shí)，阿司匹林還可以抑制低濃度膠原、凝血酶、抗原抗體復(fù)合物等引起的血小板聚集和釋放反應(yīng)及自發(fā)性凝集，發(fā)揮預(yù)防血栓形成的作用[5]。

阿司匹林是具有高危因素抗血小板指征心腦血管疾病患者長(zhǎng)期使用的一級(jí)預(yù)防用藥。5%～45%的患者對(duì)阿司匹林治療呈非敏感反應(yīng)，即存在AR。AR可以從以下2個(gè)方面定義：（1）臨床抵抗，即患者在規(guī)律服用治療劑量的阿司匹林后出現(xiàn)新的血管事件；（2）實(shí)驗(yàn)室抵抗，即通過(guò)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定發(fā)現(xiàn)阿司匹林并未有效抑制血小板聚集[6]。目前，臨床應(yīng)用最為廣泛的是用10 μmol/L的二磷酸腺苷作為誘導(dǎo)劑，其平均血小板聚集率≥70%；或者用0.5 mg/mL AA作為誘導(dǎo)劑，其平均血小板聚集率≥20%[7]。引起AR的常見(jiàn)因素有藥物依從性差、藥物吸收和代謝、藥物間相關(guān)作用、血小板聚集通路激活、環(huán)境或生活方式、藥物治療人群的選擇和基因多態(tài)性等，其中基因多態(tài)性被臨床及科研工作者廣泛關(guān)注[8]。孫洲亮等[9]分析了35例AR患者基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)GPⅠa基因C807T雜合突變型（32例，91.43%）、G873A雜合突變型（31例，88.57%）明顯高于對(duì)應(yīng)的野生型。王林等[7]也發(fā)現(xiàn)GPⅠa基因C807T在阿司匹林抵抗組、半抵抗組的T等位基因頻率高于阿司匹林敏感組。

本研究中，糖尿病組阿司匹林藥效相關(guān)GPⅠa基因G873A和 C807T位點(diǎn)的純合突變型高于心血管疾病組和腦血管疾病組（P＜0.01），雜合突變型低于心血管疾病組和腦血管疾病組（P＜0.01）；3個(gè)組基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但等位基因分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。有研究結(jié)果顯示，糖尿病患者長(zhǎng)期、反復(fù)高血糖會(huì)引起小血管和毛細(xì)血管損傷，伴發(fā)高血脂等可引起大血管動(dòng)脈粥樣硬化性改變、血管內(nèi)膜及內(nèi)膜下受損動(dòng)脈壁病變[10]，我國(guó)有75%的糖尿病患者最終死于心、腦血管疾病[11]，提示對(duì)糖尿病患者和心、腦血管疾病患者發(fā)生AR概率更大，及早進(jìn)行抗血小板治療非常重要。

本研究中，患者年齡比較，心血管疾病組＞腦血管疾病組＞糖尿病組，可能是由3種疾病自身發(fā)病機(jī)制所決定的。進(jìn)一步按照性別對(duì)3個(gè)組進(jìn)行組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，3個(gè)組組內(nèi)男性、女性患者基因型和等位基因分布差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同年齡患者基因型多態(tài)性分布和等位基因分布比較，差異也均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本研究還發(fā)現(xiàn)，GPⅠa基因G873A和C807T位點(diǎn)野生型、雜合突變型和純合突變型均同步出現(xiàn)在1個(gè)病例上，雜合突變型（GA或CT）、純合突變型（AA或TT）合計(jì)為47.17%～53.27%，等位基因A和T均為24.53%～31.48%，提示基因位點(diǎn)突變?cè)谌巳褐惺欠浅Ｆ毡榈默F(xiàn)象，這種基因位點(diǎn)的突變可能會(huì)導(dǎo)致臨床阿司匹林藥效發(fā)生變化。目前，評(píng)價(jià)阿司匹林藥效相關(guān)檢測(cè)包括實(shí)驗(yàn)室抵抗、臨床抵抗和基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)，而基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)與實(shí)驗(yàn)室抵抗、臨床抵抗是不同層面上的檢測(cè)，基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)是在遺傳學(xué)基礎(chǔ)上進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)室抵抗是通過(guò)體外模擬凝血激活途徑評(píng)價(jià)血小板聚集率，臨床抵抗是發(fā)生新的血管事件，三者之間存在相關(guān)性，但是又不等同，前兩者的檢測(cè)都是為了避免出現(xiàn)臨床抵抗的嚴(yán)重現(xiàn)象。

綜上所述，阿司匹林藥效相關(guān)基因GPⅠaG873A、C807T位點(diǎn)在人群中存在的突變現(xiàn)象較為常見(jiàn)，突變存在個(gè)體差異。另外，糖尿病患者純合突變型發(fā)病率高于心血管疾病患者和腦血管疾病患者，基因多態(tài)性分布和等位基因分布與患者性別、年齡無(wú)關(guān)。2個(gè)基因位點(diǎn)純合突變型、雜合突變型可能會(huì)影響臨床阿司匹林抗血小板治療效果，需密切關(guān)注，必要時(shí)建議更換抗血小板治療藥物。