邱 勰 雷鐵池 韓冰玉 姚云竹 廖志凱 胡雙海

武漢大學(xué)人民醫(yī)院皮膚性病科，湖北武漢，430060

皮膚老化一般被分為自然老化和光老化，通常具有皺紋形成、皮膚松弛、色素沉著等改變。目前臨床上已經(jīng)采用了如光子嫩膚、玻尿酸注射等方式來(lái)預(yù)防或延緩皮膚老化，但具有時(shí)效短、不良反應(yīng)多等局限性[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，在人眶周皮膚注射自體培養(yǎng)FBs后，皮膚張力明顯改善[2]，這表明細(xì)胞注射治療在改善皮膚老化方面已經(jīng)表現(xiàn)出一定的價(jià)值。

最近，用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)(single-cell RNA sequencing)發(fā)現(xiàn)人和鼠的真皮FBs存在異質(zhì)性。位于真皮淺層的乳頭層成纖維細(xì)胞(papillary FB)和位于深層的網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞(reticular FB)在細(xì)胞表型和生物學(xué)功能上有較大差異[3,4]。網(wǎng)狀層FBs比乳頭層FBs分泌膠原蛋白的能力更強(qiáng)，而乳頭層FBs的增殖能力比網(wǎng)狀層FBs強(qiáng)[4]。隨著皮膚老化，乳頭層FBs逐漸消失。還發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的乳頭層FBs分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的能力在老年人中明顯高于年輕人[4]。由于小鼠胚胎第18.5天(E18.5)[5]的真皮含乳頭層FBs高達(dá)81.8%[4]。我們的假說(shuō)是自胎鼠(E18.5)皮膚分離培養(yǎng)FBs，經(jīng)CM-Dil熒光染料活細(xì)胞標(biāo)記后皮下注射至光老化小鼠的皮膚，檢查同種異體小鼠FBs注射是否具有抗老化作用，旨在探索下一步用自體真皮成纖維細(xì)胞治療(autologous dermal fibroblast therapy)抵抗人皮膚衰老的可行性與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料收集 取BALB/c健康雄性小鼠20只(購(gòu)自湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，隨機(jī)分為：未處理組5只、僅做照光處理的模型組5只、照光處理后注射PBS的空白組5只、照光后進(jìn)行細(xì)胞治療的治療組5只，所有小鼠均用冰王脫毛膏脫去背部5 cm×6 cm面積的毛發(fā)。每個(gè)組的5只小鼠并于同一籠，飼養(yǎng)于25℃室溫中，予以相同的無(wú)菌食用水和飼料喂養(yǎng)，并維持12 h光照的晝夜節(jié)律。

1.2 紫外線照射構(gòu)建老化模型 每日用0.6 J/cm2劑量的UVA和60 mJ/cm2劑量的UVB于模型組、空白組和治療組小鼠裸露皮膚區(qū)正上方30 cm處，每日混合照射1次，持續(xù)8周，以鼠背部出現(xiàn)皮膚粗糙增厚，皺褶顯著，色素明顯加深體征表示造模成功。

1.3 鼠FBs體外培養(yǎng)及CM-Dil熒光染料活FBs標(biāo)記

1.3.1 胎鼠FBs體外培養(yǎng) 取胎鼠(E18.5)10只，活力碘中浸泡10 min，無(wú)菌剝離全層皮膚，在PBS中沖洗2～3次后將其剪成2 cm×4 mm皮片，與4℃條件下在0.25%Dispase酶中消化12 h后，機(jī)械分離表皮和真皮。將真皮剪碎，加入含有EDTA的胰蛋白酶于37℃培養(yǎng)箱中消化15 min，用含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，1000 rpm離心5 min后棄上清。用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，在37℃、5% CO2條件接種于培養(yǎng)皿中，每隔兩日進(jìn)行細(xì)胞換液。

1.3.2 FBs標(biāo)記 參考Reichenberger等[6]的方法給FBs進(jìn)行染色標(biāo)記，取原代培養(yǎng)的FBs，在含有EDTA的胰蛋白酶中于37℃環(huán)境下消化5 min后用含10%FBS的等量培養(yǎng)基終止消化，1000 rpm離心5 min，棄上清，1 mL PBS重懸制成細(xì)胞懸液，以2 μM/mL的終濃度加入CM-Dil染料(thermo fisher，C7000)，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育5 min，再于4℃環(huán)境下孵育15 min。孵育后1000 rpm離心5 min，棄上清，PBS洗滌2～3次，離心，棄上清，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。

1.4 FBs注射處理

1.4.1 取已被CM-Dil熒光染料標(biāo)記的約為5×105/mL密度的胎鼠FBs細(xì)胞懸液1 mL，用胰島素針抽取對(duì)小鼠進(jìn)行皮內(nèi)注射，均勻注射5個(gè)皮丘，每隔3日對(duì)小鼠進(jìn)行環(huán)鉆取皮，并將取得的皮膚進(jìn)行冰凍切片處理，于熒光顯微鏡下觀察FBs在小鼠體內(nèi)的存活情況，確定FBs在小鼠體內(nèi)最為活躍的日期。

