李 錚，潘 根，陶 杰，黃思齊，唐慧娟，鄧 勇，趙立寧，李德芳

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 麻類研究所，湖南 長沙 410205)

植物開花時間是影響作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一，是植物由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的標(biāo)志，花期調(diào)控是植物生產(chǎn)中重要的一環(huán)[1]。誘導(dǎo)植物成花至少有6條途徑：光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、自主途徑、年齡依賴途徑和溫敏途徑等。當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化(光周期、激素、溫度等)，這些途徑將植物體內(nèi)各種因子產(chǎn)生的響應(yīng)信號轉(zhuǎn)換成新信號后，傳遞給開花整合子，由它促進(jìn)花分生組織特異基因的表達(dá)，誘導(dǎo)花的形成[2]。FLOWERINGLOCUST(FT)基因是6種途徑中最重要的開花整合子之一，也是重要的開花促進(jìn)基因，對植物成花起著至關(guān)重要的作用[3]。研究報道，擬南芥的FT基因突變會導(dǎo)致植株開花推遲，過表達(dá)則早開花[4]。在水稻中，Headingdate3a(Hd3a)基因與擬南芥的FT基因具有同源性[5]，二者屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)家族的FT-Like(FTL)亞家族[6]，在植物中主要參與成花調(diào)控、花器官發(fā)育等，短日照下具有促進(jìn)開花的功能。研究表明，擬南芥和水稻等植物在接受合適的光周期誘導(dǎo)后，F(xiàn)TL在葉中被誘導(dǎo)表達(dá)，其蛋白質(zhì)由葉片經(jīng)過維管束移動到莖頂端組織促進(jìn)開花[6]。開花提前或延后嚴(yán)重影響了植物的產(chǎn)量和質(zhì)量，因此，研究FT基因的功能及機(jī)理具有重要的理論和實(shí)際意義。前人在擬南芥、水稻、小麥、大豆等植物中已成功克隆FT基因家族，并對其遺傳因素和分子機(jī)制都有深入的研究，但大麻的開花機(jī)理尚不明確，大麻開花關(guān)鍵基因的研究鮮見報道。

大麻(Cannabissativa)是大麻科(Cannabinaceae)大麻屬(CannabisL.)一年生草本植物。大麻在中國栽培歷史久遠(yuǎn)，且廣泛種植于世界各地，其纖維主要作為優(yōu)良的紡織和造紙?jiān)蟍7]；其種子可榨油，作食用油或工業(yè)用油[8]；其葉、花、果實(shí)等可入藥，近年來研究表明，大麻中的非成癮成分大麻二酚(CBD)有治療癲癇、失眠癥、焦慮、腫瘤等的功效[9-11]；還可用于預(yù)防或治療藥物成癮；甚至可以添加在化妝品中，對皮膚有舒緩修復(fù)、祛痘、抗皺等作用[12]。大麻的價值主要來源于其莖、葉和花中，但由于其屬于短日照植物，對光照變化十分敏感[13]，南種北移后生育期延長，出現(xiàn)晚花、無法收獲種子或種子結(jié)實(shí)不飽滿等現(xiàn)象[14]，收獲期延后也增加了人工成本；北種南引后生育期大大縮短，出現(xiàn)早花或植株發(fā)育不良等情況，纖維及花葉產(chǎn)量大大減少[15]。因此，培育大麻廣適應(yīng)品種是當(dāng)前大麻育種的熱點(diǎn)之一，而大麻開花期機(jī)理研究可為其提供理論支撐，但目前光周期影響大麻開花的分子機(jī)理尚不明確，限制了其在大麻育種中的應(yīng)用。

本研究以云麻7號(Y7)和慶麻1號(Q1)為材料，通過對大麻FT同源基因CsHd3a(CannabissativaHeadingdate-3a)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析、實(shí)時熒光定量對其進(jìn)行組織和長、短日照下相對表達(dá)水平分析，為探索CsHd3a轉(zhuǎn)錄因子的開花調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)，為培育大麻廣適應(yīng)性品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理方法

本試驗(yàn)中的大麻品種慶麻1號(Q1)和云麻7號(Y7)皆由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所一年生麻類作物育種團(tuán)隊(duì)提供。選取大小均勻、顆粒飽滿的種子，于濕潤的吸水紙上發(fā)芽。

1.1.1 大麻植株培養(yǎng) 待第一對真葉展開后，挑選若干發(fā)芽的植株移植室外培養(yǎng)，挑選3株長勢均勻的開花雌株，各取發(fā)育良好且長勢均勻的植物組織，迅速放入液氮，用于提取RNA。其余Q1和Y7植株采用盆栽方式放在自然條件下進(jìn)行種植，待開花后記錄其開花期。

