羅 建，許春苗，張國(guó)斌，郁繼華

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.定西市安定區(qū)園藝工作站，甘肅 定西 743000)

栽培地土壤鹽分過(guò)高，土質(zhì)鹽堿化成為植株生長(zhǎng)和發(fā)育進(jìn)程中的主要環(huán)境限制因子之一[1-3]。高鹽脅迫下植株生長(zhǎng)環(huán)境改變，過(guò)多鈉離子(Na+)在植株體內(nèi)累積，導(dǎo)致質(zhì)膜完整性和通透性喪失[4]，正常生理活動(dòng)被抑制，進(jìn)而造成植物早衰加速，品質(zhì)和產(chǎn)量下降[5-6]。研究表明，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Vacuolar Na+/H+exchange or antiporter，NHX)在植株體內(nèi)不僅參與細(xì)胞擴(kuò)增[7]、pH值調(diào)節(jié)[8]、保護(hù)K+穩(wěn)態(tài)性[9-10]，還可參與到抗鹽脅迫[11]和Na+長(zhǎng)距離運(yùn)輸[12]中可將植株細(xì)胞內(nèi)多余吸收的Na+向外排出或在液泡中對(duì)Na+進(jìn)行區(qū)域化來(lái)控制Na+累積對(duì)膜系統(tǒng)的傷害，是植株體內(nèi)抵御鹽脅迫、維持離子穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透重要的參與者[13-14]。

在甜菜(Betavulgaris)[15]的下部根系中首次檢測(cè)到液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NHX)活性的發(fā)生，隨后在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[16]中發(fā)現(xiàn)植物中最早的液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHX1的存在。目前已在玉米(Zeamays)[17]、鹽地堿蓬(Suaedasalsa)[18]、菊苣(CichoriumintybusL.)[19]、豇豆(VignaunguiculataL.)[20]等多種植物中克隆到液泡膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX的同源基因，說(shuō)明NHX1在高等植物生物進(jìn)程中普遍存在[4，21]，且通過(guò)異源表達(dá)酵母互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)，NHX1基因不僅對(duì)酵母中Na+轉(zhuǎn)運(yùn)起到直接調(diào)節(jié)作用，而且其耐鹽性也有所提高[22]。Fukuda等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，基因OsNHX1的產(chǎn)物可作為Na+/H+交換子，并在水稻的耐鹽性中起重要作用。郭會(huì)敏等[24]在200 mmol/L NaCl中進(jìn)行NnNHX1基因轉(zhuǎn)化煙草耐鹽性研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株較對(duì)照有著良好的生長(zhǎng)，且體內(nèi)葉綠素含量顯著高于對(duì)照，膜完整性更好，耐鹽性提高。Zhang 等[25]在油菜研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)AtNHX1(來(lái)自擬南芥的液泡Na+/H+antiport)的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜植物能夠在200 mmol/L NaCl處理下進(jìn)行正常的生理進(jìn)程，其耐鹽性增加，且在油菜種子采收后其產(chǎn)量和菜籽油的品質(zhì)在鹽脅迫下無(wú)影響。He等[26]研究棉花表明，在200 mmol/L NaCl脅迫下，過(guò)表達(dá)AtNHX1基因的棉花植株較野生型相比有著更好光合作用性能和更高的氮同化率，且其產(chǎn)量和棉花纖維品質(zhì)提高，轉(zhuǎn)基因植株棉花的耐鹽脅迫能力提高。Bao等[27]研究百脈根時(shí)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)ZxNHX轉(zhuǎn)基因百脈根在200 mmol/L NaCl處理下較野生型表現(xiàn)出更好的保水能力和較高的凈光合作用率，其對(duì)鹽分的耐受性增強(qiáng)，植株生物量在后期生長(zhǎng)中也有所增加。Su等[28]研究認(rèn)為，高鹽脅迫下0.2 mg/L外源油菜素內(nèi)酯(BL)的施用增加了蘋果幼苗體內(nèi)反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(MhNHXs)的表達(dá)水平，提高了植株耐鹽能力，有效減少了鹽脅迫下芽和根中Na+的積累，保持了蘋果幼苗體內(nèi)滲透平衡。擬南芥AtNHX1在番茄[29]和菜籽[30]中超表達(dá)增加它們?cè)诟啕}環(huán)境中的抗性。Long等[31]發(fā)現(xiàn)，GhNHX1的沉默導(dǎo)致棉花幼苗對(duì)高鹽濃度的敏感性增強(qiáng)，這表明GhNHX1正調(diào)控棉花對(duì)鹽脅迫的耐受性。Mushke等[32]研究向日葵(HelianthusannuusL.)耐鹽性時(shí)發(fā)現(xiàn)，小麥TaNHX2基因過(guò)表達(dá)使得轉(zhuǎn)基因向日葵植物顯示出更好的抗細(xì)胞損傷保護(hù)能力，穩(wěn)定的相對(duì)水含量、葉綠素含量、脯氨酸積累增加和活性氧物種(ROS)清除能力提高，其對(duì)鹽分的抗性增強(qiáng)。Wu等[33]發(fā)現(xiàn)，AtNHX5在大豆中的超表達(dá)使得其在300 mmol/L NaCl脅迫下有著較強(qiáng)的耐受性。

