黃百祺，沈丹妮，王如意，李雙林，林煥怡，李詠梅

（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣東 廣州 510430；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，廣東 廣州 510520）

大高良姜為姜科山姜屬植物紅豆蔻Alpinia galanga（L.）Wild.的根莖，具有散寒、暖胃、行氣止痛等功效［1]。研究表明，大高良姜含有揮發(fā)油類、二苯庚烷類、黃酮類、糖苷類等成分，具有菌、抗?jié)?、抗腫瘤、抗氧化和降血糖等藥理作用［2]。在我國(guó)粵東和東南亞地區(qū)，大高良姜亦常被用作調(diào)味料、香辛料、涼果保鮮劑等［3]，具有較高的藥用和食用價(jià)值。

頂空固相微萃?。℉S-SPME）是一種分析揮發(fā)性物質(zhì)的前處理技術(shù)，集取樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體［4]，廣泛應(yīng)用于食品、藥物、紡織品和環(huán)境污染的揮發(fā)性物質(zhì)分析［4-6]。近年來(lái)，已有學(xué)者采用HS-SPME 技術(shù)對(duì)山姜［7]、艷山姜［8]、高良姜［9]等山姜屬植物的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，但研究者往往采用單一類型涂層的萃取頭進(jìn)行檢測(cè)，缺乏不同萃取頭萃取效果的綜合對(duì)比和分析。HS-SPME 技術(shù)的核心在于萃取頭的涂層，不同類型涂層的萃取頭對(duì)同一揮發(fā)性成分的選擇性和靈敏度有較大差異［10]，故選擇合適的萃取頭是有效分析樣品揮發(fā)性關(guān)鍵物質(zhì)的前提。本實(shí)驗(yàn)利用HS-SPME-GC-MS法，比較7 μm PMDS、30 μm PMDS、100 μm PMDS、85 μm PA、65 μm PDMS/DVB、85 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 這7 種不同萃取頭對(duì)大高良姜揮發(fā)性成分分析結(jié)果的差異，通過主成分分析進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，從中選擇出最佳的萃取頭，以期為進(jìn)一步研究大高良姜乃至其他姜科植物的揮發(fā)性成分提供參考。

1 材料

QP2010 型氣相色譜-質(zhì)譜儀（日本Shimadzu 公司）；DK3001N 型頂空進(jìn)樣器（北京中興匯利公司）；ME204E 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；固相微萃取手柄、SPME 萃取頭（美國(guó)Supelco 公司）。C8～C20正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度均為40 mg/L，美國(guó)Sigma 公司）。大高良姜采自廣東省惠來(lái)縣，經(jīng)廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院吳巨賢副研究員鑒定為山姜屬植物紅豆蔻Alpinia galanga（L.）Wild.的根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 材料預(yù)處理 大高良姜采集后自然陰干，粉碎至粗粉，過2 號(hào)藥篩，備用。

2.2 HS-SPME-GC-MS 分析

2.2.1 HS-SPME 法 參考文獻(xiàn)［11-13] 方法并略作調(diào)整。稱取大高良姜粉末0.5 g，置于10 mL 頂空瓶中，80 ℃平衡30 min，將固相微萃取手柄插入樣品瓶中，推出萃取頭（各型號(hào)萃取頭使用前按產(chǎn)品說明書進(jìn)行老化），頂空萃取60 min，取出后立即插入GC-MS 儀進(jìn)樣口，解吸5 min。

2.2.2 GC-MS 條件

2.2.2.1 GC Restek Rxi-5 Sil MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫采用程序升溫，50 ℃保持3 min，以2 ℃/min 升到120 ℃，以3 ℃/min升 到150 ℃，保 持3 min，以10 ℃/min 升 到250 ℃，保持2 min，總時(shí)間63 min；載氣高純度氦氣（純度≥99.999%）；體積流量1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時(shí)間3 min。

