苗文娟，陳 強，曾 妍，朱雙杰，董藝凝

(滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，滁州 239000)

滁菊又名“甘菊”、“白菊”，位列中國“四大藥菊”之一[1-2]。因富含多酚以及黃酮類活性成分[3-5]，新鮮滁菊在采收、加工及貯藏過程中均易發(fā)生褐變，嚴重影響產(chǎn)品價值。有研究表明，多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）和過氧化物酶（Peroxidase,POD）是引起菊花褐變的關(guān)鍵酶[6]，PPO 催化植物體內(nèi)的酚類底物氧化成醌，醌類物質(zhì)再相互聚合形成褐色化合物，導(dǎo)致植物組織褐變[7-8]。朱玉蕓[6]對亳菊的酶促褐變相關(guān)酶及其品質(zhì)影響進行了研究，其結(jié)果表明酶促褐變導(dǎo)致亳菊酚酸類物質(zhì)含量顯著下降，降低了亳菊的抗氧化性，影響了亳菊的藥效和品質(zhì)。目前，尚無研究者開展關(guān)于滁菊酶促褐變的相關(guān)研究。

在酶的分離純化方面，多采用鹽析、離子交換色譜以及凝膠過濾色譜等分離純化手段[9-11]。但由于這些方法在操作過程中涉及操作周期長、提取率低、性能設(shè)備要求高等缺點，近年來，有一些新型分離純化方法，如雙水相萃取法、三相分離法等開始應(yīng)用于酶的分離純化[12-14]。三相分離法通過在提取液中加入無機鹽和有機溶劑，可以選擇性地將需要的酶分配到其中一相，蛋白質(zhì)和油脂等其他雜質(zhì)分配到其他相中，從而實現(xiàn)酶的純化目的[15-16]。三相分離是一種簡單、快速和易于放大的分離純化酶的方法，不需要硫酸銨鹽析時的多次分級沉淀[16]，也比柱層析法更加經(jīng)濟綠色環(huán)保。羅磊等[17]使用三相分離法對金銀花POD 進行了分離純化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)三相分離后金銀花POD 純化倍數(shù)達到5.849；Vetal等[18]的研究表明三相分離法是一種提取和部分純化桔皮POD 的理想方法；Gagaoua 等[19]采用三相分離法從無花果樹中純化蛋白酶，其研究表明三相分離法是一種簡單、經(jīng)濟、快捷的純化蛋白酶的方法。但目前尚鮮見關(guān)于利用三相法分離純化滁菊PPO的研究報道。鑒于此，本研究采用三相分離法純化滁菊PPO，并對其酶學(xué)特性進行分析，以期為滁菊采后褐變的控制提供一些理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滁菊，2019 年10 月采自滁州市金玉滁菊生態(tài)科技有限公司種植基地；鄰苯二酚（化學(xué)純），南京化學(xué)試劑股份有限公司；考馬斯亮藍G250，牛血清白蛋白，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硫酸、氨水、叔丁醇，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L3S 型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；BSA124S-CW 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；超聲波清洗器，寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；HHS 型恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；TGL-16M 型高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PHS-3C 型pH 計，上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 滁菊PPO粗酶液的提取 稱取新鮮滁菊10 g置于研缽中，加入20 mL 預(yù)冷的0.1 mol·L-1，pH 6.5的磷酸鹽緩沖液，快速研磨后用絹布過濾，濾渣重新加入pH 6.5 磷酸鹽緩沖液重復(fù)上述操作，合并2次濾液于4 ℃、9 000 r·min-1條件下離心15 min，上清液轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶并定容，分析粗酶液中PPO 酶活性和蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 滁菊PPO 三相分離純化 參照 Gagaoua[19]與羅磊[17]等的方法進行三相分離純化并稍作修改。取一定體積滁菊PPO 粗酶液至50 mL 離心管中，加入一定量的硫酸銨，快速渦旋振蕩溶解，調(diào)節(jié)溶液至一定pH 值，然后按照一定體積比加入叔丁醇，渦旋混合后室溫靜置一定時間，4 000 r·min-1離心10 min 以促進三相分離。吸除上層有機相和下層水相，中間沉淀層用0.1 mol·L-1、pH 6.5 的磷酸鹽緩沖液溶解，透析除鹽后定容至10 mL，對其酶活和蛋白質(zhì)含量進行測定。分別考察三相分離純化體系的硫酸銨添加量、pH 值和提取液與叔丁醇的體積比和三相分離時間對滁菊PPO 純化效果的影響。

