張 帆 劉 紅 暴芳芳 周桂芝 潘 晴 張福仁

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院，山東省皮膚病性病防治研究所)，濟(jì)南，250022

海分枝桿菌是一種獨(dú)立生存于水生環(huán)境中的非典型分枝桿菌，根據(jù) Runyon分類(lèi)，屬于慢生長(zhǎng)菌中的光產(chǎn)色菌群。1926年首次從咸水魚(yú)中被分離，1951年報(bào)道了首例人感染海分枝桿菌的病例[1]，其因游泳導(dǎo)致了海分枝桿菌的入侵，被稱(chēng)為“游泳池肉芽腫”。隨后大量病例被發(fā)現(xiàn)由水族館維護(hù)導(dǎo)致感染，又獲名“魚(yú)缸肉芽腫”。隨著生活水平的提高，因游泳和魚(yú)缸維護(hù)導(dǎo)致的病例減少，而因人類(lèi)烹飪食用海產(chǎn)品過(guò)程中魚(yú)刺傷的病例數(shù)逐漸增多，“游泳池肉芽腫”、“魚(yú)缸肉芽腫”的名稱(chēng)已不再適用，因此將其命名為“魚(yú)刺傷肉芽腫”。該病在美國(guó)發(fā)病率約0.27/105[2]，我國(guó)雖沒(méi)有大樣本統(tǒng)計(jì)，但案例報(bào)道明顯增加。明確感染菌種并應(yīng)用敏感藥物對(duì)感染類(lèi)疾病至關(guān)重要，我們?cè)\治了10例魚(yú)刺傷肉芽腫患者，回顧其臨床表現(xiàn)，組織病理，治療及其轉(zhuǎn)歸，以期對(duì)魚(yú)刺傷肉芽腫的診斷和治療提供更多的臨床證據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 我院2019年1月至2020年5月診治的魚(yú)刺傷肉芽腫患者共10例，所有患者經(jīng)病理檢查、細(xì)菌培養(yǎng)、組織或菌落DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)檢查后綜合判斷確認(rèn)符合魚(yú)刺傷肉芽腫的表現(xiàn)。

1.2 方法

1.2.1 回顧確診病例的臨床資料 患者的發(fā)病年齡、病程、誘發(fā)因素、皮損特點(diǎn)；回顧治療方法和疾病轉(zhuǎn)歸。

1.2.2 病原學(xué)檢查 方法：組織病理、抗酸染色、皮損組織PAS染色、真菌鏡檢及真菌培養(yǎng)、海分枝桿菌培養(yǎng)、提取患者皮損DNA以及培養(yǎng)物DNA行PCR檢測(cè)。

海分枝桿菌培養(yǎng)方法：選取患者組織標(biāo)本于4.0% NaOH消化處理后對(duì)酸性羅氏培養(yǎng)基接種，將培養(yǎng)基置于32℃恒溫箱，對(duì)其生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀(guān)察，海分枝桿菌為慢生長(zhǎng)菌，觀(guān)察時(shí)間至少需要1周。

組織及菌落qPCR鑒定：對(duì)患者組織或培養(yǎng)出的菌落提取DNA后行qPCR鑒定。采取自主設(shè)計(jì)的海分枝桿菌引物。qPCR反應(yīng)條件：50.0℃12 s，95.0℃10 min→95.0℃15 s，60.0℃1 min(×40)。以海分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌落構(gòu)建的質(zhì)粒為陽(yáng)性參考，依據(jù)此陽(yáng)性參考觀(guān)察比對(duì)，若所測(cè)試的DNA有良好的溶解曲線(xiàn)，且CT值<35，即診斷為海分枝桿菌菌落或組織DNA的qPCR陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。定量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果

2.1 魚(yú)刺傷肉芽腫患者的一般情況 10例患者中，3例男性，7例女性。發(fā)病年齡19～65歲，平均(49.00±4.50)歲，發(fā)病至確診1～12個(gè)月，平均(4.20±3.22)個(gè)月(表1)。

表1 10例魚(yú)刺傷肉芽腫患者臨床特征及治療效果

2.2 發(fā)病誘因 10例患者中3例(30%)從事與海產(chǎn)相關(guān)的廚師職業(yè)。5例患者發(fā)病前有魚(yú)類(lèi)或海鮮刺傷史，具體魚(yú)種不詳；1例患者發(fā)病前曾有菜刀切傷史，1例患者只能回憶有手部外傷史。

