高小龍，仝麗娜，郭承意，周 雷，楊峻鵬，張 誠，李增魁，文 英，李 英

(青海大學農牧學院，西寧 810000)

新城疫（Newcastle disease，ND）是除禽流感外危害養(yǎng)禽業(yè)最重要的一種傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經濟損失[1]。引起ND 的病原是新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），NDV 病毒在分類上屬于負鏈RNA 目（Mononegavirales）、副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus）[2]。NDV基因組為單股負鏈不分階段RNA，基因結構為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次編碼核衣殼蛋白（nucleo-capsid protein，NP）、磷蛋白（phosphor protein，P）、基質蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F）、血凝素-神經氨酸酶蛋白（heamagglutinin-neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（large protein，L）等6 種結構蛋白。除此之外，P 基因通過RNA 基因編輯，在mRNA 的484 位插入1 個或2 個G 還可編碼額外的2 個非結構蛋白，即V 和W 蛋白[3]。與其他副黏病毒科病毒一樣，NDV V 蛋白與NDV 病毒拮抗宿主干擾素有關，突變或缺失V 蛋白會使病毒的復制能力和毒力受到嚴重影響，甚至喪失感染宿主細胞的能力[4-6]。V 蛋白由239 個氨基酸構成，其中N 端135 個氨基酸和P 蛋白N 端相同，C 端的氨基酸則不同，但不同毒株V 蛋白C 端（C-termimal domain, CTD）均存在高度保守鋅指結構，且V 蛋白發(fā)揮拮抗宿主干擾素功能的主要主要取決于CTD 區(qū)[7]。因此，探究V 蛋白CTD 區(qū)的功能在揭示V 蛋白功能上具有重要意義，但由于V 蛋白N 端和P 蛋白N 端相同，研究V蛋白功能的一個難點就是缺少能和V 蛋白反應的特異性抗體。

納米抗體（Nanobodies，Nbs）衍生于駱駝體內天然存在的重鏈抗體，是目前天然存在的最小抗體片段。具有分子量小、親和力高、穩(wěn)定性強、易制備且可識別常規(guī)單克隆抗體不易識別的表位等優(yōu)點，是蛋白質功能研究的重要工具[8]。為從前期構建的納米抗體酵母雙雜交非免疫文庫[9]中篩選V 蛋白CTD 區(qū)納米抗體，本研究構建了V 蛋白CTD 區(qū)誘餌質粒，并評價了誘餌質粒的自激活能力和毒性，為V 蛋白特異性納米抗體篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、試劑

NDV F48E9 毒株由西北農林科技大學動物醫(yī)學院楊增岐教授饋贈，保存于青海大學農牧學院獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室。pGBKT7 載體、Y2H Gold 酵母菌購自Clontech 公司。EasyPure? Viral DNA/ RNA Kit 和EasyScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 均購自北京全式金公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工生物；2×Taq PCR Mix，2K plus DNA marker 購自北京康為世紀生物科技有限公司；限制性內切酶購自Fermentas 公司。其他無機試劑均為國產分析純。

1.2 引物及基因合成

根據GenBank 上公布的NDV F48E9 V 基因序列，設計1 對擴增V 蛋白C 端基因的引物，引物上下游分別加入EcoRI 和BamHI 酶切位點（如引物下劃線部分），引物序列如下VCTD-F：GGAATTCA TGGTTGAGTCCCCAG，VCTD-R：CGGGATCCT TACTTACCCTCTGTGA，設計的引物由上海生工生物股份有限公司合成。

1.3 RNA 提取與第一鏈cDNA 合成

取保存的F48E9 病毒尿囊液300 μL，根據EasyPure? Viral DNA/ RNA Kit 操作說明提取NDV病毒RNA。取提取的RNA 4 μL 進行反轉錄，以合成第一鏈cDNA，其余的RNA 保存于-80 ℃?zhèn)溆谩７崔D錄體系如下：RNA 5 μL，Oligo（dT） 0.5 μL，Random primer 0.5 μL，2×ES Reaction Mix 10 μL，EazyScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，RNase-free 水補足至20 μL；反轉錄反應條件如下：25 ℃ 10 min，42 ℃ 1 h，85 ℃ 5 s。合成的cDNA 保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 V 蛋白C 端基因的擴增