（1）pH 值。取10 mL 滁菊PPO 粗酶液，添加3.0 g 硫酸銨，固定提取液與叔丁醇的體積比為1:1，三相分離靜置時間1 h，考察三相分離pH 值（pH 3 ～ 8）對滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)的影響。

（2）硫酸銨添加量。在最優(yōu)的pH 條件下，固定提取液與叔丁醇的體積比為1:1，三相分離靜置時間1 h，考察硫酸銨的添加量（0.20 ～ 0.60 g·mL-1）對滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)的影響。

（3）體積比。在最優(yōu)pH 值及硫酸銨添加量條件下，考察提取液與叔丁醇的體積比（1:0.5、1:1、1:1.5、1:2 和1: 2.5）對滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)的影響。

（4）三相分離時間。在最優(yōu)pH 值、硫酸銨添加量和提取液與叔丁醇的體積比條件下，考察三相分離時間（5 ～ 80 min）對滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)的影響。

1.3.3 滁菊PPO 酶活測定 參照何軍忠等[20]的方法并加以修改：取2.0 mL 磷酸鹽緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 6.5）于比色皿中，加入0.3 mL 鄰苯二酚底物溶液（0.35 mol·L-1），加入0.2 mL PPO 酶提取液后迅速混勻，立即放入分光光度計于420 nm 處測定吸光值（動力學(xué)測量模式），從0 s 開始每20 s讀數(shù)1 次，計時1 min。每組平行測定3 次并作空白對照。滁菊PPO 酶活力定義為：每分鐘每克滁菊鮮樣吸光值增加0.01 為一個酶活力單位（U·g-1）。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍G 250比色法測定滁菊PPO 粗酶提取液和純化后樣品中蛋白質(zhì)含量，并計算純化前后滁菊PPO 酶的比活力、純化倍數(shù)和回收率。

1.3.5 滁菊PPO 酶學(xué)特性分析 （1）pH 對滁菊PPO 活性的影響：配制0.1mol·L-1、pH 4.0 ～ 9.5 范圍內(nèi)的磷酸鹽緩沖液，按照1.3.3 的方法測定PPO活力，考察pH 對滁菊PPO 活性的影響。

（2）溫度對滁菊PPO 活性的影響：取適量磷酸鹽緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 6.5）和鄰苯二酚溶液（0.35 mol·L-1）分別置于試管中，在20 ～ 70℃下水浴保溫，迅速轉(zhuǎn)移到比色皿中混合均勻，立即加入0.2 mL 粗酶提取液，按照1.3.3 方法測定PPO 活力，考察溫度對滁菊PPO 活性的影響。

（3）底物濃度對滁菊PPO 活性影響：在最適pH 值條件下，分別以不同濃度的鄰苯二酚（0.10～0.50 mol·L-1）作為底物，按照1.3.3 方法測定PPO活力，考察底物濃度對滁菊PPO 活性的影響。根據(jù)Lineweaver-Burk 作圖法計算米氏常數(shù)和最大酶促反應(yīng)速率。

（4）滁菊PPO 的熱穩(wěn)定性：將滁菊PPO 粗酶液分別在50、60 和70 ℃水浴中保溫1～ 25 min 后取出，待粗酶液冷卻至25 ℃后，按照1.3.3 方法測定滁菊PPO 活力，以25 ℃所測酶活力為100%，考察溫度和保溫時間對滁菊PPO 活性的影響。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 所有試驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理，Origin 2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 值對滁菊PPO 純化效果的影響

pH 值是三相分離純化過程的一個重要參數(shù)[15]，蛋白質(zhì)鹽析的效率取決于反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)所帶的凈電荷，而凈電荷高度依賴pH 值，因此實驗研究了pH 值對滁菊PPO 三相分離純化效果的影響。由圖1 可以看出，在實驗設(shè)置的pH 梯度中，PPO 酶活回收率和純化倍數(shù)整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。pH 值在3 ～ 6 時，滁菊PPO 酶活回收率和純化倍數(shù)均呈上升趨勢，且在pH 值等于6 時，酶活回收率和純化倍數(shù)達到最大，達到最佳純化效果。

