杭 紅 ，邢 晗 ，張 天 ，朱 磊 ，李 宇 △

（1. 上海藥明奧測(cè)醫(yī)療科技有限公司，上海 200125； 2. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450052）

他克莫司（tacrolimus）又名FK506，屬鏈霉菌屬中分離出的大環(huán)內(nèi)酯類新型免疫抑制劑，可通過抑制白細(xì)胞介素 2（IL －2）、γ 干擾素的釋放，抑制 T 淋巴細(xì)胞的增殖和活化，從而抑制免疫反應(yīng)。他克莫司是肝臟、心臟、腎臟及骨髓移植患者的首選免疫抑制藥物，移植后排斥反應(yīng)對(duì)傳統(tǒng)免疫抑制方案耐藥者，也可選用該藥［1－2］。近幾年，他克莫司也用于抑制潰瘍性結(jié)腸炎患者的炎性反應(yīng)［3］。他克莫司的治療窗窄，且藥代動(dòng)力學(xué)個(gè)體差異大，使用標(biāo)準(zhǔn)起始劑量后，有的患者由于血藥濃度低，未達(dá)到有效治療濃度而產(chǎn)生急性排斥反應(yīng)；有的患者由于血藥濃度高而產(chǎn)生系列毒副反應(yīng)，如肝腎毒性、神經(jīng)毒性、血糖代謝紊亂、脂代謝異常等，因此臨床使用他克莫司需進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)［4－5］。

目前用于測(cè)定全血中他克莫司血藥濃度的方法主要包括微粒子酶聯(lián)免疫法（MEIA）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、酶放大免疫測(cè)定法（EMIT）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）等。免疫學(xué)方法所用單克隆抗體與他克莫司代謝物存在交叉反應(yīng)，過高地估計(jì)了他克莫司的濃度，不適于其藥代動(dòng)力學(xué)分析［6］。LC －MS ／MS 法測(cè)定結(jié)果為他克莫司原形藥物濃度，能更準(zhǔn)確地說明藥物濃度－療效－不良反應(yīng)三者間的關(guān)系。同時(shí)，LC－MS／MS 法具有分析時(shí)間短、樣本處理快速、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)［7－8］，目前在國內(nèi)外已成為監(jiān)測(cè)患者他克莫司血藥濃度的主要方法。國內(nèi)他克莫司血藥濃度的監(jiān)測(cè)是基于各醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的自建方法，溯源鏈及方法缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。另外，實(shí)驗(yàn)室間的資質(zhì)與能力有較大差距，給監(jiān)管造成較大困難。同時(shí)，由于這些自建方法均未在《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目目錄（2013 版）》中，因此，其大規(guī)模開展面臨相關(guān)法規(guī)難題。本研究中根據(jù)體外診斷試劑（IVD）注冊(cè)法規(guī)的要求，開發(fā)了他克莫司LCMS／MS 試劑盒，產(chǎn)品溯源至美國藥典（USP），開展了試劑盒關(guān)鍵性能評(píng)價(jià)，并進(jìn)行了方法學(xué)比對(duì)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY I－S 型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（美國 Waters 公司）。

1.2 試藥

他克莫司標(biāo)準(zhǔn)品（USP，批號(hào)為R055E0；加拿大TLC Pharmaceutical Standards 公司，批號(hào)為 1418 －091A1；含量97.9%）；子囊霉素（加拿大 Toronto Research Chemicals 公司，批號(hào)為2－LWJ－45－1）；他克莫司測(cè)定試劑盒（蘇州藥明澤康生物科技有限公司）；兔全血（上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、甲酸、甲酸銨均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為 0.1%甲酸4 mmol／L 甲酸銨水溶液（A）－ 0.1% 甲酸 4 mmol／L 甲酸銨甲醇溶液（B），梯度洗脫 （0 ～0.2 min 時(shí) 80%A，0.2 ～ 0.8 min 時(shí) 80%A→2%A，0.8 ～1.4 min 時(shí) 2%A，1.4 ～1.5 min 時(shí) 2%A→80%A，1.5 ～1.8 min 時(shí)80%A）；流速為 0.6 mL ／min，柱溫為 60 ℃，進(jìn)樣量為 2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式，掃描類型為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；去溶劑化溫度為500 ℃；去溶劑化流速為1 100 L／h，錐孔流速為150 L／h；霧化壓力為7.0 Bar。他克莫司及內(nèi)標(biāo)子囊霉素MRM 信息見表1。