2.2.2.2 MS 離子源電子轟擊源（EI），電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 45～450；掃描方式全掃描。

2.3 不同萃取頭總離子流圖分析 由圖1A～1C 可以看出，對(duì)于同一類型涂層的萃取頭，涂層厚度對(duì)萃取效果有較大的影響，30、100 μm PDMS 萃取頭的離子流豐度明顯大于7 μm PDMS 萃取頭，這可能是由于涂層厚度增加，提高了萃取量。萃取量的增加使檢測(cè)信號(hào)增大，有利于揮發(fā)性成分的分析鑒定，故在選取萃取頭時(shí)，適宜的涂層厚度有助于提升檢測(cè)效果。采用極性涂層的85 μm PA 萃取頭離子流豐度（圖1D）總體上較小，推測(cè)可能是由于大高良姜含有較多的萜烯類化合物等非極性揮發(fā)性成分［2]，極性涂層對(duì)其萃取效果較差。圖1E～1G 顯示，3 種采用復(fù)合涂層的萃取頭在離子流豐度和峰形上均比單一類型涂層萃取頭更好，這可能是由于復(fù)合涂層萃取頭兼具了不同類型涂層的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分均有吸附。綜上所述，選取100 μm PDMS、85 μm PA、65 μm PDMS/DVB、85 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 這5 種萃取頭進(jìn)行后續(xù)成分分析。

標(biāo)準(zhǔn)申請(qǐng)用戶可通過標(biāo)準(zhǔn)申請(qǐng)頁(yè)面的提示提交標(biāo)準(zhǔn)申請(qǐng)信息。本平臺(tái)是按標(biāo)準(zhǔn)階段分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)信息進(jìn)行錄入，標(biāo)準(zhǔn)管理員按標(biāo)準(zhǔn)階段對(duì)信息進(jìn)行審核，同時(shí)反饋審核結(jié)果。通過標(biāo)準(zhǔn)的年份、省份、標(biāo)準(zhǔn)階段等屬性，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)更高層次的組合，以滿足不同層次人員的查詢，提高查詢效率。

圖1 不同萃取頭萃取大高良姜揮發(fā)性成分的總離子流圖

2.4 不同萃取頭揮發(fā)性成分組分分析 所得GC-MS 譜圖數(shù)據(jù)利用NIST 17 質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行檢索、定性分析，同時(shí)將實(shí)測(cè)保留指數(shù)（retention index，RI）與NIST Chemistry WebBook數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)［14] 進(jìn)行對(duì)比，以質(zhì)譜相似度≥90%和RI接近度最高的化合物為綜合判定結(jié)果，對(duì)于查閱不到RI 的化合物以MS 相似度進(jìn)行判定，并采用峰面積歸一化法計(jì)算各化合物在揮發(fā)性成分中的相對(duì)含量，結(jié)果見表1。

表1 不同萃取頭萃取大高良姜揮發(fā)性成分分析結(jié)果

續(xù)表1

5 種萃取頭共檢測(cè)出大高良姜揮發(fā)性成分81 種，其中萜烯類34 種，醇類21 種，酯類10 種，烴類9 種，醚類3種，醛酮類3 種，其他類1 種；共有檢出成分只有24 種，表明不同萃取頭對(duì)大高良姜揮發(fā)性成分的萃取能力有較大差異；相對(duì)含量最高的成分均為1，8-桉葉素，這與同屬植物山姜、高良姜一致［7]，推測(cè)它在部分山姜屬植物中的含量分布規(guī)律可能具有一定相似性，可作為該屬植物鑒定和品質(zhì)評(píng)價(jià)的一個(gè)指標(biāo)。

5 種萃取頭檢出大高良姜揮發(fā)性成分的數(shù)量和相對(duì)含量見圖2～3，可知其數(shù)量依次為65 μm PDMS/DVB＞85 μm CAR/PDMS＞50/30 μm DVB/CAR/PDMS ＞100 μm PDMS ＞85 μm PA，分別有64、60、54、37、35 種，由此可見，復(fù)合涂層萃取頭萃取大高良姜揮發(fā)性成分的數(shù)量明顯高于單一類型涂層萃取頭，推測(cè)由于復(fù)合涂層萃取頭兼具了不同極性的固定相，對(duì)不同種類的化合物均有親和力。100 μm PDMS 萃取頭檢出成分總數(shù)較少，但其總相對(duì)含量占比最高（80.51%），表明該萃取頭萃取的物質(zhì)較少、萃取效果較差，其次 為50/30 μm DVB/CAR/PDMS（76.01%），85 μm PA 最低（56.77%）。