圖1 pH 值對滁菊PPO 純化效果的影響Figure 1 Effect of pH on purification effect of Chuju PPO

2.2 硫酸銨質(zhì)量濃度對滁菊PPO 純化效果的影響

硫酸銨濃度在三相分離純化過程起著重要作用[21-22]，因為蛋白質(zhì)的溶解度受到溶液離子強度的影響，在較高的鹽濃度下，水分子受到鹽離子的吸引，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互聚集沉淀。在PPO粗酶液與叔丁醇的體積比為1:1 時，考察硫酸銨的添加量（0.20 ～ 0.60 g·mL-1）對滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)的影響。由圖2 可見，滁菊PPO 的酶活回收率和純化倍數(shù)隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增加整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，硫酸銨濃度在0.40 g·mL-1時，酶活回收率和純化倍數(shù)達到最大值。隨著硫酸銨質(zhì)量濃度進一步增加，酶蛋白的純化效果反而降低，這可能是因為隨著硫酸銨質(zhì)量濃度增大，過高的離子強度會結(jié)合大量的水分子，產(chǎn)生強烈的鹽析效應(yīng)，使雜蛋白疏水沉淀[17,23]。因此，以質(zhì)量濃度0.40 g·mL-1的硫酸銨進行滁菊PPO 純化最佳。

圖2 硫酸銨質(zhì)量濃度對滁菊PPO 純化效果的影響Figure 2 Effect of ammonium sulfate concentration on the purification effect of Chuju PPO

圖3 提取液與叔丁醇體積比對滁菊PPO 純化效果的影響Figure 3 Effect of the volume ratio of extract to t-butanol on the purification of Chuju PPO

2.3 提取液與叔丁醇體積比對滁菊PPO純化效果的影響

由于叔丁醇具有合適的分子大小和支鏈結(jié)構(gòu)，因此它不容易滲透到蛋白質(zhì)分子內(nèi)部而引起蛋白質(zhì)變性，多篇文獻報道了叔丁醇是三相分離純化的最佳有機溶劑[24-25]。叔丁醇作為一種常見的有機溶劑，與硫酸銨一起相互增強離子強度、滲透壓和排它效應(yīng)等物理化學(xué)效應(yīng)，使蛋白質(zhì)作為中間層在水相和有機相之間分配[26]。因此，本試驗以叔丁醇作為三相分離純化的有機相，考察提取液與叔丁醇的體積比（1: 0.5、1:1、1:1.5、1:2 和1:2.5）對滁菊PPO回收率和純化倍數(shù)的影響。

由圖3 可知，滁菊PPO 酶活回收率和純化倍數(shù)隨著叔丁醇和提取液體積比的提高先上升后下降，當(dāng)提取液與叔丁醇體積比為1:1.5 時，滁菊PPO 酶活回收率和純化倍數(shù)最高。這可能是因為隨著叔丁醇加入量的提高，可以從水相中吸收更多的水，從而導(dǎo)致水相中硫酸銨鹽濃度增加，提高蛋白質(zhì)在兩相界面處的分離，當(dāng)達到合適的體積比時，蛋白質(zhì)回收率和純化倍數(shù)都達到最大；當(dāng)叔丁醇加入量過多時，提取液介電常數(shù)降低導(dǎo)致雜蛋白也沉淀，同時過量的叔丁醇破壞了蛋白質(zhì)表面的水化層結(jié)構(gòu)，部分酶變性失活，純化效果降低。所以酶蛋白純化效果隨著提取液與叔丁醇體積比增大先上升后下降。

因此，采用三相法提取滁菊PPO 時，使用的叔丁醇體積應(yīng)是酶粗提液的1.5 倍，在此條件下滁菊PPO 能夠達到最佳純化效果。

2.4 三相分離時間對滁菊PPO 純化效果的影響

在加入叔丁醇后，體系會形成三相，但中間沉淀層富含蛋白容易發(fā)生乳化現(xiàn)象?，F(xiàn)考察三相分離的靜置時間對滁菊PPO 純化效果的影響，結(jié)果（表1）表明，三相分離過程中靜置時間對滁菊PPO 回收率和純化倍數(shù)沒有促進作用，經(jīng)靜置5 ～ 80 min后離心，中間相均可形成一層薄薄的蛋白沉淀層，經(jīng)回收后測定其酶活回收率在79.2% ～ 87.7%之間，純化倍數(shù)在3.1 ～ 4.2 倍之間。由此可見，在三相分離純化蛋白質(zhì)過程中，在加入叔丁醇混勻后即開始離心分離，可以縮短三相分離的時間。