以上述合成的cDNA 為模板，以VCTD-F 和VCTD-R 為引物，在Taq DNA 聚合酶的作用下，通過PCR 擴增獲得VCTD 基因片段。反應體系如下：2×Taq Mix 50 μL，VCTD-F 和VCTD-R 引物各2 μL，cDNA 3 μL，加滅菌水補足100 μL；反應條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30s，58 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收330 bp 大小的目的條帶。

1.5 pGBKT7-VCTD 載體的構建

用EcoR I 和BamH I 限制性內切酶酶切VCTD基因片段和pGBKT7 空載體。酶切體系如下：EcoR I 0.5 μL，BamH I 1 μL，10×Tango buffer 4 μL，VCTD 基因膠回收產物8 μL（或pGBKT7 質粒 5 μL），滅菌水補足20 μL，37 ℃酶切2 h。酶切產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收目的條帶。用T4 DNA 連接酶連接VCTD 和pGBKT7，連接體系如下：10×T4 DNA ligase buffer 1 μL，T4 DNA ligase 1 μL，VCTD 酶切膠回收產物4 μL，pGBKT7酶切膠回收產物2 μL，滅菌水補足10 μL；連接條件：16 ℃連接過夜。次日轉化至DH5α 感受態(tài)細胞，轉化產物涂布LB 平板（含卡那霉素50 μg·mL-1）后，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約12～16 h，挑取平板上的陽性克隆進行菌落PCR 鑒定。菌落PCR 鑒定陽性的克隆轉接至5 mL 液體LB（含卡那霉素50 μg·mL-1）中搖菌提取質粒，并做雙酶切鑒定，酶切鑒定正確后送生工生物測序，測序正確后命名為pGBKT7-VCTD。

1.6 pGBKT7 誘餌質粒自激活能力檢測

根據Yeastmaker Yeast Transformation System 2 User Manual，取0.5 μL pGBKT7-VCTD 質粒（100 ng）轉化至Y2H Gold 酵母感受態(tài)細胞中，同時設立pGBKT7-p53 和pGADT7-T 共轉Y2H Gold 為陽性對照。轉化產物涂布SD/-Trp/X-α-Gal 平板、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 或DDO/X-α-Gal/AbA 平板，置于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d 后，觀察平板上的菌落生長情況及其顏色，以鑒定GBKT7-VCTD有無自激活能力。

1.7 pGBKT7-VCTD 誘餌質粒毒性檢測

將0.5 μL pGBKT7-VCTD（100 ng）和pGBKT7空載體分別轉化至Y2H Gold 酵母感受態(tài)細胞中，轉化產物涂布SD/-Trp 平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d后，觀察平板上菌落大小。同時，從上述2 個平板上各挑取直徑為2 mm左右的單菌落接種到6 mL液體SD/-Trp 培養(yǎng)基中，置于30℃搖床中，250 r·min-1培養(yǎng)，分別于接種后0、3、6、9、12 和15 h 取菌液，用分光光度計測定OD600值，繪制生長曲線，以驗證pGBKT7-VCTD 誘餌質粒是否有毒性。

2 結果與分析

2.1 VCTD 基因的擴增

從300 μL F48E9 病毒尿囊液中提取的RNA 經超微量紫外分光光度計測定，濃度為400 ng·μL-1，A260/280為1.97。以此RNA 為模板進行反轉錄，合成cDNA。取cDNA 3 μL 為模板，在Taq DNA 聚合酶作用下進行PCR 反應，結果如圖1 所示，顯示成功擴增出330 bp 左右的目的條帶，將此330 bp 的目的條帶切膠回收，即為VCTD 基因。

圖1 V 基因C 端片段的擴增Figure 1 Amplification of V gene C terminal region

2.2 pGBKT7-VCTD 載體的構建

將膠回收的VCTD 基因和pGBKG7 載體用EcoR I 和BamH I 作雙酶切，回收VCTD 和pGBKT7酶切產物，用T4 DNA 連接酶進行連接，連接產物轉化DH5α 感受態(tài)后，涂布LB 平板（含卡那霉素50 μg·mL-1），37 ℃倒置培養(yǎng)約13 h 后，從平板上挑取3 個單克隆做菌落PCR 鑒定，結果如圖2（a）。挑取菌落PCR 鑒定陽性的克隆接種5 mL 液體LB培養(yǎng)基（卡那霉素濃度50 μg·mL-1），置搖床中220 r·min-1震蕩培養(yǎng)10 h，抽提質粒，并對質粒用EcoRI 和BamHI 作雙酶切鑒定，結果如圖2（b），顯示成功切出330 bp 左右的目的條帶。將酶切正確的3個克隆送上海生工生物測序，顯示構建正確，命名為pGBKT7-VCTD。