目前，NHX耐鹽機(jī)制雖然在多種植物當(dāng)中都有研究，然而在辣椒(CapsicumannuumL.)這種日常調(diào)味蔬菜中有關(guān)液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX耐鹽性的作用機(jī)制研究尚不清楚，通過(guò)了解辣椒中NHX基因家族生物信息學(xué)功能，探究其在非生物脅迫下基因的表達(dá)特性，進(jìn)而為辣椒CaNHX基因的功能開發(fā)以及辣椒耐鹽抗旱育種基因提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以當(dāng)?shù)厝展鉁厥抑髟岳苯菲贩N隴椒5號(hào)為非生物脅迫處理材料。在隴椒5號(hào)辣椒幼苗真葉完全展開葉多于6片時(shí)進(jìn)行[34]。

脅迫處理：滲透脅迫(PEG )利用5%濃度甘露醇，赤霉素 (GA3) 、茉莉酸甲酯 (MeJA) 和NaCl分別以濃度100，200，200 mmol/L噴施在辣椒幼苗真葉的正反面，對(duì)照以蒸餾水噴灑處理。辣椒幼苗植株培養(yǎng)在12 h光照(光照強(qiáng)度為200 μmol/(m2·s))和12 h黑暗的培養(yǎng)箱內(nèi)；白天溫度設(shè)置為28 ℃，晚上設(shè)置為26 ℃[31]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 辣椒幼苗真葉總RNA的提取與cDNA的合成 總RNA的提?。喊凑誔ureLink RNA小量提取試劑盒說(shuō)明書對(duì)幼苗真葉中RNA進(jìn)行提取。

RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的步驟：利用mRNA模板按照InvitrogenTMSuperScriptTM試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2 CaNHXs家族基因成員的篩索 利用擬南芥基因庫(kù)(https://www.arabidopsis.org)和茄科植物基因庫(kù)(https：//solgenomics.net)搜索刪選符合辣椒NHX相應(yīng)序列的基因，確定其NHX基因家族的成員。

1.2.3 CaNHXs家族基因生物信息特性分析 利用ProtParam[34]對(duì)CaNHXs家族基因理化特質(zhì)進(jìn)行計(jì)算。NHX基因的信號(hào)肽、蛋白親疏水性以及跨膜結(jié)構(gòu)分別通過(guò)SignalP4.1 Server、ProtScale和TMHMM進(jìn)行預(yù)測(cè)。CaNHXs家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位分析分別利用MEME和WoLF PSORT[35]進(jìn)行。通過(guò)FGENESH-C[36]對(duì)序列進(jìn)行基因框架預(yù)測(cè)。CaNHXs家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比分析通過(guò)Prabi?；蝽樖阶饔迷治隼肞lantCARE軟件進(jìn)行。通過(guò)在線軟件phyre(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/)對(duì)NHX基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。MEGA 5.0[37]和ClustalX[38]軟件對(duì)NHX基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹繪制。

1.2.4 CaNHXs家族基因的定量表達(dá)分析 提取辣椒真葉葉片RNA，利用試劑盒反轉(zhuǎn)錄出cDNA，通過(guò)軟件Primer premier 5.0以辣椒Actin基因作內(nèi)參設(shè)計(jì)引物，通過(guò)KAPA SYBR?FAST定量熒光儀，以不同非生物脅迫處理下辣椒真葉葉片cDNA為試材，對(duì)非生物脅迫處理CaNHXs基因家族進(jìn)行定量熒光差異分析。差異表達(dá)量通過(guò)2-ΔΔCt法[39]計(jì)算得出。