表1 他克莫司及內(nèi)標(biāo)子囊霉素MRM 參數(shù)Tab.1 MRM parameters of tacrolimus and internal standard ascomycin

2.2 校準(zhǔn)品和質(zhì)控品制備

稱取他克莫司標(biāo)準(zhǔn)品（TLC 公司）適量，用甲醇溶解制成他克莫司質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的貯備液；用甲醇稀釋，得他克莫司次級(jí)貯備液（10 μg／mL）；采用兔全血稀釋，得他克莫司高濃度兔全血溶液（200 ng／mL）；再與空白兔全血通過稱重稀釋法得到校準(zhǔn)點(diǎn)C6 溶液（50 ng／mL）；校準(zhǔn)點(diǎn)C6 溶液與空白兔全血采用稱重稀釋法得到校準(zhǔn)點(diǎn) C1 至校準(zhǔn)點(diǎn) C5 溶液，質(zhì)量濃度分別為 2，5，10，20，30 ng／mL。質(zhì)控品配制工藝與校準(zhǔn)品相同，由上述高濃度兔全血溶液與空白兔全血通過稱重稀釋法得到高濃度質(zhì)控點(diǎn)（HQC）溶液（30 ng／mL）；HQC 溶液與空白兔全血采用稱重稀釋法得到低質(zhì)量濃度質(zhì)控點(diǎn)（LQC）溶液（6 ng／mL）和中質(zhì)量濃度質(zhì)控點(diǎn)（MQC）溶液（15 ng／mL）。

2.3 溯源鏈建立

他克莫司測(cè)定試劑盒校準(zhǔn)品的溯源執(zhí)行GB ／T 21415 － 2008 標(biāo)準(zhǔn)［9］。他克莫司校準(zhǔn)品溯源至美國藥典他克莫司標(biāo)準(zhǔn)品。試劑盒以美國藥典他克莫司標(biāo)準(zhǔn)品建立溯源鏈，并以其為溯源鏈的終點(diǎn)。用美國藥典他克莫司標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)工作校準(zhǔn)品進(jìn)行定值，并以此建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)產(chǎn)品校準(zhǔn)品進(jìn)行定值（圖1）。在常規(guī)樣品檢測(cè)中，以產(chǎn)品校準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算常規(guī)樣本中他克莫司和其內(nèi)標(biāo)峰面積比值，并代入校準(zhǔn)曲線后得結(jié)果。

圖1 他克莫司試劑盒校準(zhǔn)品溯源鏈Note：a represents one or more existing measurement systems calibrated with primary or secondary calibrators，and b represents one or more manufacturer working calibrators or higher calibrators calibration.Fig.1 The traceability chain of tacrolimus kit

2.4 精密度性能評(píng)價(jià)

參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）頒布的EP5－A2 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精密度試驗(yàn)，主要涵蓋室內(nèi)精密度、批內(nèi)精密度、批間精密度和日間精密度。每天從3 個(gè)生產(chǎn)批次的試劑盒中分別抽取2 盒，每個(gè)生產(chǎn)批次獨(dú)立進(jìn)行試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析。精密度試驗(yàn)的樣本采用兔全血制備的溶液，包含低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度（6，15，30 ng ／mL）。

