顧玉微，王成云，顧 萍，潘秋輝，王 靜，陳廣潔

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心輸血科，上海 200127；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025）

ABO血型系統(tǒng)在輸血醫(yī)學(xué)、移植學(xué)和法醫(yī)學(xué)中有著極其重要的作用，是目前最具臨床意義的血型系統(tǒng)[1]。人類ABO血型基因位于9q34.1-34.2，含7個外顯子和6個內(nèi)含子，編碼區(qū)長1 062 bp，基因上游5'非編碼區(qū)存在1個總長度為18～20 kb的調(diào)控區(qū)[2-3]。ABO基因外顯子和內(nèi)含子的突變、插入或缺失，以及受不同mRNA轉(zhuǎn)錄剪接模式的影響，調(diào)控區(qū)出現(xiàn)等位基因重組、片段缺失、甲基化/去甲基化或CpG島形成等，均可導(dǎo)致ABO抗原表達(dá)的弱化。本研究對1例ABO血清學(xué)鑒定困難的患兒進(jìn)行基因序列測定和序列分析，查找抗原弱表達(dá)的原因。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取上海兒童醫(yī)學(xué)中心心胸外科收治的二尖瓣返流患兒1例，女，12歲，術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)血型鑒定正反定型不符。

1.2 儀器和試劑

WADiana/8XT全自動血型系統(tǒng)（西班牙Diagnostic Grifols S.A公司）及配套ABO-Rh血型確認(rèn)卡（DG Gel Confirm卡）、中性卡（DG Gel Neutral卡）、抗球蛋白卡（DG Gel Coombs卡）。ABO反定型細(xì)胞、抗H抗體、篩選細(xì)胞均購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司。DNA純化試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑（日本Takara公司），C1000 Touch Thermal Cycle PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集本例患兒的靜脈血，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，抽提DNA，置于-20 ℃保存。

1.3.2 血清學(xué)試驗(yàn) 采用微柱凝膠法進(jìn)行ABO血型鑒定、直接和間接抗球蛋白試驗(yàn)、抗體篩查試驗(yàn)。

1.3.3 基因分型試驗(yàn) 抽提患兒全血樣本中的基因組DNA，采用PCR擴(kuò)增ABO基因增強(qiáng)子、啟動子、第1～7號外顯子及其相鄰的內(nèi)含子區(qū)域序列。參照美國國立生物信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）GenBank（https：//www. ncbi. nlm. nih.gov / gene /? term=ABO）中ABO基因序列設(shè)計(jì)引物，見表1。擴(kuò)增體系為Taq DNA聚合酶（5 U/μL）12.5 μL、引物（10 mmol/μL）各1 μL、待測DNA 1 μL、ddH2O 9.5 μL，總反應(yīng)體系25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、64 ℃退火30 s、72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物由上海華大基因公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果與血型基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，以標(biāo)準(zhǔn)序列（A101）判斷患兒的血型基因型。

表1 ABO血型基因分型擴(kuò)增及測序引物序列

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)結(jié)果

ABO血型鑒定和抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果顯示：患兒血型表型為Aweak型，其父為A型，其母為B型。見表2。

表2 血清學(xué)血型鑒定和抗球蛋白試驗(yàn)結(jié)果

2.2 ABO血型基因分型結(jié)果

擴(kuò)增患兒及其父母ABO基因第1～7號外顯子、增強(qiáng)子和啟動子區(qū)，將測序結(jié)果與A101等位基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，對照ABO血型基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)患兒3號外顯子存在106G＞T變異，4號外顯子存在188G＞A、189C＞T變異，6號外顯子存在261delG缺失和297A＞G變異，其余外顯子未見異常，A等位基因增強(qiáng)子CBF/NF-Y微衛(wèi)星區(qū)存在4個43 bp串聯(lián)?；純焊赣H6號外顯子存在261delG缺失，7號外顯子存在467C＞T變異，其余外顯子、增強(qiáng)子和啟動子區(qū)未見異常，通過與血型基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定其基因型為A102/O01?；純耗赣H3號外顯子存在106G＞T變異，4號外顯子存在188G＞A、189C＞T變異，5號外顯子存在220C＞T變異，6號外顯子存在261delG缺失和297A＞G變異，7號外顯子存在526C＞G、646T＞A、657C＞T681G＞A、703G＞A、771C＞T、796C＞A、803G＞C、829G＞A、930G＞A和1096G＞A變異，其余外顯子、增強(qiáng)子和啟動子區(qū)未見異常，通過與血型基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定其基因型為B101/O02。見表3、圖1和圖2。

表3 血型基因分型結(jié)果

圖1 本例患兒第1～7號外顯子基因測序結(jié)果

圖2 患兒增強(qiáng)子區(qū)測序結(jié)果

3 討論

人類紅細(xì)胞ABO血型是目前最具臨床意義的血型系統(tǒng)，血型血清學(xué)技術(shù)雖然相對較完善和標(biāo)準(zhǔn)化，但只能鑒定表型，在鑒定某些異常表達(dá)的個體和分析遺傳學(xué)規(guī)律時受到限制，疑難標(biāo)本不易準(zhǔn)確鑒定血型。當(dāng)正反定型不能產(chǎn)生ABO抗原與抗體的互補(bǔ)結(jié)果時，排除技術(shù)上可能發(fā)生的錯誤后，還需要考慮細(xì)胞抗原表位的變異情況，可采用基因分型技術(shù)對這些ABO疑難血型標(biāo)本進(jìn)行基因測序，明確血型基因型，分析抗原變異的原因。