定量熒光所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 CaNHXs基因家族表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量引物Tab.1 qRT-PCR primers for expression on analysis of CaNHXs

1.2.5 分析與繪圖 通過(guò)SPSS 22軟件對(duì)測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，利用Excel 2010繪圖，定量試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaNHXs基因家族信息及蛋白理化性質(zhì)分析

辣椒7個(gè)NHX基因通過(guò)ProtParam進(jìn)行定位分析表明(表2)：7個(gè)辣椒NHX基因各自分布在5條染色體上。其基因大小之間差異明顯，CaNHX5的基因全長(zhǎng)最小(1 231 bp)，CaNHX6的基因全長(zhǎng)最長(zhǎng)(11 897 bp)。CaNHXs的氨基酸數(shù)目維持在198～952，CaNHX5的氨基酸數(shù)目最小，為198 aa，CaNHX7的氨基酸數(shù)目最大，為952 aa。CaNHX5的相對(duì)分子質(zhì)量最小，為21.868 57 ku，CaNHX7的相對(duì)分子質(zhì)量最大，為105.113 89 ku。各基因等電點(diǎn)變化范圍差異較大，分布在5.53～9.18。CaNHX4和CaNHX7的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，說(shuō)明這2個(gè)基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定。

表2 辣椒NHX基因家族信息及理化性質(zhì)Tab.2 Physical and chemical property of CaNHX

2.2 CaNHXs蛋白的親水性/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位

通過(guò)Signal P4.1 Server對(duì)辣椒CaNHXs基因家族成員所含有的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，7個(gè)NHX蛋白中CaNHX1～CaNHX4、CaNHX6和CaNHX7均不具有信號(hào)肽，因此，這6個(gè)蛋白都不屬于分泌蛋白類型，而CaNHX5則相反，在17～18號(hào)氨基酸有信號(hào)肽屬于分泌蛋白類型。

利用ProtScal軟件對(duì)CaNHXs基因家族成員進(jìn)行親水性/疏水性的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，7個(gè)NHX蛋白多肽鏈不同位置(CaNHX1為374和65位，CaNHX2為529和35位，CaNHX3為465和26位，CaNHX4為450和32位，CaNHX5為149和120位，CaNHX6為636和779位，CaNHX7為339和56位)出現(xiàn)親水性(精氨酸(Arg))和疏水性(異亮氨酸(Ile))最強(qiáng)的氨基酸都相同且分值大小相近，7個(gè)NHX蛋白的平均親疏水性值預(yù)測(cè)結(jié)果分別是，CaNHX1為0.572，CaNHX2為0.543，CaNHX3為0.512，CaNHX4為0.468，CaNHX5為0.708，CaNHX6為0.356，CaNHX7為0.259。說(shuō)明NHX整條多肽鏈表現(xiàn)為疏水性，故推測(cè)CaNHXs蛋白為疏水性蛋白。

通過(guò)TMHMM對(duì)辣椒NHX蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析得到CaNHXs基因家族成員有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，均屬于跨膜蛋白。

對(duì)CaNHXs基因亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明(表3)，CaNHXs基因家族成員在細(xì)胞膜(除CaNHX5)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡中均有不同程度的表達(dá)；在線粒體中表達(dá)的有CaNHX1、CaNHX2、CaNHX4；在細(xì)胞核中只有CaNHX3有表達(dá)。

表3 辣椒NHX基因的亞細(xì)胞定位Tab.3 Subcellular location prediction of NHX genes in pepper

2.3 CaNHXs基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)MEME軟件對(duì)辣椒NHX基因成員結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，共得到10個(gè)結(jié)構(gòu)域，都包含有Na+/H+exchange保守結(jié)構(gòu)域，其中CaNHX5中只含有Motif5，CaNHX6中只含有Motif9，CaNHX7中只含有Motif6和Motif9存在，其他4個(gè)基因的保守結(jié)構(gòu)域均相似，具有9個(gè)Motif的存在，N端主要是Motif7，該氨基酸保守域結(jié)構(gòu)含有CXC24XC的鋅指結(jié)構(gòu)，C端主要是Motif6，該氨基酸保守域結(jié)構(gòu)含有Trp(W)-24和TrKA-N，在序列中高度保守(圖1)。對(duì)每個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif7、Motif9均含有50個(gè)保守氨基酸，Motif5含有49個(gè)保守氨基酸，Motif6含有41個(gè)保守氨基酸，Motif8含有40個(gè)保守氨基酸，Motif10含有的保守氨基酸較少有23個(gè)。