2.3 臨床表現(xiàn) 皮損分布及特點(diǎn)：3例(30%)患者皮損局限于手部或上肢遠(yuǎn)側(cè)(皮損數(shù)目<3個(gè))(圖1)，7例(70%)患者皮損沿淋巴管分布(圖2)。10例(100%)患者皮損表現(xiàn)為暗紅色斑塊或結(jié)節(jié)，大約1～2 cm；3例(30%)患者除皮膚表面暗紅色斑塊結(jié)節(jié)外，還可觸及質(zhì)硬、豆?；蚧ㄉ笮〉钠は陆Y(jié)節(jié)；3例(30%)患者皮損出現(xiàn)破潰結(jié)痂，引起輕微疼痛，其余患者無(wú)明顯觸痛。1例(10%)患者結(jié)節(jié)處出現(xiàn)膿頭。所有患者均未出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、骨髓炎等深部感染。10例患者根據(jù)皮損特點(diǎn)可分為皮損局限手部的I型感染(3例)和皮損播散至上肢的II型感染(7例)。

圖1 1a～1c：皮損局限于手部的病例治療前后對(duì)比 圖2 2a～2c：皮損播散至上臂的病例治療前后對(duì)比

2.4 實(shí)驗(yàn)室和組織病理檢查結(jié)果 1例患者治療前肝功異常(谷丙轉(zhuǎn)氨酶64 U/L)，其余患者治療前血常規(guī)、肝腎功均無(wú)異常。全部患者行組織病理檢查，均顯示感染性肉芽腫的組織特征，其中4例患者可見(jiàn)明顯的上皮樣肉芽腫形成，其余患者病理顯示表皮增生，真皮淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等非特異性炎癥改變(圖3)。

圖3 表皮輕度增生及細(xì)胞間水腫，真皮淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)上皮樣細(xì)胞肉芽腫及中性粒細(xì)胞膿腫(HE，×40) 圖4 培養(yǎng)瓶中的海分枝桿菌 用分支桿菌羅氏培養(yǎng)基在32℃條件下培養(yǎng)1個(gè)月后，可見(jiàn)淡黃色、干燥、呈奶酪樣的海分枝桿菌生長(zhǎng) 圖5 海分枝桿菌的qPCR擴(kuò)增曲線(xiàn) 注：紅色曲線(xiàn)為采用標(biāo)準(zhǔn)菌株制備的DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，紫色曲線(xiàn)為從培養(yǎng)出的菌落提取的樣本DNA的擴(kuò)增曲線(xiàn)

2.5 病原學(xué)檢查結(jié)果 全部患者真菌鏡檢及培養(yǎng)陰性，PAS染色未見(jiàn)菌絲及孢子、抗酸染色陰性。10例患者中，8例患者組織及菌落DNA qPCR檢測(cè)海分枝桿菌陽(yáng)性；1例患者菌落DNA檢測(cè)海分枝桿菌陽(yáng)性，組織DNA海分枝桿菌陰性；1例患者組織DNA海分枝桿菌陽(yáng)性，未行菌落培養(yǎng)及菌落DNA檢測(cè)(圖4、5)。

依據(jù)患者病史、組織病理、培養(yǎng)及分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，10例患者可確診為魚(yú)刺傷肉芽腫(培養(yǎng)或者qPCR檢測(cè)陽(yáng)性)。

2.6 治療及預(yù)后 手部局限性疣狀結(jié)節(jié)的患者(共3例)給予單一藥物治療：鹽酸米諾環(huán)素(瀚暉制藥有限公司)(50 mg)每日2次，3例患者均治愈，平均療程(4.67±2.08)個(gè)月；皮損沿淋巴管播散的患者(共6例)采用兩藥聯(lián)合治療：利福平(四川制藥制劑有限公司)(150～600 mg)每日1次；克拉霉素(萊陽(yáng)市江波制藥有限責(zé)任公司)(500 mg)每日1次，在隨訪(fǎng)中，1例失訪(fǎng)，其余5例患者治愈，平均療程(4.80±1.48)個(gè)月；1例皮損播散但為乙肝攜帶者(治療前肝功異常，谷丙轉(zhuǎn)氨酶64 U/L)，給予多西環(huán)素(永信藥品工業(yè)股份有限公司)(100 mg)單一治療，每日2次，終治愈，療程9個(gè)月。