1.1.2 不同日照時長的處理 待發(fā)出第1對真葉后，移栽至花盆中，放入人工氣候室培養(yǎng)(溫度25～28 ℃，濕度70%，光照12 h/d)。培養(yǎng)30 d后，選取長勢均勻的Y7和Q1植株各6盆，均分為長日照組和短日照組，放置于植物組織培養(yǎng)室進(jìn)行定時光照培養(yǎng)。長日照組光照時間為每日5：00-21：00，光照時長16 h，黑暗處理8 h；短日照組光照時間為每日8：00-16：00，光照時長8 h，黑暗處理16 h。連續(xù)處理7 d后，從00：00開始取樣，每隔4 h取一次，到20：00結(jié)束，共取6次。取樣時，皆選取頂部向下2，3節(jié)的葉片，且每次2個品種各取3株，取樣后迅速放入液氮冷凍后-80 ℃保存。

1.2 RNA提取

使用EASY spin Plus多糖多酚復(fù)雜植物總RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物有限公司，北京)提取總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，用Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，USA)檢測其濃度和純度。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)最新公布的大麻轉(zhuǎn)錄組序列信息，使用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成序列。

1.4 大麻CsHd3a基因的克隆

選取植物頂部向下第2，3節(jié)的葉片，提取大麻總RNA，使用金牌逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(擎科生物技術(shù)有限公司，北京)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，Primer-F(10 mol/mL)1 μL，Primer-R(10 mol/mL)1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次； 72 ℃ 5 min，反應(yīng)于12 ℃終止后取出，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并對目的片段進(jìn)行切膠回收。選擇T載體進(jìn)行載體連接，并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)，涂布于含有氨芐(Ampicillin)抗生素的LB平板上進(jìn)行菌落篩選，挑菌培養(yǎng)并做陽性檢驗(yàn)后，提取質(zhì)粒并送至北京擎科生物有限公司測序。得到序列后進(jìn)入NCBI的Blast模塊進(jìn)行序列比對鑒定，并使用DNAMAN與CsHd3a基因的ORF序列進(jìn)行比對。

1.5 大麻CsHd3a基因生物信息學(xué)分析

通過NCBI中公布的序列，獲得CsHd3a基因序列信息，使用BioXM 2.7軟件翻譯成氨基酸序列。在exPASy-ProteParam網(wǎng)站(https：//web.expasy.org/protparam/)中分析大麻CsHd3a蛋白一級結(jié)構(gòu)的理化特性，包括氨基酸組成、分子量、親/疏水性、等電點(diǎn)及脂肪指數(shù)等。利用SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，Phyre2(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)。利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)檢索保守域并進(jìn)行分析。通過NCBI獲取其他主要作物的FT及同源氨基酸序列信息，使用MEGA 7軟件以最大釋然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹并進(jìn)行分析。使用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對。

1.6 表達(dá)量分析

選取植物頂部向下第2，3節(jié)的葉片，提取大麻總RNA，使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液(湖南艾科瑞生物有限公司，長沙)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，選取DHS2作為內(nèi)參基因(表1)，使用CFX96定量PCR儀(Bio-Rad，USA)采用qRT-PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)技術(shù)，選擇SYBRR Green Ⅰ染料，采用相對定量法研究Q1雌株中CsHd3a基因在盛花期不同部位的表達(dá)特征和CsHd3a基因在Q1、Y7中長、短日照下的表達(dá)特征。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 大麻CsHd3a3基因的克隆

根據(jù)NCBI中公布的大麻FT同源基因序列設(shè)計(jì)PCR特異性引物，以Q1葉片為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證(圖1)，回收目的條帶后，克隆到pTOPO-Blunt平末端連接載體后，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過抗性篩選、陽性檢驗(yàn)后進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果與NCBI中公布的大麻FT同源基因序列進(jìn)行氨基酸序列比對一致。其全長CDS序列大小為543 bp，編碼180個氨基酸長度的蛋白質(zhì)，將其命名為CsHd3a。利用DNAMAN軟件將Q1克隆出的CDS氨基酸序列與NCBI中公布的大麻FT同源基因序列進(jìn)行比對，一致性為99.44%(圖2)，Q1中編碼區(qū)第8位氨基酸亮氨酸被替換為脯氨酸。

2.2 大麻CsHd3a蛋白理化特性分析

利用exPASy-ProteParam軟件對序列進(jìn)行預(yù)測，CsHd3a蛋白分子式為C900H1387N251O269S5，ORF編碼的氨基酸數(shù)為180 aa；分子量為20.187 73 ku，理論等電點(diǎn)為7.76，脂肪族指數(shù)為30.33，親、疏水性平均值為-0.418，為較親水的兩性蛋白。利用CDD數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，CsHd3a蛋白共含有6個位置略有差異的結(jié)構(gòu)域，其中含有PEBP-euk特殊結(jié)構(gòu)域，屬于PEBP家族蛋白(圖3)。