表1 三相分離時間對滁菊PPO 純化效果的影響Table 1 Effect of three-phase separation time on the purification of Chuju PPO

綜上，從回收率和純化倍數(shù)兩個方面對滁菊PPO 的三相分離條件進行了分析，結(jié)果表明在三相分離過程中，硫酸銨濃度、pH、提取液和叔丁醇的體積比均對三相分離的結(jié)果有影響，三相分離靜置時間對其影響不大。經(jīng)三相分離后，滁菊PPO 酶的平均純化倍數(shù)達到4.3 倍。王劍鋒等[27]采用三相分離和凝膠色譜對α-半乳糖苷酶進行純化，其結(jié)果顯示α-半乳糖苷酶經(jīng)三相分離后純化倍數(shù)達到21.6，經(jīng)Sephadex G-100 凝膠過濾色譜分離后純化倍數(shù)達到54.8，但經(jīng)凝膠過濾色譜分離后回收率僅為27.3%；Nkya 等[9]對菊科植物茼蒿(Chrysanthemum coronariumL.)中的PPO 進行了分離純化，采用硫酸銨分級分離、離子交換色譜、疏水色譜和凝膠過濾色譜分離后，茼蒿PPO 的純化倍數(shù)為32，回收率為16%。由此可見三相分離對酶的純化屬于初級純化，純化倍數(shù)不高，但該法回收率高，具有經(jīng)濟、快速的優(yōu)點，可以大規(guī)模使用。

2.5 滁菊PPO 酶學(xué)特性分析

2.5.1 pH 值對滁菊PPO 活性的影響 由圖4 可見，滁菊PPO 對pH 值的變化較敏感，在實驗分析的pH值5.0 ～ 9.0范圍內(nèi)，滁菊PPO 的活性先增大后減小，pH 值為6.5 時，滁菊PPO 活性最強。當(dāng)pH＞7 以后，滁菊PPO 酶活顯著下降；在pH 9.0 時，滁菊PPO 的殘存酶活降低至24%。由此可見，當(dāng)以鄰苯二酚為底物時，其反應(yīng)的最適pH 值為6.5，與紅果枸杞PPO[28]最適pH 值一致。葡萄[29]PPO 的最適pH值為5.0，亳菊[6]和八角蓮[20]PPO 的最適pH 值均為7.0，說明不同來源的原材料的最適反應(yīng)pH 有較大差異，根據(jù)滁菊PPO 的性質(zhì)特點，可以加入抗壞血酸等有機酸抑制PPO 引起的酶促褐變。

圖4 pH 值對滁菊PPO 酶活性的影響Figure 4 Effect of pH on enzyme activity of Chuju PPO

2.5.2 溫度對滁菊PPO 活性的影響 由圖5 可知，在實驗設(shè)置的溫度范圍內(nèi)（20 ～ 80 ℃），滁菊PPO活力總體呈先上升后下降的趨勢。在30 ℃時酶活最大，為787 U·g-1；當(dāng)溫度高于30 ℃時，酶活開始下降，當(dāng)反應(yīng)溫度為80 ℃時，滁菊PPO 活性僅為30 ℃時的18.96%。出現(xiàn)這種趨勢的原因是因為溫度對酶的雙重作用，適當(dāng)?shù)纳郎厥狗肿娱g運動加劇，加快反應(yīng)速率，促進酶促反應(yīng)，但溫度過高會使酶活性部位構(gòu)象變化從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活。因此，滁菊PPO 的最適反應(yīng)溫度是30 ℃，與八角蓮PPO[20]等一致，與紅果枸杞[28]（36 ～ 40 ℃）、水蜜桃[30]（40 ℃）、蓮子[31]（20 ℃）等最適反應(yīng)溫度有一定差異。