2.4 CaNHXs基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

CaNHXs基因家族的結(jié)構(gòu)框架通過(guò)FGENESH-C分析表明(圖3)，CaNHXs基因家族成員均含有上下游完整基因框架序列。CaNHXs基因家族成員不僅在基因長(zhǎng)度上存在差異，而且在內(nèi)含子和外顯子數(shù)量上也差異明顯，但其基因結(jié)構(gòu)相似。CaNHX1～CaNHX4基因中均含有14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子，CaNHX5、CaNHX6和CaNHX7基因分別含有7，19和21個(gè)外顯子以及6，18，20個(gè)內(nèi)含子。

2.5 CaNHXs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比分析

對(duì)辣椒NHX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)Prabi在線結(jié)果表明(表4)，7個(gè)NHX蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)完整，主要以不規(guī)則卷曲 (Random coil)和α-螺旋 (Alpha helix)為主。

表4 CaNHXs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比分析Tab.4 The secondary structure of CaNHXs protein sequence %

2.6 CaNHXs基因順式作用元件分析

使用PlantCare軟件對(duì)辣椒NHX基因啟動(dòng)子序列的相關(guān)順式調(diào)控元件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(表5)，7條NHX具有的作用元件大致分為植物激素應(yīng)答元件，如茉莉酸應(yīng)答元件(TGACG)等。植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)順式作用元件，如植物分生組織表達(dá)應(yīng)答元件(CAT-box)等。生物和非生物脅迫響應(yīng)順式作用元件，如冷脅迫應(yīng)答元件(LTR)、光響應(yīng)元件(G-box)、鹽脅迫應(yīng)答元件(DRE)等。結(jié)果表明，CaNHXs在植株細(xì)胞分裂、激素信號(hào)響應(yīng)以及在逆境生長(zhǎng)中有調(diào)節(jié)作用。

2.7 CaNHXs蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為分析CaNHXs基因家族的進(jìn)化，以擬南芥、番茄、胡楊、水稻NHX家族基因做參考。通過(guò)MEGA 5.0和ClustalX建立蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明(圖4)，依據(jù)親緣關(guān)系該基因家族可分為3個(gè)分支，其中AtNHX3、CaNHX4、AtNHX1、PeNHX4、AtNHX8、CaNHX5、OsNHX5、PeNHX5、CaNHX7、AtNHX7、PeNHX6為一支，CaNHX3、OsNHX4、CaNHX6、PeNHX1、SlNHX2、AtNHX5、AtNHX6、OsNHX2為一支，剩余的為一支。

2.8 CaNHXs蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)在線軟件phyre對(duì)CaNHXs家族蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖5)，除CaNHX1～CaNHX4的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)高度保持一致，剩余CaNHX5、CaNHX6 和CaNHX7的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)各不相同。CaNHXs家族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的不同是由于其基因結(jié)構(gòu)中內(nèi)含子/外顯子之間數(shù)目和分配位置大小差距過(guò)大，進(jìn)而致使各個(gè)基因組和編碼氨基酸數(shù)目上存在較大的差異水平；其次所編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、不規(guī)則卷曲的不同導(dǎo)致空間折疊的不同。

表5 CaNHXs家族成員啟動(dòng)子序列順式作用元件分析Tab.5 Analysis of cis-acting elements of promoter sequence of CaNHXs family members