試驗(yàn)程序：1）2 位試驗(yàn)員均分別檢測(cè)每個(gè)分析批次；2）每個(gè)分析批次從3 個(gè)生產(chǎn)批次中分別抽取1 盒待評(píng)價(jià)試劑盒，檢測(cè)高、中、低3 個(gè)質(zhì)量濃度的精密度參考品，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定2 次；3）獲得20 d 的有效數(shù)據(jù)，試驗(yàn)分別由2 臺(tái)儀器間隔進(jìn)行；4）最終每個(gè)質(zhì)量濃度得到80 個(gè)檢測(cè)結(jié)果。統(tǒng)計(jì)每個(gè)分析批次各質(zhì)量濃度下的批內(nèi)及總精密度，分別用變異系數(shù)（CV批內(nèi)、CV總）表示，反映試劑盒真實(shí)的精密度參數(shù)［見表2，表中 Sr為預(yù)估重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差，ST為預(yù)估儀器內(nèi)或室內(nèi)精密度，為預(yù)估日間標(biāo)準(zhǔn)差，Srr為預(yù)估批間標(biāo)準(zhǔn)差），CV總＝，L，M，H 分別為低、中、高質(zhì)量濃度企業(yè)參考品］。由表2 可知，試劑盒總精密度范圍在4.07% ～5.57%，符合法規(guī)規(guī)定的總精密度要求。

表2 他克莫司試劑盒精密度性能評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.2 Performance evaluation of the precision of tacrolimus kit

2.5 臨床比對(duì)試驗(yàn)

選擇120 例臨床樣本，以他克莫司檢測(cè)試劑盒為評(píng)價(jià)試劑，選擇參考實(shí)驗(yàn)室方法為參比試劑進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)研究，評(píng)價(jià)試劑與參比試劑的相關(guān)性和一致性，同時(shí)評(píng)價(jià)EMIT 法試劑盒與參比試劑的相關(guān)性和一致性。EMIT 法采用均相酶免疫測(cè)定法來分析全血中他克莫司的濃度，檢測(cè)方法參考該試劑盒說明書進(jìn)行。參考實(shí)驗(yàn)室具有美國病理學(xué)會(huì)（CAP）認(rèn)證的相關(guān)檢測(cè)資質(zhì)，他克莫司檢測(cè)項(xiàng)目參考相關(guān)法規(guī)經(jīng)嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證，符合CAP 的認(rèn)證要求，臨床評(píng)價(jià)過程符合國家藥品監(jiān)督管理局的法規(guī)規(guī)定。

針對(duì)120 例臨床樣本檢測(cè)值分別做散點(diǎn)圖進(jìn)行相關(guān)性分析及一致性分析（Bland－Altman 分析，采用差值－均值圖）［10－13］。如圖 2 A 所示，以參比試劑檢測(cè)值（ X）為橫坐標(biāo)、評(píng)價(jià)試劑檢測(cè)值（ Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y1＝ 1.013 1 X1＋ 0.023 3，R2＝ 0.989 3，r ＝ 0.994 6≥0.975，表明兩方法相關(guān)性良好。

對(duì)比試劑（EMIT 法）與參比試劑臨床樣本檢測(cè)值的相關(guān)性分析見圖2 B。由于EMIT 法對(duì)120 例臨床樣本中的7 例檢測(cè)值超出其線性范圍的高點(diǎn)（30 ng／mL），因此EMIT 法與參比試劑檢測(cè)值的相關(guān)性及一致性分析以剔除7 例后的113 例樣本進(jìn)行分析。以參比試劑檢測(cè)值（ X）為橫坐標(biāo)、免疫法測(cè)定值（ Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y2＝ 20.922 2 X2＋ 2.427 2，R2＝0.677 0，r ＝ 0.822 8≤0.975，表明兩方法相關(guān)性較差。