圖2 pGBKT7-VCTD 誘餌質粒構建Figure 2 Construction of bait plasmid pGBKT7-VCTD

2.3 自激活能力檢測

將構建的pGBKT7-VCTD 取1 μL 轉化至Y2H Gold 酵母感受態(tài)細胞中，轉化產物涂布SD/-Trp/X-α-Gal平板和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，平板上菌落生長情況及顏色如表1 所示。

表1 自激活驗證Table 1 Test for autoactivation

2.4 pGBKT7-VCTD 誘餌質粒毒性檢測

pGBKT7-VCTD 和pGBKT7 質粒轉化產物分別涂布SD/-Trp 平板，30 ℃倒置培養(yǎng)5 d 后，Y2H Gold菌落大小均為（3.30±0.17）mm（pGBKT7-VCTD），（3.37±0.15）mm（pGBKT7），無顯著差異（P＞0.05）。同時，從上述2 個平板上各挑取直徑為3 mm的單菌落接種液體SD/-Trp 培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并繪制生長曲線，曲線如圖 3 所示，轉化有pGBKT7-VCTD 和pGBKT7 質粒的Y2H Gold 菌液的OD600值無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 誘餌菌生長曲線Figure 3 Growth curve of Y2H Gold bait

3 討論

篩選納米抗體的方法包括噬菌體展示技術、酵母展示技術、酵母雙雜交技術和核糖體展示技術[10]。相對于其他3 種技術而言，運用酵母雙雜交技術篩選納米抗體的優(yōu)點在于：首先，避免了前期抗原的制備，通過構建誘餌質粒便可進行篩庫，省時省力，且誘餌質粒在酵母細胞內表達的靶抗原具有翻譯后修飾能力；其次，文庫構建中，納米抗體基因被直接插入酵母質粒上并在酵母細胞中表達，翻譯出的納米抗體在結構上更能反映真核細胞中天然抗體的結構；最后，納米抗體篩選的全程均是在酵母細胞內進行，對于篩選靶向類似V 蛋白等在胞內發(fā)揮作用的蛋白的抗體而言，是一種極具優(yōu)勢的胞內納米抗體篩選方法[11]。并且，利用酵母雙雜交成功篩選出特定抗原納米抗體已有報道[12-13]。為研究NDV 病毒V 蛋白功能，本研究擬利用酵母雙雜交技術，從實驗室前期構建的納米抗體酵母雙雜交文庫篩選NDV V 蛋白C 端特異性納米抗體。

由于酵母雙雜交技術是利用DNA-BD（DNA binding domain, DNA-BD）融合誘餌蛋白與DNA-AD（activation domain, DNA-AD）融合待測蛋白相互作用激活下游LacZ 和HIS3 等報告基因的表達來實現篩選，因此利用酵母雙雜交文庫中篩選VCTD 區(qū)域特異性納米抗體的前提是構建的誘餌質粒無自激活能力和毒性[13]。在誘餌質粒構建完成后，通過PEG/LiAc 法將誘餌質粒轉化至Y2H Gold酵母感受態(tài)細胞，轉化產物涂布-Trp/X-α-Gal 平板后，平板上長出直徑約2 mm 的白色克隆，表明質粒轉化成功，涂布篩選壓力更好的-Trp/X-α-Gal/Aba平板后，未長出克隆，且陽性對照成立，表明誘餌質粒無自激活能力。為進一步驗證誘餌質粒無毒性，在將轉化產物涂布SD/-Trp 平板后，平板上長出直徑和對照一樣大小的克?。≒＞0.05），挑取克隆接種SD/-Trp 液體培養(yǎng)基后，生長曲線與對照菌無顯著差異（P＞0.05），表明誘餌質粒無毒性。本研究成功構建了NDV V 蛋白C 端誘餌質粒，且對誘餌質粒自激活能力和毒性進行了評價，為利用酵母雙雜交篩選V 蛋白C 端特異性納米抗體奠定基礎。