2.9 CaNHXs基因家族的表達(dá)分析

通過(guò)定量分析了CaNHXs家族基因在非生物脅迫差異處理下的表達(dá)情況(圖6)，包括鹽脅迫 (200 μmol/L)、茉莉酸甲酯 (200 μmol/L)、赤霉素(100 μmol/L)和滲透脅迫(PEG 5%濃度甘露醇)。CaNHX1在GA3脅迫下，表達(dá)量下調(diào)表達(dá)在6 h時(shí)出現(xiàn)最小值，較0 h相比降低了28%，差異顯著；在PEG脅迫下，表達(dá)量顯著上調(diào)在6 h出現(xiàn)最大峰值，為0 h的1.8倍；而在JA脅迫下，表達(dá)量下調(diào)表達(dá)，茉莉酸甲酯處理完全抑制了CaNHX1在葉片中的活性，其表達(dá)量在12 h出現(xiàn)最小值，較0 h相比降低了93%，差異顯著；在NaCl脅迫下，表達(dá)量顯著上調(diào)表達(dá)在12 h出現(xiàn)最大值，為0 h的2.8倍。CaNHX2在GA3脅迫下，表達(dá)量上調(diào)表達(dá)，在12 h出現(xiàn)最大值，其表達(dá)量是0 h的2.3倍，差異顯著；在PEG脅迫下，其表達(dá)量在6 h出現(xiàn)峰值，較0 h增加了50%；在JA處理下，表達(dá)量下調(diào)，在6 h出現(xiàn)最小值，較0 h減少了82%，差異顯著；在NaCl脅迫下，表達(dá)量顯著上調(diào)，在12 h出現(xiàn)峰值，為0 h的6倍。CaNHX3在GA3脅迫下，表達(dá)量顯著上調(diào)，在12 h出現(xiàn)最大值，為0 h的1.8倍；在PEG脅迫下，其表達(dá)量上調(diào)表達(dá)，在6 h出現(xiàn)峰值，為0 h的1.5倍；在JA處理下，表達(dá)量上調(diào)表達(dá)，在12 h出現(xiàn)最大值，為0 h的1.8倍；在NaCl脅迫下，表達(dá)量顯著下調(diào)，在24 h出現(xiàn)最小值，較0 h減少了84%。CaNHX4在GA3脅迫下，表達(dá)量下調(diào)表達(dá)在12 h出現(xiàn)最小值，較0 h相比降低了31%；在PEG脅迫下，表達(dá)量顯著上調(diào)，在12 h出現(xiàn)最大峰值，為0 h的2.4倍；而在JA脅迫下，表達(dá)量顯著下調(diào)，其表達(dá)量在12 h出現(xiàn)最小值，較0 h相比降低了23%；在NaCl脅迫下，表達(dá)量顯著上調(diào)，在6 h出現(xiàn)最大值，為0 h的2.5倍。CaNHX5在GA3脅迫下，表達(dá)量顯著上調(diào)，在6 h出現(xiàn)最大值，為0 h的2.6倍；在PEG脅迫下，表達(dá)量下調(diào)在12 h出現(xiàn)最小值，較0 h減少了28%；在JA脅迫下，表達(dá)量上調(diào)，其表達(dá)量在6 h出現(xiàn)最大值，較0 h相比增加了52%，且差異顯著；在NaCl脅迫下，表達(dá)量上調(diào)，在6 h出現(xiàn)最大值，較0 h相比增加了13%。CaNHX6在GA3脅迫下，表達(dá)量上調(diào)，在6 h出現(xiàn)最大值，為0 h的4.5倍；在PEG脅迫下，表達(dá)量顯著上調(diào)，在12 h出現(xiàn)最大峰值，為0 h的13.5倍；在JA脅迫下，表達(dá)量上調(diào)，其表達(dá)量在6 h出現(xiàn)最大值，較0 h相比增加了37%；在NaCl脅迫下，表達(dá)量上調(diào)，在6 h出現(xiàn)最大值，為0 h的13.6倍。CaNHX7在GA3脅迫下，表達(dá)量下調(diào)，在12 h出現(xiàn)最小值，相比0 h降低了29%；在PEG脅迫下，表達(dá)量上調(diào)，在6 h出現(xiàn)最大峰值，為0 h的1.7倍；在JA脅迫下，表達(dá)量顯著下調(diào)，其表達(dá)量在12 h出現(xiàn)最小值，較0 h相比降低了16%；在NaCl脅迫下，表達(dá)量上調(diào)表達(dá)在12 h出現(xiàn)最大值，為0 h的2.7倍，且差異顯著。