評(píng)價(jià)試劑與參比試劑臨床樣本檢測(cè)值的一致性分析見圖3 A，以2 種方法測(cè)定的均值（X）為橫坐標(biāo)、差值（Y）為縱坐標(biāo)。考慮到抽樣誤差，上下 ±1.96 SD 2 條水平實(shí)線為一致性界限的95%置信區(qū)間上下限，中間實(shí)線代表2 種方法檢測(cè)值差值的均值。2 種方法檢測(cè)值差值均值為 0.23 ng ／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為 0.77，差值一致性界限的可信區(qū)間為 －1.524 ～1.980 ng／mL，在一致性界限的可信區(qū)間內(nèi)共有 117 個(gè)點(diǎn)，占 97.50%（117 ／120），滿足95%的點(diǎn)落在一致性界限內(nèi)，表明評(píng)價(jià)試劑與參比試劑的測(cè)定結(jié)果一致性良好。

圖2 樣本他克莫司檢測(cè)方法間的相關(guān)性A.Evaluation and reference reagents B.EMIT and reference reagentsFig.2 Correlation analysis of different measuring methods of tacrolimus from clinical samples

圖3 樣本他克莫司檢測(cè)方法間的一致性A.Evaluation and reference reagents B.EMIT and reference reagentsFig.3 Consistency analysis of different measuring methods of tacrolimus from clinical samples

對(duì)比試劑（EMIT 法）與參比試劑臨床樣本檢測(cè)值的一致性分析見圖3 B，2 種方法檢測(cè)值差值的均值為1.30 ng／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為 3.56，差值的一致性界限的可信區(qū)間為 －6.816 ～9.422 ng／mL，在一致性界限的可信區(qū)間內(nèi)共有 106 個(gè)點(diǎn)，占 93.81% （106 ／113），未滿足95%的點(diǎn)落在一致性界限內(nèi)，表明免疫法與參比試劑的測(cè)定結(jié)果一致性較差。

2.6 正確度性能評(píng)價(jià)

正確度的評(píng)價(jià)主要有以下2 種方式：1）與國家標(biāo)準(zhǔn)品（或國際標(biāo)準(zhǔn)品）的靶值進(jìn)行比對(duì)，觀察對(duì)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果的偏差情況，評(píng)價(jià)試劑實(shí)測(cè)值與相應(yīng)國家（國際）標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)偏差應(yīng)不超過±15%。2）使用配制的已知分析物濃度的樣本，檢測(cè)結(jié)果和配制后應(yīng)得的靶值比較，計(jì)算回收率（應(yīng)在 85% ～ 115% ）［14］。由于無他克莫司檢測(cè)的國家參考品，國際標(biāo)準(zhǔn)品也難以獲取，本研究中采用了第2 種方案，即制備已知質(zhì)量濃度的20 例全血樣本，其質(zhì)量濃度覆蓋方法的線性范圍，對(duì)臨床樣本進(jìn)行編號(hào)及分裝后分別采用實(shí)驗(yàn)室自建方法（參比試劑、LC－MS／MS 法）、質(zhì)譜法試劑盒（LC －MS ／MS 法，評(píng)價(jià)試劑）、免疫法試劑盒（EMIT 法，對(duì)比試劑）進(jìn)行雙份測(cè)定，統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)試劑的正確度（回收率）。由表3 可見，評(píng)價(jià)試劑20 例樣本回收率為 93.1% ～97.9%，樣本檢測(cè)值正確度高，符合分析性能要求。