1.4.2 治療組小鼠每隔5日用胰島素針抽取1 mL已被標(biāo)記的密度為5×105/mL的胎鼠FBs,進(jìn)行皮內(nèi)注射,每只小鼠均勻注射5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)約1×105個(gè)細(xì)胞，空白組用同樣方法注射等量PBS處理，一共注射4次。

1.5 組織病理

1.5.1 切片處理 4次注射結(jié)束后將小鼠處死解剖，提取背部裸露皮膚，部分予以冰凍切片后觀察熒光顯色情況；部分用甲醛固定后石蠟包埋，切厚度約為4 μm的切片，進(jìn)行HE、Masson染色。

1.5.2 HE染色 二甲苯將切片脫蠟，將已脫蠟的組織切片經(jīng)由高濃度酒精到低濃度，最后入蒸餾水后放入蘇木精溶液中5 min，在酸堿中分色數(shù)秒后流水沖洗1 h，再于70%和90%濃度的酒精中脫水10 min，最后用伊紅染色3 min。染色后經(jīng)純酒精脫水，再應(yīng)用二甲苯使其透明，樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察各組小鼠表皮及真皮厚度。

1.5.3 Masson染色 二甲苯將切片脫蠟，將已脫蠟的組織切片經(jīng)由高濃度酒精到低濃度，最后入蒸餾水后，用Weigert鐵蘇木素染色液染色5 min，酸性乙醇分化10 s后流水沖洗1 h，再于Masson藍(lán)化液中返藍(lán)5 min，水洗，在麗春紅品紅染色液中染色8 min后用磷鉬酸溶液洗滌2 min，放入苯胺藍(lán)染色液中染色1 min。染色后經(jīng)純酒精脫水，再應(yīng)用二甲苯使其透明，樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察對(duì)比各組小鼠真皮膠原形態(tài)。

1.5.4 皮膚新生膠原測(cè)定 精確稱取濕重約5 g的組織，研磨后3000 rpm離心10 min，取上清。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)(購(gòu)自武漢潔洋盛公司)用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)小鼠皮膚樣本中I型前膠原羧基端肽(PICP)的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)FBs的形態(tài)以及注射后不同時(shí)間體內(nèi)示蹤FBs存活 FBs接種于培養(yǎng)皿12 h后可觀察到部分貼壁，接種6～7天后細(xì)胞增長(zhǎng)至80%以上；倒置熒光顯微鏡顯示：2 μM/mL的終濃度下，CM-Dil染色的FBs細(xì)胞膜表達(dá)陽(yáng)性，呈現(xiàn)明亮的紅色熒光(圖1)。

圖1 1a：倒置顯微鏡明場(chǎng)鏡頭下觀察的貼壁生長(zhǎng)6～7日的胎鼠FBs(×100)；1b：同一視野下用2 μM/mL終濃度的CM-Dil標(biāo)記的FBs的熒光染色圖像(×100)；1c：merge圖像；比例尺：100 μm

在小鼠皮內(nèi)注射FBs后每隔3日環(huán)鉆取皮進(jìn)行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察，可以見(jiàn)到第3日熒光強(qiáng)度最高，之后逐漸下降，到第9日幾乎見(jiàn)不到熒光(圖2)，因此選擇第3日處死各個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2 熒光正置顯微鏡下觀察CM-Dil標(biāo)記的FBs在小鼠皮內(nèi)存活情況，左列為DAPI標(biāo)記熒光，中間列為CM-Dil標(biāo)記熒光，右列為merge圖像(×100)；比例尺：100 μm

2.2 胎鼠FBs對(duì)光老化小鼠皮膚的改善作用

2.2.1 大體圖對(duì)比 從大體圖對(duì)照可見(jiàn)模型組、空白組和治療組的小鼠背部裸露皮膚經(jīng)紫外光照射后出現(xiàn)較明顯皺紋、質(zhì)地變厚、彈性減弱、干燥、色素沉著等改變，治療組小鼠的背部裸露皮膚在連續(xù)4次胎鼠FBs注射后，相較空白組以及模型組小鼠皮膚皺紋深度相對(duì)較淺，空白組對(duì)比模型組小鼠皮膚老化情況無(wú)明顯改善(圖3)。

圖3 注射治療前后各組小鼠背部皮膚情況，每次注射1 mL注射物，予以分點(diǎn)在脫毛區(qū)域注射，共5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)200 μL(治療組每個(gè)注射點(diǎn)約1×105個(gè)細(xì)胞)

2.2.2 熒光及免疫組化結(jié)果 用免疫熒光檢測(cè)法對(duì)各組小鼠的背部皮膚冰凍切片觀察結(jié)果可見(jiàn)，治療組的小鼠在4次注射后第3日可見(jiàn)背部明亮的紅色熒光，其他3組小鼠紅色熒光強(qiáng)度非常弱(圖4)。

圖4 熒光顯微鏡下觀察注射處理后各組小鼠背部皮膚冰凍切片，A：未處理組，B：模型組，C：空白組，D：治療組，最左列為DAPI染色結(jié)果，中間列為CM-Dil染色結(jié)果，最右列為merge圖像(×100)；比例尺：100 μm