3 結(jié)論與討論

目前，在陸地棉[40]、藜麥[41]、水稻[42]、葡萄[43]等植物中均有對(duì)NHX基因家族的研究；Li等[42]研究認(rèn)為，植物NHX反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)于葡萄細(xì)胞的pH值、Na+和K+穩(wěn)態(tài)和鹽耐受性起到重要調(diào)節(jié)作用，同時(shí)NHX的表達(dá)在一定程度上對(duì)葡萄生長(zhǎng)開花起到影響作用。Krishnamurthy等[44]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因AoNHX1在擬南芥和水稻中的高表達(dá)，有利于其對(duì)土壤鹽分耐受性的增加和植株在鹽漬土壤中成活率升高。盡管已經(jīng)在許多物種中進(jìn)行了基因組和功能研究，但尚未描述辣椒NHX家族。與參考文獻(xiàn)部分不符。

通過(guò)對(duì)辣椒中NHX基因家族生物信息學(xué)功能探究發(fā)現(xiàn)，其蛋白理化性質(zhì)中，7個(gè)辣椒NHX基因各自分布在6條染色體上，其基因大小之間差異明顯，各基因等電點(diǎn)變化范圍差異較大，分布在5.53～9.18。CaNHX4和CaNHX7的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，這2個(gè)基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定。7個(gè)NHX蛋白中CaNHX1～CaNHX4、CaNHX6和CaNHX7均不具有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白類型，而CaNHX5則相反。辣椒中7個(gè)NHX蛋白疏水性較高，整條多肽鏈表現(xiàn)為疏水性，其N 端含有大量的疏水氨基酸這與郭強(qiáng)等[45]研究結(jié)果相似，且均有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，都屬于跨膜蛋白。CaNHXs基因家族成員在細(xì)胞膜(除CaNHX5)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡中均有著不同程度的表達(dá)。7個(gè)NHX基因序列有較高的同源性，同時(shí)均包含Na+/H+exchange保守結(jié)構(gòu)域，且在功能域上都是高度保守的，都含有上游和下游基因序列，基因結(jié)構(gòu)完整。其二級(jí)結(jié)構(gòu)包含內(nèi)容完整。在蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹中屬于不同分支，可能這7個(gè)NHX在辣椒體內(nèi)有著不同調(diào)控作用。順式作用元件分析說(shuō)明，CaNHXs在植株細(xì)胞分裂、激素信號(hào)響應(yīng)以及在逆境生長(zhǎng)中有調(diào)節(jié)作用。分析蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，除CaNHX1～CaNHX4的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)高度保持一致，剩余CaNHX5、CaNHX6 和CaNHX7的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)由于其基因結(jié)構(gòu)中內(nèi)含子/外顯子之間數(shù)目和分配位置大小差距過(guò)大，進(jìn)而致使各個(gè)基因組和編碼氨基酸數(shù)目上存在較大的差異水平使得三級(jí)結(jié)構(gòu)各不相同。

本試驗(yàn)研究表明，在NaCl處理后，CaNHX1～CaNHX7在辣椒葉片中的相對(duì)表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì)，其中CaNHX6的基因表達(dá)量最高，是0 h的13.6倍，這與王影等[46]和Ohta等[47]的研究結(jié)果基本相似，郭強(qiáng)等[45]研究馬藺時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl濃度從0～200 mmol/L 增加時(shí)，葉片中NHX基因表達(dá)量顯著增大，劉雪華等[48]發(fā)現(xiàn)，在150 mmol/L NaCl處理下，受到鹽分調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)蕎麥體內(nèi)NHX基因表達(dá)量顯著增加。在GA3處理后，CaNHX5和CaNHX6在辣椒葉片中表達(dá)量均呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，在JA處理后，辣椒葉片中CaNHX1和CaNHX2以及CaNHX4和CaNHX7的表達(dá)量受到明顯抑制作用，NHX基因表達(dá)量顯著降低，其余則相反。在PEG處理下，辣椒CaNHX1～CaNHX7基因表達(dá)量在葉片中均上調(diào)表達(dá)，其中CaNHX6的基因表達(dá)量最高，是0 h的13.5倍。盧世雄等[49]研究葡萄在10% PEG脅迫時(shí)發(fā)現(xiàn)，葉片中NHX基因表達(dá)量顯著升高為對(duì)照的5倍。

總之，本研究所獲得的結(jié)果，可以為進(jìn)一步探索辣椒CaNHX基因的功能開發(fā)以及辣椒耐鹽抗旱育種基因提供基礎(chǔ)。