楊雲(yún)雲(yún)，陳 鑫，陳啟洲，盧 芳，徐 晨，楊洪濤，蘇佩佩，劉曉龍

(1.宜春學院 生命科學與資源環(huán)境學院，江西 宜春 336000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，吉林 長春 130033)

長江中下游地區(qū)是我國重要的水稻主產(chǎn)區(qū)，近年來，由于氣候變暖導致的夏季極端高溫天氣時有發(fā)生，最高溫度超過35 ℃的天氣持續(xù)10～15 d。高溫脅迫已對當?shù)氐乃旧a(chǎn)造成嚴重影響，并已成為制約當?shù)厮痉N植業(yè)發(fā)展的主要限制因素之一。高溫脅迫會對不同生育時期的水稻生長造成影響，在種子萌發(fā)期遭遇超過35 ℃的高溫脅迫會導致種子發(fā)芽遲緩、種子喪失活力、發(fā)芽率下降[1]。水稻在幼苗階段遭受高溫脅迫不僅會出現(xiàn)葉片卷曲，含水量降低，葉片顏色變淺、變白、變短和畸形等癥狀，還會致使植株生長發(fā)育緩慢、抑制根系生長[2-3]，光合作用受阻，凈光合速率和氣孔導度降低，光合作用原初反應受到抑制[4-5]。水稻孕穗期遭遇高溫脅迫會導致穎花退化、花粉敗育、花粉活力下降，進而導致秕粒增加[6-7]；在抽穗期和灌漿期遭受高溫脅迫會阻礙水稻的開花授粉，穗中秕粒增多、結實率下降，造成千粒質(zhì)量降低，進而導致水稻減產(chǎn)[8-11]。研究表明，水稻幼苗在堿脅迫環(huán)境下，根系活性氧大量積累，破壞了抗氧化防御系統(tǒng)，進而損傷根系細胞，導致幼苗萎蔫和死亡[12]。高溫脅迫與堿脅迫類似，其抑制水稻生長發(fā)育的一個重要因素就是引起ROS過量積累，破壞ROS產(chǎn)生和清除的平衡體系，導致膜質(zhì)過氧化作用加劇，進而損壞細胞結構[3，13-14]。高溫脅迫抑制水稻種子萌發(fā)，但其導致發(fā)芽率下降的主要原因尚不明確，本研究擬以ROS積累為線索探究高溫脅迫抑制水稻種子萌發(fā)的機制。

脫落酸(ABA)是植物體內(nèi)的重要激素，常作為脅迫激素參與植物對多種逆境脅迫的響應，并發(fā)揮重要作用[15]。產(chǎn)生誘抗效應是ABA提高植物抗逆性的一個重要機制[16]。ABA對水稻耐鹽堿脅迫產(chǎn)生誘抗效應，能夠提高水稻對堿脅迫的抗性和蘇打鹽堿水田中的產(chǎn)量[17-18]。ABA在提高植物耐高溫脅迫中同樣具有促進作用，高溫處理可降低植物體內(nèi)IAA、GA、自由脯氨酸及可溶性蛋白質(zhì)的含量，增加脫落酸含量[19]。抽穗期噴施S-誘抗素或ABA溶液能夠提高水稻的結實率和千粒質(zhì)量，稻米的碾磨品質(zhì)和蒸煮品質(zhì)也得到改良[20]。研究表明，外源ABA能夠通過增加蔗糖的轉運和加速蔗糖代謝來保持碳平衡和能量平衡，進而阻止花粉敗育[21]。以上研究結果為ABA提高水稻耐高溫特性的效果提供了堅實的科學依據(jù)，但目前對于其內(nèi)在的生理機制及分子機理解析尚不明晰，尤其在ROS相關通路中的報道并不多見。研究表明，ABA預處理能夠提高堿脅迫下水稻幼苗的下游抗氧化防御能力，抑制ROS過量積累；且ABA緩解了外源二氯百草枯(Paraquat)對水稻幼苗引發(fā)的氧化脅迫，這是ABA誘導水稻耐堿脅迫的主要途徑之一[22]?；谝陨涎芯拷Y果，本研究以高溫為主要非生物脅迫因子，探究ABA對水稻耐高溫脅迫的誘抗效應，以ABA浸種的方式在水稻種子萌發(fā)期進行研究，并以ROS積累為出發(fā)點初步解析高溫環(huán)境下ABA對水稻種子萌發(fā)的影響機理。

1 材料和方法

1.1 供試材料

以江西省主推常規(guī)水稻品種黃華占和日本晴為試驗材料。

1.2 試驗設計

1.2.1 ABA溶液的配制 脫落酸(ABA：Sigma，Inc.，St，Louis，MO，USA)試劑先溶于少量的無水乙醇中，然后用去離子水定容至一定的濃度。本試驗用外源ABA浸種的方式探究ABA對水稻種子萌發(fā)的誘抗效應，參照前人研究結果，選用10 μmol/L作為試驗用ABA濃度[17-18，22]。