CsHd3a蛋白預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)分析如圖4所示，編碼該蛋白的180個氨基酸中可能有25個氨基酸形成α螺旋(13.89%)，49個氨基酸形成延伸鏈(27.22%)，9個氨基酸形成β轉(zhuǎn)角(5.00%),97個氨基酸形成無規(guī)則卷曲(53.89%)。利用Phyre2工具進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致(圖5)。

在NCBI中獲得大麻與主要作物[16]的FT-Like蛋白序列，使用DNAMAN進(jìn)行保守序列比對(圖6)。分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列一致性為71.63%，說明FT氨基酸在不同物種間具有高度的相似性。使用MEGA 7的最大釋然法構(gòu)建物種間的FT基因發(fā)育進(jìn)化樹(圖7)，結(jié)果顯示，CsHd3a與棉花FT同源基因GhFT1親緣關(guān)系最近。

2.3 大麻CsHd3a基因的組織特異性表達(dá)分析

為探究CsHd3a基因在大麻中的組織表達(dá)特異性，選用慶麻1號(Q1)為材料，分析其在同一生長時期不同組織中基因的表達(dá)情況。如圖8所示，可看出CsHd3a基因在葉和花中均有表達(dá)，且在葉中高表達(dá)，在根和莖中幾乎不表達(dá)。在葉中的表達(dá)量是花的14.9倍，是根的155.3倍，是莖的389.7倍。

2.4 大麻不同品種的CsHd3a基因在長、短日照下的表達(dá)特征

為進(jìn)一步探究CsHd3a在調(diào)控大麻開花中的作用，基于前人研究報道，選用北方品種Q1和南方品種Y7進(jìn)行長、短日照下不同品種大麻CsHd3a基因在葉中表達(dá)情況的研究。同時播種35 d后，Y7依舊處于營養(yǎng)生長階段； Q1已停止?fàn)I養(yǎng)生長轉(zhuǎn)入生殖生長(圖9)，Q1開花期明顯早于Y7。

選擇將2個品種分別以長(16 h光照)、短(8 h光照)日照處理。處理7 d后，從0：00開始到當(dāng)日20：00，每隔4 h取樣一次，僅選取處理后的葉片組織。通過時空表達(dá)模式圖(圖10)可看出，在短日照處理下，Q1表達(dá)量皆高于Y7，且在白天(光照時間為8：00-16：00)表達(dá)量明顯升高，8：00達(dá)到峰值；在Q1植物中，該基因在短日照處理下白天表達(dá)量顯著上升，而在長日照中幾乎不表達(dá)；Q1在LD下和Y7在SD下，相對表達(dá)量皆低于0.2。

2.5 大麻不同品種CsHd3a基因的克隆

為探究早花品種Q1和晚花品種Y7在短日條件下的差異，利用DNAMAN軟件將Y7和Q1克隆出的CDS氨基酸序列進(jìn)行比對，一致性為97.22%(圖11)。Y7蛋白序列存在5處位點(diǎn)發(fā)生氨基酸替換，分別是第9位纈氨酸被替換為丙氨酸；第40位甘氨酸被替換為絲氨酸；第42位谷氨酸被替換為甘氨酸；第46位絲氨酸被替換為脯氨酸；第55位天冬氨酸被替換為甘氨酸(圖12)。

3 結(jié)論與討論

開花期是重要的生育時期之一，決定大麻營養(yǎng)生長期的長短和不同品種的地域適應(yīng)性，間接影響了大麻產(chǎn)量和質(zhì)量，因此，研究大麻光周期調(diào)控基因?qū)Υ舐榈膶?shí)際生產(chǎn)和優(yōu)良品種培育具有重要意義。研究認(rèn)為，光周期是影響開花最重要的環(huán)境因素之一[17]。植物在感知到有利的或誘導(dǎo)性的日長后，葉片中產(chǎn)生一種稱為熒光素的可移動的長途信號，后被傳送至莖尖，從而觸發(fā)花形態(tài)的發(fā)生，而FT基因mRNA是熒光素信號的重要組成部分[18]。FT在植物開花調(diào)控中的作用備受關(guān)注，近年來，研究者通過克隆、轉(zhuǎn)基因等分子技術(shù)對FT及同源基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，研究發(fā)現(xiàn)，在水稻[19]、擬南芥[20]、小麥[21]、大豆[22]、玉米[23]中，其開花功能相當(dāng)保守，即使發(fā)生突變?nèi)阅茉诤线m的光照誘導(dǎo)下促進(jìn)開花；使用基因沉默等技術(shù)使其功能失活則延遲開花。FT及其同源基因在多種作物中相繼被克隆，但目前尚未見有關(guān)大麻FT及同源基因的報道。