有研究結(jié)果表明，ABO血型基因型和表型直接相關(guān)[4-6]，大多數(shù)遺傳變異表現(xiàn)為1個或多個單核苷酸突變，這些變化在基因水平上可以分布在ABO基因的整個編碼區(qū)，其中E6、E7尤為多見，導(dǎo)致編碼的氨基酸改變，從而使A抗原或B抗原的表達(dá)減弱，甚至完全不表達(dá)。然而，有一部分抗原變異的患者在ABO基因外顯子區(qū)域并未找到可能的變異位點(diǎn)，進(jìn)一步對ABO基因調(diào)控區(qū)增強(qiáng)子、啟動子及其相鄰的內(nèi)含子區(qū)域序列的研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控區(qū)序列對ABO血型抗原的表達(dá)亦存在影響[7-8]。

ABO基因的轉(zhuǎn)錄受調(diào)控區(qū)影響，其中包括引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄開始信息的啟動子區(qū)域及位于ABO基因上游約3.8 kb的增強(qiáng)子區(qū)域[7]。這段增強(qiáng)子區(qū)域包含了1個由43 bp的重復(fù)片段組成的微衛(wèi)星序列，這個片段與調(diào)控ABO的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)[8]。常見的ABO等位基因有著不同數(shù)量的43 bp重復(fù)片段，呈現(xiàn)多態(tài)性。A1基因只有1個43 bp的重復(fù)序列，即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCATT-3'，這個重復(fù)序列的第nt41位為A；B基因和部分O01等位基因在此區(qū)域?yàn)?個43 bp長度的重復(fù)序列，各序列第nt41位均為G，即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCGTT-3'；大部分的O01和O02等位基因在此區(qū)域也為4個43 bp長度的重復(fù)序列，但不同的是，其第1個重復(fù)序列的第nt41位為C，即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCCTT-3'；另外3個重復(fù)序列的第nt41位均為G，即5'-ACCCCAGCCAATAGGGGAAGGACACAGAAACAGAAACTGCGTT-3'[9]。

本例患兒血清學(xué)血型鑒定結(jié)果為Aweak，外顯子編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)，而位于調(diào)控區(qū)的增強(qiáng)子區(qū)域存在異常變化。家系調(diào)查結(jié)果顯示，患兒父親基因型為A102/O01，母親基因型為B101/O02，分析發(fā)現(xiàn)本例患兒父親的A102和O01基因在第7號外顯子處發(fā)生了交換，使患兒A等位基因和O等位基因都發(fā)生了變化，從而產(chǎn)生了新的序列。同時基因重組還導(dǎo)致了調(diào)控區(qū)增強(qiáng)子微衛(wèi)星區(qū)域發(fā)生改變。本例患兒外顯子編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)各亞型的特異變異位點(diǎn)，也未發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)，因此其抗原變異并不是由ABO編碼區(qū)外顯子變異導(dǎo)致的，而是由調(diào)控區(qū)增強(qiáng)子微衛(wèi)星區(qū)域發(fā)生改變導(dǎo)致的。

ABO基因增強(qiáng)子測序結(jié)果顯示，本例患兒A等位基因增強(qiáng)子CBF/NF-Y微衛(wèi)星區(qū)為4個43 bp的重復(fù)串聯(lián)序列，其第1個串聯(lián)序列的第nt41位為C，另外3個串聯(lián)序列的第nt41位均為G。而正常A等位基因增強(qiáng)子CBF/NF-Y微衛(wèi)星區(qū)只有1個43 bp的串聯(lián)，其第nt41位為A。有研究認(rèn)為，ABO基因的轉(zhuǎn)錄受CCAAT結(jié)合因子CBF/NF-Y微衛(wèi)星序列的影響[10-11]。不同串聯(lián)拷貝數(shù)呈現(xiàn)不同的特點(diǎn)，A抗原的正常表達(dá)有賴于完整的1個43 bp串聯(lián)CBF/NF-Y微衛(wèi)星序列，而B抗原的正常表達(dá)有賴于完整的4個43 bp串聯(lián)CBF/NF-Y微衛(wèi)星序列[12]。本例患兒正是由于基因重組導(dǎo)致A等位基因增強(qiáng)子特征消失，出現(xiàn)類似O等位基因的特征，從而表現(xiàn)為A抗原弱化。THURESSON等[13]也報(bào)道過與本例患兒相似的病例，是由基因重組導(dǎo)致的增強(qiáng)子改變。另外，還有各種增強(qiáng)子微衛(wèi)星序列不同串聯(lián)拷貝數(shù)引起血型弱表達(dá)的報(bào)道[8，14]。目前，對于微衛(wèi)星序列串聯(lián)拷貝數(shù)與基因轉(zhuǎn)錄活性的研究不多，但可以肯定的是，CBF/NF-Y微衛(wèi)星序列與ABO抗原表達(dá)間確實(shí)有相關(guān)性，但其真正的作用機(jī)制目前尚不明確。由此可見，本例患兒的A抗原弱表達(dá)現(xiàn)象很有可能是由于其增強(qiáng)子區(qū)CBF/NF-Y微衛(wèi)星序列發(fā)生重組引起串聯(lián)拷貝數(shù)異常所致。

ABO抗原弱表達(dá)是目前輸血研究的熱點(diǎn)，調(diào)控區(qū)變異引起抗原弱化的現(xiàn)象已逐漸被人們所認(rèn)識，本研究可為今后抗原弱化機(jī)制的研究提供一定幫助。