1.2.2 試驗設計 萌發(fā)試驗在培養(yǎng)皿中進行，設置2個處理，即非ABA處理組(-ABA)和ABA處理組(+ABA)，每個處理5次重復。每個重復選取飽滿一致的50粒種子，ABA處理組用10 μmol/L的ABA溶液于黑暗條件下浸種24 h，非ABA處理組用去離子水于黑暗條件下浸種24 h。

1.3 各項指標的測定方法

1.3.1 相對電導率和丙二醛含量的測定 相對電導率(Relative conductivity，RC)常用來評價細胞膜的損傷程度。用煮沸前和煮沸后的電導率(R1和R2分別表示煮沸前后溶液的電導率)來計算，公式為：RC(%)=R1/R2×100%。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定，采用公式6.45×(A532-A600)-0.56×A450計算各樣品的MDA濃度，再根據(jù)樣品質(zhì)量計算MDA含量。

過氧化氫含量的測定：植物中的H2O2與硫酸鈦(或氯化鈦)反應生成黃色的過氧化物-鈦復合物沉淀，在H2SO4中進行溶解，在415 nm處有特征吸收峰，用分光光度計比色可測定H2O2含量[25]。

1.3.3 萌發(fā)相關基因的表達分析 利用TRIzol法提取水稻幼芽總RNA，并測定RNA濃度，用M-MLV反轉錄酶(TaKaRaBioInc.，Otsu，Japan)進行反轉錄，形成cDNA。在實時熒光定量PCR儀(Eco TM 48，Illumina，Saffron Walden，UK)上進行qRT-PCR反應(Quantitative real-time PCR)，總反應體系為20 μL，包括：10 μL 2×SYBRPremixExTaqTM(TaKaRa Bio)，1.6 μL cDNA，0.8 μL引物和7.6 μL ddH2O。qRT-PCR反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，30個循環(huán)；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。確定cDNA模板和引物沒有基因組DNA污染后，以穩(wěn)定表達的水稻看家基因β-actin作為內(nèi)參，進行基因表達量的測定。每個處理設置3次生物學重復，每個模板2次技術重復，利用2-ΔΔCT的方法計算基因的相對表達量[26]。

ROS清除相關基因包括：OsCATB、OsAPX6、OsFe-SOD和OsCu/Zn-SOD；細胞死亡相關基因包括：OsBI1和OsKOD1；ABA應答基因有Salt和OsWsi18[12，22]，用于qRT-PCR的基因及相關引物(5′-3′)如下：

OsACT1(內(nèi)參，Os03g0718100)F：TTCCAGCCTT

CCTTCATA，R：AACGATGTTGCCATATAGAT；

OsBI1(Os02g0125300)F：CTACATCAAGCACGC

ACTC，R：ACCTCTTCTTCCTCTTCTTCTC；

OsKOD1(Os04g0507950)F：TCAAGCCATTCATC

TTCCAT，R：ATCAGCAACCTCGTCAAG；

Salt(Os01t0348900)F：CGAAATAATGTTCCATG

GTGTT，R：TGTACTACGGATCGGTGCAA；

OsWsi18(Os01g0705200)F：TGTGACTCGATCCA

GCGTAG，R：GTTCCTGCTGAGAAGCCATC；

OsCATB(Os06g0727200)F：GCTGGTGAGAGATACC

GGTCA，R：TCAACCCACCGCTGGAGA；

OsAPX6(Os12g0178100)F：CCCCAAGATCCCCA

TGATCTA，R：CCTCTGGCGGGCATTG；

OsFe-SOD(Os06g0143000)F：CGACGCCGAGGAAT

TTCTAG，R：AGGTGGTGTAAGTGTCTCTCATGC；

OsCu/Zn-SOD(Os06g0130900)F：TGTGACGGGA

CTTACTCCTGG，R：CACCCATTCGTAGTATCGCCA。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，數(shù)據(jù)繪圖應用Origin 9.1繪圖軟件。利用SPSS 21.0(IBM Corp.，Armonk，NY)軟件，基于單因素方差分析(ANOVA)和Duncan方法進行數(shù)據(jù)的顯著性差異分析，顯著性差異水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 ABA浸種預處理對高溫脅迫下水稻種子萌發(fā)的影響

不同處理下，種子萌發(fā)試驗結果如圖1所示。非高溫處理下，ABA浸種與否對種子萌發(fā)無明顯影響。高溫脅迫抑制了日本晴和黃華占的種子萌發(fā)，導致芽長和根長縮短。而ABA浸種能夠促進高溫脅迫下水稻種子的萌發(fā)和幼芽的生長。