本研究中對(duì)LC－MS／MS 法和EMIT 法試劑盒與參比方法間的相關(guān)性進(jìn)行了分析。質(zhì)譜試劑盒與參比試劑樣本檢測(cè)值的相關(guān)性分析見圖4 A。以參比試劑檢測(cè)值（ X）為橫坐標(biāo)，質(zhì)譜試劑（評(píng)價(jià)試劑）檢測(cè)值（ Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y3＝1.034 3 X3－0.399，R2＝ 0.997 9，r ＝ 0.998 9≥0.975，表明 2 種方法相關(guān)性良好。圖4 B 中，以參比試劑檢測(cè)值（ X）橫坐標(biāo)、免疫法檢測(cè)值（ Y）縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y4＝1.049 3X4＋1.364 2，R2＝0.974 6，r ＝0.987 2≥0.975，表明2 種方法相關(guān)性良好。免疫法與參比方法檢測(cè)值相比，偏差范圍為－3.2% ～29.9%，檢測(cè)值整體偏高，而質(zhì)譜試劑盒與參比方法檢測(cè)值的偏差范圍為－10.9% ～7.7%，表明質(zhì)譜法試劑盒檢測(cè)值的正確度優(yōu)于免疫法。

3 討論

3.1 他克莫司試劑盒校準(zhǔn)品溯源鏈

他克莫司測(cè)定試劑盒具有完整的溯源鏈，產(chǎn)品校準(zhǔn)品溯源至美國藥典他克莫司標(biāo)準(zhǔn)品，能保證測(cè)量結(jié)果在不同時(shí)間、不同空間的可比性，以及產(chǎn)品質(zhì)量的可控性和可延續(xù)性，從而保證診斷的正確。校準(zhǔn)品的溯源性保證了他克莫司試劑盒在臨床評(píng)價(jià)中與參比試劑的相關(guān)性及一致性，在正確度性能評(píng)價(jià)中回收率為93.1% ～97.9%。

表3 他克莫司試劑盒正確度性能評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.3 Performance evaluation of the accuracy of tacrolimus kit

3.2 他克莫司試劑盒的精密度

圖4 加標(biāo)樣本他克莫司檢測(cè)方法間的相關(guān)性A.Spiked samples of evaluation and reference reagents B.Spiked samples of EMIT and reference reagentsFig.4 Correlation between the different measuring methods of tacrolimus from the spiked samples

精密度是體外診斷試劑基本分析性能之一，也是其他方法學(xué)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外關(guān)于精密度性能評(píng)價(jià)的方案多種多樣，他克莫司測(cè)定試劑盒參考CLSI 頒布的EP5－A2 進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，結(jié)果符合法規(guī)規(guī)定的精密度要求。

3.3 他克莫司不同檢測(cè)方法間的正確度與一致性

正確度是體外診斷試劑最重要的分析指標(biāo)，是分析測(cè)量范圍、參考區(qū)間評(píng)價(jià)等試驗(yàn)的基礎(chǔ)。一個(gè)可靠的檢測(cè)方法必須保證較高的準(zhǔn)確度，即滿足正確度和精密度的要求。溯源鏈的建立保證了量值傳遞的正確度。

監(jiān)測(cè)血藥濃度的傳統(tǒng)方法，如酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法均為對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行間接檢測(cè)，各廠家抗體無法標(biāo)準(zhǔn)化，抗體間的交叉反應(yīng)導(dǎo)致了特異性不足，影響了方法的準(zhǔn)確度。質(zhì)譜技術(shù)是測(cè)量分子質(zhì)荷比的分析方法，是對(duì)檢測(cè)物質(zhì)直接分析的技術(shù)，由于質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)具有特異性好、靈敏度高、通量高等特點(diǎn)，已逐漸成為血藥濃度監(jiān)測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”［15］。目前，LC － MS ／MS 法的操作細(xì)則還是以實(shí)驗(yàn)室自建方法為主，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的規(guī)范操作規(guī)程，影響了臨床應(yīng)用的推廣。按體外診斷試劑注冊(cè)法規(guī)要求開發(fā)的他克莫司LC－MS／MS 試劑盒，檢測(cè)結(jié)果的正確度和一致性高于免疫法。試劑盒的推廣將有利于精準(zhǔn)調(diào)整劑量，實(shí)施個(gè)體化給藥，以減少毒副反應(yīng)、排異反應(yīng)的發(fā)生，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)賦能。