本研究從大麻品種Q1中克隆了FT同源基因，命名為CsHd3a基因，其cDNA編碼區(qū)與GenBank數(shù)據(jù)庫一致性高于99%，保守序列無差異，預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)幾乎一致。對大麻CsHd3a蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其屬于親水性的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，無跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白。CsHd3a蛋白屬于PEBP家族的FT-L亞家族，含有相當(dāng)保守的PEBP結(jié)構(gòu)域，在植物中被證實(shí)其家族基因的存在對激活器官狀結(jié)構(gòu)(例如芽和花)的發(fā)育存在明顯的關(guān)系[24]，與其他植物的同源基因比對也有較高的相似度。在不同作物中，F(xiàn)T及其同源基因個數(shù)不同，如擬南芥[25]有2個、水稻[6]有25個、大豆[26]有24個。通過FT物種間進(jìn)化發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥的AtFT基因與同源基因AtFTL基因的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明同一物種FT家族序列可能存在差異；大麻CsHd3a基因與同為短日照作物的水稻Hd3a基因的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其與長日照作物棉花的GhFTL基因親緣關(guān)系較近。同時說明FT的分布具有種屬特異性，這也解釋了FT及其同源基因在不同物種中行使的功能有所不同，如促進(jìn)成色[27]、過表達(dá)抑制開花、作為細(xì)胞自主調(diào)節(jié)的計(jì)時器準(zhǔn)確開閉氣孔保衛(wèi)細(xì)胞[28]等。

FT及其同源基因是植物成花過程中關(guān)鍵基因，在葉片中高表達(dá)后傳遞熒光素至莖尖，促進(jìn)成花。CsHd3a基因在開花期的大麻中組織表達(dá)量差異較大，其在葉片中表達(dá)量最高，花中次之，在莖與根系中幾乎不表達(dá)，這與前人的研究相一致[29]。Y7和Q1在長、短日照下CsHd3a基因的時空表達(dá)表明，Y7在短日照下相對表達(dá)量低于0.2，Q1在短日照處理下呈現(xiàn)高表達(dá)，且顯著高于Y7和長日條件下的Q1。推測Q1在短日照下表現(xiàn)早花與CsHd3a基因高表達(dá)有關(guān)，在短日照下的成花調(diào)控中扮演了重要角色。擬南芥中FT基因突變或不表達(dá)導(dǎo)致晚花或不開花，過表達(dá)導(dǎo)致植株早花[25]，這與本研究相一致，可見CsHd3a基因在大麻成花過程中可能發(fā)揮正向調(diào)控的作用。

進(jìn)一步序列分析表明，在開花期有顯著差異的Q1和Y7品種中，其CsHd3a存在多處氨基酸差異，這些差異是否直接影響大麻開花期還有待進(jìn)一步考證。在水稻中，Kasalath和日本晴等位基因在編碼區(qū)內(nèi)有兩處堿基替換，從而改變該蛋白羧基端的氨基酸[30]，但這2種等位基因均具有促花功能[31]。水稻Hd3a基因是與可促進(jìn)擬南芥開花的FT基因高度相似的基因，該基因在日照時長由長變短時誘導(dǎo)表達(dá)。在短日條件下，Hd3a轉(zhuǎn)錄水平對水稻抽穗期有直接影響，且Kasalath等位基因表達(dá)的mRNA早于日本晴等位基因，表達(dá)水平也較高[32]。

綜上所述，本研究克隆了大麻的FT同源基因CsHd3a基因，對其序列信息及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測和分析，該蛋白屬于參與開花調(diào)控的PEBP家族蛋白；并在開花期對其進(jìn)行不同組織器官的表達(dá)進(jìn)行分析，該基因在花和葉中都有表達(dá)，葉中相對表達(dá)量最高，在根和莖中幾乎不表達(dá)。同時對該基因的時空表達(dá)特性進(jìn)行了研究，該基因在短日照處理下Q1相對表達(dá)量顯著上調(diào)，Y7幾乎不表達(dá)，結(jié)合短日照下Q1表現(xiàn)早花，可推測該基因在短日照下高表達(dá)導(dǎo)致開花。進(jìn)一步克隆得到Y(jié)7和Q1序列，比對發(fā)現(xiàn)Y7存在5處氨基酸差異，可為進(jìn)一步探究其調(diào)控大麻成花及花發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。