除1例失訪(fǎng)患者，余9例均被治愈，治愈率100%，總治療時(shí)長(zhǎng)(5.33±0.65)個(gè)月。在治療過(guò)程中，3例患者服藥過(guò)程中出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶輕度升高，給予復(fù)方甘草酸苷片(50 mg)每日3次服用至肝功正常，未予以停藥；1例患者用藥1個(gè)月后出現(xiàn)粒細(xì)胞減少癥(白細(xì)胞2.41×109/L)，當(dāng)日給予重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液(200 ug)皮下注射，后失訪(fǎng)。

3 討論

魚(yú)刺傷肉芽腫是引起皮膚感染的非結(jié)核分枝桿菌之一，其主要危險(xiǎn)因素是接觸水生環(huán)境或者海洋生物。感染常見(jiàn)于工作或愛(ài)好與接觸淡水或鹽水有關(guān)的人群，45%的魚(yú)刺傷肉芽腫確診病例有與魚(yú)類(lèi)相關(guān)的活動(dòng)史[3]，感染暴露部位92.5%為手部[4]。在我們的病例中，70%的患者有明確的手部外傷史，但不能清楚回憶是否與魚(yú)類(lèi)有關(guān)，這與國(guó)外研究大致一致。Zettergran等[5]在前人研究的基礎(chǔ)上將魚(yú)刺傷肉芽腫的皮損表現(xiàn)總結(jié)為三型以指導(dǎo)臨床治療：I型，單一的自限性疣狀病變(皮損<3個(gè))，幾乎不伴有疼痛；II型，多個(gè)皮下肉芽腫，孢子絲菌病模式分布，伴或不伴有潰瘍；III型，累及腱鞘、滑膜囊、骨或關(guān)節(jié)的深部感染，導(dǎo)致腱鞘炎、感染性關(guān)節(jié)炎或骨髓炎。除此之外，對(duì)于免疫力低下或應(yīng)用了免疫抑制劑或因誤診給予糖皮質(zhì)激素的患者，可發(fā)生全身播散性感染甚至死亡[6-8]，可將其歸為IV型。本文所有患者皮損以暗紅色結(jié)節(jié)、紅斑為主，均無(wú)深部感染和播散，按此分型本研究可分為4例I型，6例II型。有學(xué)者認(rèn)為感染深度不同的原因可能與暴露類(lèi)型有關(guān)，劃船或釣魚(yú)等活動(dòng)與深部感染有關(guān)，而魚(yú)缸暴露與表淺皮損有關(guān)。并猜測(cè)這可能是因?yàn)閯澊歪烎~(yú)損傷涉及魚(yú)刺、魚(yú)鉤或其他設(shè)備造成的深刺傷，而魚(yú)缸維護(hù)帶來(lái)的損傷可能涉及更多的表面暴露，但這一猜想并未得到進(jìn)一步證實(shí)[2]。

文獻(xiàn)報(bào)道魚(yú)刺傷肉芽腫的潛伏期從4周到9個(gè)月不等[9]，皮損分布模式與孢子絲菌感染十分相似，除外，皮膚結(jié)核[10]、著色芽生菌病[11]也有沿淋巴管走行的皮損，臨床易誤診。本研究中所有患者組織病理特點(diǎn)相似且無(wú)特異性，病理診斷均為感染性肉芽腫。最終借助培養(yǎng)及qPCR明確診斷。從其他文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，被感染者病理表現(xiàn)為非特異性，38%的患者可出現(xiàn)肉芽腫，13%～17%的患者抗酸菌染色陽(yáng)性，分枝桿菌培養(yǎng)率3%～55%[12]。且目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院并未將qPCR作為常規(guī)檢測(cè)。以上為明確診斷增加了難度。根據(jù)2007年美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(ATS)和美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)(IDSA)發(fā)表的非結(jié)核分枝桿菌診斷和治療官方聲明[13]，魚(yú)刺傷肉芽腫主要通過(guò)引流液標(biāo)本或組織中培養(yǎng)出特定病原體明確診斷，本研究中9例患者符合這一診斷標(biāo)準(zhǔn)；根據(jù)Patrick等[14]的觀(guān)點(diǎn)，對(duì)于海分枝桿菌培養(yǎng)陰性的患者，應(yīng)根據(jù)特殊職業(yè)、明確的外傷史以及典型的臨床表現(xiàn)，盡早開(kāi)始診斷性治療。