由圖2 可知，大高良姜揮發(fā)性成分中萜烯類和醇類的數(shù)量明顯高于其他類，前者不僅是香料、調(diào)味品和化妝品的重要原料，并且具有多種藥理活性［14]。65 μm PMDS/DVB 萃取頭檢出的萜烯類化合物數(shù)量最多（29 個(gè)），其次為85 μm CAR/PDMS 和50/30 μm DVB/CAR/PDMS（均為28 個(gè)）；相對(duì)含量最高為85 μm CAR/PDMS（36.8%），其次為50/30 μm DVB/CAR/PDMS（32.73%）。5 種萃取頭中檢出含量最高的前2 個(gè)萜烯類化合物均為α-金合歡烯和γ-杜松烯，其中γ-杜松烯帶有木香、壤香，有祛痰功效［15]，α-金合歡烯有花香、青草香和香脂香味［16]。除此以外，α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、石竹烯、α-檀香烯、α-香檸檬烯、α-律草烯、β-芹子烯、α-芹子烯、芹子二烯在5 種萃取頭中均有檢出，這些都是大高良姜中重要的萜烯類成分［7]。

圖2 不同萃取頭萃取大高良姜揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量

圖3 不同萃取頭萃取大高良姜揮發(fā)性成分相對(duì)含量

醇類化合物通常具有花香、果香、木香等味道，是大高良姜揮發(fā)油香氣的重要來(lái)源。65 μm PMDS/DVB 萃取頭檢出的醇類化合物數(shù)量最多（18 個(gè)），相對(duì)含量為21.09%，僅次于85 μm PA（33.08%）；100 μm PDMS 萃取頭檢出的醇類化合物數(shù)量（10 個(gè)）和總相對(duì)含量（14.01%）均為最低。5 種萃取頭中檢出含量最高的醇類化合物中均為α-松油醇，其次為蓽澄茄油烯醇，其中α-松油醇是一種重要的醫(yī)藥和香精原料［14]，蓽澄茄油烯醇是大高良姜重要的特殊風(fēng)味物質(zhì)［16]。在5 種萃取頭中均檢出的醇類化合物還有α-香檸檬醇、4-萜品醇、表藍(lán)桉醇、龍腦。

5 種萃取頭中檢出酯類物質(zhì)數(shù)量最多的是65 μm PMDS/DVB（9 種），乙酰氧基胡椒酚乙酸酯為5 種萃取頭中檢出含量最高的酯類物質(zhì)，與文獻(xiàn)［17] 報(bào)道一致。它是大高良姜主要的辛辣成分，呈現(xiàn)獨(dú)特的辛辣感覺，具有抗腫瘤、抑菌、抗?jié)儭⒖寡趸壬锘钚?，但其在高良姜、生姜、艷山姜、益智等其他山姜屬植物中未被檢出［8，10]，可能是大高良姜特征成分。

5 種萃取頭檢出的醚類和醛酮類化合物數(shù)量均較少，且不同萃取頭間差別不大。由于醚類化合物中的1，8-桉葉素是大高良姜揮發(fā)性成分中含量最高的化合物，故5 種萃取頭檢出的醚類化合物數(shù)量雖然較少，但相對(duì)含量高于酯類、烴類化合物。對(duì)于烴類化合物，85 μm CAR/PMDS 表現(xiàn)出較高的敏感性，檢出數(shù)量（9 種）明顯高于其他萃取頭，并且有5 種為獨(dú)有物質(zhì)，分別為α-姜黃烯、愈創(chuàng)蘭油烴、十五烷、十七烷和十九烷。

2.5 不同萃取頭對(duì)各種類化合物靈敏度分析 相同操作條件下，不同萃取頭對(duì)同一化合物的萃取峰面積不盡相同，因此須將不同萃取頭對(duì)相同化合物的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后才能準(zhǔn)確比較。劉非等［18]采用累積峰面積標(biāo)準(zhǔn)化值（cumulative area normalization value，CANV）評(píng)價(jià)不同萃取頭對(duì)各類化合物的靈敏度，相同保留時(shí)間下對(duì)某類化合物CANV 值越大的萃取頭，則對(duì)該類化合物的靈敏度越高。