發(fā)芽率統(tǒng)計試驗結果表明(圖2)，ABA浸種在高溫脅迫初期促進了水稻種子的萌發(fā)。非ABA浸種條件下，與CK-ABA相比，高溫處理使日本晴在第2天和第3天的發(fā)芽率分別提高了11.60，7.60百分點，使黃華占在第2天，第3天的發(fā)芽率分別提高了14.00，4.00百分點。ABA浸種條件下，與CK+ABA相比，高溫處理使日本晴在第2天，第3天的發(fā)芽率分別提高了7.60，9.20百分點，使黃華占在第2天，第3天的發(fā)芽率分別提高了14.40，6.80百分點。隨著萌發(fā)時間的延長，不管ABA浸種與否，高溫脅迫均抑制了水稻種子的萌發(fā)。在萌發(fā)的第7天，高溫脅迫使ABA浸種和非ABA浸種的日本晴發(fā)芽率分別下降了12.00，22.80百分點，黃華占分別下降了10.40，20.00百分點。

對照條件下，ABA浸種的種子發(fā)芽率略低于非ABA浸種。而高溫脅迫下，ABA浸種對水稻種子的萌發(fā)起到了一定的促進作用，且脅迫時間越長，促進作用越明顯。從萌發(fā)的第5 天開始，高溫脅迫條件下，ABA浸種提高了2個水稻品種的發(fā)芽率；在萌發(fā)的第6天，ABA浸種使日本晴和黃華占的發(fā)芽率分別提高了4.40，6.80百分點；第7天，ABA浸種使日本晴和黃華占的發(fā)芽率分別提高7.60，8.00百分點。

ABA浸種促進了水稻芽和根的生長。試驗結果表明(圖3)，對照條件下，ABA浸種對水稻幼芽和根的生長略有促進作用，ABA浸種顯著提高了黃華占的主根長(P<0.05)。高溫脅迫下，ABA浸種顯著提高了水稻的芽長和主根長(P<0.05)，黃華占的芽長增加更明顯。高溫脅迫下，ABA浸種使日本晴和黃華占的芽長分別提高了21.96%，38.92%；主根長分別提高了48.00%，63.82%。

2.2 ABA浸種對高溫脅迫下水稻幼芽ROS積累的影響

研究表明，外源ABA預處理顯著上調(diào)了多個ROS清除基因的表達，提升抗氧化酶活性，進而抑制ROS過量積累來提高水稻幼苗的耐堿性。在這些ROS清除基因中上調(diào)幅度較大的有OsCATB、OsAPX6、OsFe-SOD、OsCu/Zn-SOD，分別為過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)的主要調(diào)控基因[22]。本試驗繼續(xù)分析高溫脅迫下ABA浸種對以上4個ROS清除基因表達的影響。結果表明(圖5)，高溫脅迫下，ABA浸種顯著上調(diào)了4個ROS清除基因的表達(P<0.05)，且OsFe-SOD和OsCu/Zn-SOD的上調(diào)幅度更大，暗示著ABA浸種提高了抗氧化酶CAT、APX和SOD的活性以清除過多的ROS。

2.3 ABA浸種對高溫脅迫下水稻幼芽細胞死亡的影響

研究表明，逆境脅迫下ROS的過量積累是導致水稻細胞損傷和幼苗萎蔫的主要原因[12]，本試驗進一步對高溫脅迫下水稻幼芽的細胞損傷狀況進行測定。由圖6可知，高溫脅迫條件下，ABA浸種處理使幼芽中細胞死亡抑制基因OsBI1的表達量顯著上調(diào)(P<0.05)，而細胞死亡基因OsKOD1表達下調(diào)，進而降低了高溫脅迫導致的細胞過量死亡。高溫脅迫下，與非ABA浸種處理相比，ABA浸種使2個品種OsBI1的上調(diào)幅度分別為182.0%，156.0%，而細胞死亡基因OsKOD1則分別下調(diào)了33.5%，51.3%。

2.4 高溫脅迫下水稻種子萌發(fā)與幼芽生理指標的相關性分析

2.5 高溫脅迫下水稻幼芽ABA應答基因表達量的變化

進一步分析了2個ABA應答基因的表達變化，結果如圖7所示。高溫脅迫下，ABA浸種處理下水稻幼芽內(nèi)ABA應答基因顯著(P<0.05)上調(diào)，說明ABA浸種激活了水稻內(nèi)的ABA信號通路，使之在抵抗高溫脅迫中發(fā)揮作用。高溫脅迫下，與非ABA浸種處理相比，ABA浸種使日本晴和黃華占幼芽內(nèi)Salt基因相對表達量分別提高了4.84，5.46倍(圖7-A)，OsWsi18分別提高了5.87，7.06倍(圖7-B)。