HE染色結(jié)果提示，小鼠照光后表皮厚度明顯增加(P<0.05)，空白組和模型組小鼠的真皮厚度相比未處理組小鼠明顯變薄(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)FBs治療后，小鼠皮膚的真皮厚度明顯增厚，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)，但表皮厚度變化相比空白組變化不明顯(表1)。

圖5 5a～5d：分別為未處理組、模型組、空白組和治療組。小鼠經(jīng)照光后表皮均明顯增厚(HE，×100)

表1 胎鼠FBs皮內(nèi)注射對(duì)光老化小鼠表皮及真皮厚度的影響

Masson染色見(jiàn)模型組和空白組小鼠對(duì)比正常組膠原纖維斷裂，明顯紊亂，第4次注射FBs3日后，治療組小鼠光損傷區(qū)域真皮層內(nèi)變性、斷裂的膠原纖維明顯減少，并可見(jiàn)少量新生膠原(圖6)。

圖6 6a～6d：分別為未處理組、模型組、空白組和治療組，可見(jiàn)模型組和空白組小鼠相對(duì)未處理組小鼠真皮層的膠原纖維明顯疏松紊亂，注射FBs后斷裂紊亂的膠原纖維明顯減少(Masson染色，×100)

2.3 ELISA結(jié)果 FBs注射4次后，治療組小鼠皮膚新生膠原濃度相比空白組和模型組明顯增多，對(duì)比未處理組含量較低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻捉M小鼠和模型組小鼠PICP濃度無(wú)明顯差異(P>0.05)，且兩組PICP濃度相對(duì)未處理組小鼠均降低，(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 胎鼠FBs皮內(nèi)注射對(duì)光老化小鼠真皮PICP表達(dá)水平的影響

3 討論

長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，人們一直認(rèn)為FBs只不過(guò)是一群均一的負(fù)責(zé)產(chǎn)生膠原和彈性纖維蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì)的間充質(zhì)細(xì)胞。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)真皮至少存在有兩個(gè)FBs亞群，即乳頭層FBs和網(wǎng)狀層FBs，乳頭層FBs有更高的細(xì)胞增殖和分化能力，并能調(diào)節(jié)毛囊等附屬器再生[8，9]，隨著年齡增長(zhǎng)，乳頭層FBs表達(dá)減少[10]，老化皮膚的乳頭層FBs增加了基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)[4]，導(dǎo)致乳頭層的膠原大量斷裂并排列紊亂，皮膚色素沉著，深層皺紋增加[11]。相反，網(wǎng)狀層FBs數(shù)目增加，并能合成大量纖維狀膠原蛋白(與疤痕FBs的類似)增加了皮膚僵硬度(stiffness)。最近有人提出用真皮的不同區(qū)域成纖維細(xì)胞(zonal dermal fibroblast)進(jìn)行皮內(nèi)填充注射，可獲得較好的抗皮膚衰老的效果[2]。由于人類臨床試驗(yàn)的倫理限制，我們選擇了E18.5的胎鼠皮膚分離培養(yǎng)FBs，此時(shí)真皮含乳頭層FBs細(xì)胞高達(dá)81.8%[4]，觀察注射胎鼠真皮FBs對(duì)老化小鼠皮膚的改善作用。

我們用紫外線(UVA聯(lián)合UVB)照射建立小鼠皮膚老化模型，觀察到老化小鼠背部皮膚相對(duì)于對(duì)照組出現(xiàn)皮膚皺紋、色素沉著、皮膚松弛等現(xiàn)象。皮內(nèi)注射后CM-Dil熒光染料標(biāo)記活FBs示蹤試驗(yàn)顯示，注射后第3天細(xì)胞存活最高，之后逐漸下降，到第9日幾乎見(jiàn)不到熒光標(biāo)記細(xì)胞。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)胎鼠FBs注射4次后從大體照片上能夠觀察到相對(duì)于模型組以及空白組小鼠背部皮膚皺紋明顯變淺、炎癥反應(yīng)也相對(duì)較輕；HE和Masson染色可見(jiàn)真皮厚度明顯增厚(P<0.05)，膠原纖維的排列也更為緊密有序；I型膠原是真皮中維持皮膚張力和承受拉力的重要成分，在老化小鼠皮膚中，I型膠原明顯減少，且形態(tài)表現(xiàn)粗細(xì)不等，分布不均[12]。而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了胎鼠FBs的皮內(nèi)注射有助于I型膠原的產(chǎn)生，從而改善皮膚老化。

本研究我們初步證實(shí)了胎鼠FBs對(duì)紫外線誘導(dǎo)的小鼠皮膚老化有改善作用，而胎鼠FBs中有較高比例的乳頭層FBs，皮內(nèi)注射胎鼠FBs可促進(jìn)I型膠原蛋白的從頭合成，改善了皮膚老化。是否人自體真皮乳頭層FBs注射能成為抗皮膚衰老的新治療手段仍待臨床進(jìn)一步證實(shí)。