由圖4 可知，85 μm CAR/PMDS 萃取頭對(duì)萜烯類、烴類化合物具有最大的CANV 值，其次為65 μm PMDS/DVB；65 μm PMDS/DVB 萃取頭對(duì)醇類、酯類、醛酮醚類化合物有最大的CANV 值，萃取靈敏度較高。總體上，85 μm PA、100 μm PDMS 萃取頭對(duì)各類化合物的CANV 值較小，表明單一涂層萃取頭對(duì)大高良姜各類揮發(fā)性成分萃取靈敏度不高，萃取效果較差。

圖4 不同萃取頭萃取各類化合物的峰面積累積標(biāo)準(zhǔn)化值

2.6 基于主成分分析的不同萃取頭萃取效果評(píng)價(jià) 以特征值大于0.8，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率≥85.0% 為依據(jù)，利用SPSS 25.0 軟件對(duì)5 種萃取頭所萃取的大高良姜各類揮發(fā)性成分的相對(duì)含量進(jìn)行主成分分析［19]。見表2～3。

表2 主成分因子特征值及貢獻(xiàn)率

表3 主成分因子載荷矩陣

結(jié)果顯示，共提取到主成分3 個(gè)，累積方差貢獻(xiàn)率為98.95%，基本上能反映原變量的信息［20]。其中，第一主成分（PC1）方差貢獻(xiàn)率為58.86%，主要反映萜烯類、酯類、烴類、醛酮類化合物的變異信息；第二主成分（PC2）方差貢獻(xiàn)率為24.94%，主要反映醇類化合物的變異信息；第三主成分（PC3）方差貢獻(xiàn)率為15.16%，主要反映醚類化合物的變異信息。各主成分得分（F）方程為F1=0.469 X1+0.386 X2+0.487 X3+0.339 X4+0.526 X5-0.034 X6、F2=-0.176 X1+0.488 X2+0.296 X3-0.585 X4-0.064 X5+0.545 X6、F3=0.432 X1-0.322 X2-0.165 X3+0.255 X4-0.111 X5+0.778 X6。

以各主成分方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重，構(gòu)建萃取頭對(duì)大高良姜揮發(fā)性成分萃取效果的綜合評(píng)價(jià)模型，表達(dá)式為F=0.5886 F1+0.2494 F2+0.1516 F3，模型得分越高，表明該萃取頭的萃取效果越好。由表4 可知，65 μm PDMS/DVB萃取頭得分最高，為萃取大高良姜揮發(fā)性成分的最優(yōu)選擇。

表4 萃取頭綜合評(píng)價(jià)得分

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用7 種萃取頭，通過HS-SPME 結(jié)合GC-MS對(duì)大高良姜揮發(fā)性成分進(jìn)行萃取和檢測(cè)。通過總離子流圖分析，選取100 μm PMDS、85 μm PA、65 μm PDMS/DVB 85 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 這5 種萃取頭萃取的成分進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果表明，5 種萃取頭共檢測(cè)出81 種成分，包括萜烯類34 種，醇類21 種，酯類10種，烴類9 種，醚類3 種，醛酮類3 種，其他類1 種，檢出成分?jǐn)?shù)量高于前期報(bào)道［7，17]?？傮w上，具有復(fù)合涂層的萃取頭在檢出物數(shù)量、總相對(duì)含量和萃取靈敏度方面優(yōu)于單一涂層的萃取頭。

采用主成分分析評(píng)價(jià)不同萃取頭對(duì)大高良姜揮發(fā)性成分的萃取效果，提取到3 個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為98.95%，能充分解釋不同萃取頭萃取大高良姜揮發(fā)性成分的信息。根據(jù)所建立的評(píng)價(jià)模型，確定65 μm PDMS/DVB為大高良姜揮發(fā)性成分分析的最佳萃取頭，可為進(jìn)一步研究該藥材乃至其他山姜屬植物的揮發(fā)性成分及建立相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。