圖5 溫度對滁菊PPO 酶活性的影響Figure 5 Effect of temperature on enzyme activity of Chuju PPO

2.5.3 底物濃度對滁菊PPO 的影響 PPO 酶促褐變形成的物質(zhì)基礎(chǔ)有底物（酚類）、酶蛋白和氧氣。多項研究表明，鄰苯二酚是PPO 的最適底物。在本試驗中，研究了鄰苯二酚底物濃度變化對滁菊PPO活性的影響。由圖6 可知，當(dāng)滁菊PPO 濃度一定時，底物濃度小于0.35 mol·L-1時，PPO 催化酶活隨著底物濃度的增加而升高，反應(yīng)速率與底物濃度正相關(guān)；當(dāng)濃度高于0.35 mol·L-1，PPO 活性不增加反而有緩慢降低的趨勢。其原因可能是當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，酶蛋白只有其中的一小部分參加酶促反應(yīng)，隨著底物濃度的增加，酶與底物的結(jié)合率提高；在底物濃度達到一定值后，所有酶分子的活性部位都與底物結(jié)合，此時酶分子被底物飽和，繼續(xù)增加底物濃度也不能提高酶的活性，這時的反應(yīng)速率達到最大值。

圖6 底物濃度對滁菊PPO 活性的影響Figure 6 Effect of substrate concentration on enzyme activity of Chuju PPO

依據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程，對滁菊PPO反應(yīng)初速度和酶活性用雙倒數(shù)作圖法作圖，可以得到一擬合曲線（圖7）。由圖7 可知，以鄰苯二酚作為滁菊PPO 的反應(yīng)底物時，其反應(yīng)符合米氏方程，根據(jù)圖中直線斜率和縱軸截距，求得底物的Km和酶的最大反應(yīng)速率Vmax分別為0.174 9 mol·L-1和961.538 5 U·min-1。

圖7 以鄰苯二酚為底物時雙倒數(shù)曲線Figure 7 Lineweaver-Burk curve of PPO using catechol as the substrate

圖8 滁菊PPO 的熱穩(wěn)定性Figure 8 Thermal stability of Chuju PPO

2.5.4 滁菊PPO 的熱穩(wěn)定性 實驗分別測定了在50 ～ 70 ℃條件下處理1 ～ 25 min 后滁菊PPO 的熱穩(wěn)定性。由圖8 可知，在各加熱溫度下，隨著加熱時間的延長，滁菊PPO 活性均呈現(xiàn)降低趨勢。相對于60 和70 ℃，滁菊PPO 在50 ℃時較為穩(wěn)定，該溫度下加熱25 min 仍能保持30.93%的酶活力；同樣加熱25 min，60 和70 ℃的滁菊PPO 相對活力分別為15.99%和4.54%；在70 ℃加熱條件下滁菊PPO活性顯著減小，在70 ℃條件下加熱3 min，酶活力僅剩25%，加熱10 min，酶活力僅剩7.29%。該結(jié)果為滁菊褐變的抑制提供了理論依據(jù)，在滁菊采收后可以用高于60 ℃的溫度對滁菊進行殺青處理，此時滁菊PPO 的活性會顯著下降，從而達到減輕褐變的目的。

3 結(jié)論

三相分離法是一種從粗酶提取液中直接分離目標(biāo)蛋白酶的有效方法。以酶活回收率和純化倍數(shù)為評價指標(biāo)，探究三相分離過程中不同pH、硫酸銨質(zhì)量濃度、提取液與叔丁醇的體積比等因素對滁菊PPO 純化效果的影響。三相分離純化滁菊PPO 的較優(yōu)工藝參數(shù)為：硫酸銨質(zhì)量濃度0.40 g·mL-1，pH 值6.0，粗提液與叔丁醇的體積比為1:1.5。在優(yōu)化工藝條件下，滁菊PPO 酶的純化倍數(shù)為4.3，酶活回收率為83.2%。從酶的熱穩(wěn)定性等方面對滁菊PPO 酶學(xué)特性進行研究，結(jié)果表明，以鄰苯二酚為底物，其反應(yīng)的最適pH值為6.50，最適反應(yīng)溫度為30 ℃，底物最適濃度為0.35 mol·L-1，底物Km和Vmax分別為0.174 9 mol·L-1和961.538 5 U·min-1。滁菊PPO對pH 值和溫度的變化都比較敏感，在pH 值為9的條件下殘存酶活僅剩24%；70 ℃加熱3 min，殘存酶活僅剩25%，加熱10 min 殘存酶活僅剩7.29%。