表1 高溫脅迫下非ABA浸種處理下水稻種子萌發(fā)進程中各指標的相關性分析Tab.1 Correlation analysis of various indexes in rice seed germination process of non-ABA soaking treatment under high temperature stress condition

表2 高溫脅迫下ABA浸種處理下水稻種子萌發(fā)進程中各指標的相關性分析Tab.2 Correlation analysis of various indexes in rice seed germination process of ABA soaking treatment under high temperature stress condition

3 討論與結論

良好的種子萌發(fā)率是植物適應環(huán)境的先決條件。一般來說，水稻在種子萌發(fā)期對高溫脅迫具有較強的抵抗力，這是因為誘導了種子中小熱激蛋白的表達，進而能夠幫助種子抵御高溫；但超過35 ℃時水稻種子的萌發(fā)受阻，種子喪失活力，發(fā)芽率降低[27]。本研究結果表明，在萌發(fā)初期(前3 d)，水稻種子在30 ℃的環(huán)境和40 ℃的高溫環(huán)境下均能夠正常萌發(fā)，且高溫處理對種子萌發(fā)具有促進作用，發(fā)芽率略高于對照處理，這可能是由于種子經(jīng)24 h浸泡后，含水量增加，能夠在短期內(nèi)抵抗高溫的緣故，這與前人研究結果基本一致[28]。在萌發(fā)初期，對照條件和高溫脅迫下，ABA浸種對種子萌發(fā)有抑制作用，2個品種的發(fā)芽率略低于非ABA浸種處理。隨著萌發(fā)進程的推進，不管ABA浸種與否，與對照相比，高溫脅迫均抑制了水稻種子的萌發(fā)；在萌發(fā)的第7 天，2個品種的發(fā)芽率在高溫處理下較對照均有不同程度的下降，且芽長和主根長顯著(P<0.05)低于對照處理，這與多數(shù)研究結果基本一致[29-31]。不管ABA浸種與否，在對照條件下，品種黃華占的芽長和主根長高于日本晴；且在高溫脅迫下的芽長和主根長的下降幅度以及幼芽內(nèi)ROS積累和質(zhì)膜損傷程度均低于日本晴，說明黃華占在種子萌發(fā)期對高溫的抗性略高于日本晴。

ABA不僅參與調(diào)控植物的多種生長發(fā)育進程，且在植物應對鹽、堿、低溫和高溫等非生物脅迫和多種生物脅迫中發(fā)揮重要作用[15，32]。ABA調(diào)控植物抗逆性的一種重要機制就是產(chǎn)生誘抗效應，通過浸種和浸根等多種方式賦予植物抵抗逆境的潛在能力[18，22-33]。研究表明，水稻種子或幼苗經(jīng)ABA預處理后能夠提高鹽脅迫下幼苗的生長發(fā)育和最終產(chǎn)量[34-35]；水稻幼苗經(jīng)外源ABA浸根預處理后，能夠提高抗氧化清除能力，抑制ROS的過量積累，進而提高對堿脅迫的抗性和蘇打鹽堿水田中的產(chǎn)量[17-18，22]。在高溫脅迫下，外源ABA能夠通過多種途徑緩解高溫脅迫對水稻的傷害，包括調(diào)控能量平衡、ROS積累和糖代謝等途徑，促進水稻生長發(fā)育和產(chǎn)量形成[2，21，36]。本試驗結果表明，種子萌發(fā)初期，在對照和高溫處理下，外源ABA浸種較非ABA浸種在一定程度上抑制了種子的萌發(fā)。在長期高溫脅迫下，外源ABA浸種加快了水稻種子的萌發(fā)速度，促進了幼芽和幼根的生長，緩解了長期極端高溫脅迫對水稻種子幼芽生長的抑制作用。對其內(nèi)在機制進一步研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下，ABA浸種顯著(P<0.05)上調(diào)了ABA應答基因Salt和OsWsi18的表達量，說明ABA信號途徑被激活，進一步提升了高溫脅迫下水稻幼芽抗氧化清除基因的轉錄表達，降低ROS的含量，進而緩解了水稻幼芽的質(zhì)膜損傷和細胞過量死亡，促進幼芽的生長。

綜上所述，本研究探究了高溫脅迫下ABA浸種對水稻種子萌發(fā)的影響，進一步驗證了外源ABA對水稻抗逆性的誘抗效應。水稻種子在萌發(fā)初期，高溫處理能夠短暫的促進種子萌發(fā)；此后，高溫處理導致幼芽內(nèi)ROS過量積累，并進一步導致細胞損傷，進而抑制了幼芽的生長。種子在萌發(fā)前利用外源ABA浸種能夠起到提高抗氧化清除能力的作用，降低由極端高溫脅迫而引起的ROS過量積累，從而緩解細胞損傷，促進高溫脅迫下水稻幼芽及幼根的生長。