對(duì)于魚(yú)刺傷肉芽腫的治療，2007年ATS/IDSA聯(lián)合指南的治療建議推薦2種活性藥物(克拉霉素/阿奇霉素、乙胺丁醇/利福平)3～4個(gè)月，輔助外科清創(chuàng)治療侵襲性感染[13]。我國(guó)2012年非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專(zhuān)家共識(shí)推薦采用利福平或利福布汀、乙胺丁醇和克拉霉素，療程4～6個(gè)月，療效不佳的患者可行外科清創(chuàng)治療。對(duì)于單藥治療還是聯(lián)合用藥及選擇的藥物，不同的研究尚存在一定的爭(zhēng)議。近年來(lái)我國(guó)有人總結(jié)了單獨(dú)應(yīng)用鹽酸多西環(huán)素治療9例I型和II型皮膚感染，平均治療時(shí)間(2.28 ± 0.67)個(gè)月[15]。林麟等將17例魚(yú)刺傷肉芽腫患者進(jìn)行分組治療發(fā)現(xiàn)，單一應(yīng)用克拉霉素或者聯(lián)合用藥中含克拉霉素的治療方案效果顯著，并發(fā)現(xiàn)皮損局部注射激素可能導(dǎo)致治療失敗。Veraldi等[16]采用沖擊療法克拉霉素(500 mg)每日1次連用10天/月，持續(xù)5個(gè)月，80%以上的患者被治愈。Lewis等[17]認(rèn)為克拉霉素是魚(yú)刺傷肉芽腫聯(lián)合治療中的最佳首選藥物，但考慮有單藥治療失敗的案例，不建議單藥治療。幾例多樣本回顧性分析中發(fā)現(xiàn)，單一抗生素療法和兩藥聯(lián)合取得的治療效果差異不大[18-20]。但一項(xiàng)63例的病例回顧性分析中，接近一半的患者由于單藥效果不佳更換了最初治療方案，多藥療法展現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)[21]。在我們的病例中，1例失訪(fǎng)患者，3例皮損局限于手部的患者單一應(yīng)用了米諾環(huán)素，平均療程(4.67±2.08)個(gè)月，均痊愈。5例皮損累及上肢的患者采取利福平聯(lián)合克拉霉素進(jìn)行治療，平均療程(4.80±1.48)個(gè)月。另外1例患者由于攜帶乙肝病毒，且治療開(kāi)始及治療過(guò)程中出現(xiàn)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的升高，我們選用了肝毒性較小的多西環(huán)素治療，治療時(shí)長(zhǎng)達(dá)到9個(gè)月。海分枝桿菌體外藥敏實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物顯示出中度敏感，其中米諾環(huán)素的活性高于多西環(huán)素(MIC持續(xù)降低兩倍)[22]。我們這例患者用藥時(shí)長(zhǎng)與藥敏試驗(yàn)中多西環(huán)素顯示中度敏感是一致的。由于分枝桿菌對(duì)四環(huán)素(主要是米諾環(huán)素)和氟喹諾酮類(lèi)藥物的潛在耐藥性，可對(duì)治療效果不佳的患者行藥敏試驗(yàn)。

綜上，海分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率較低給本病的診斷帶來(lái)難度，培養(yǎng)聯(lián)合分子生物學(xué)技術(shù)可顯著提高診斷的敏感性和特異性。根據(jù)我們的研究以及國(guó)內(nèi)外報(bào)道，為取得最佳治療效果以及降低藥物不良反應(yīng)，I、II型患者可應(yīng)用利福平聯(lián)合克拉霉素進(jìn)行治療。由于本研究中I型患者病例數(shù)較少，單獨(dú)應(yīng)用米諾環(huán)素等四環(huán)素類(lèi)藥物治療I型患者還待進(jìn)一步驗(yàn)證。必要時(shí)可行藥敏實(shí)驗(yàn)調(diào)整方案。