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山蒼子精油抑制沙門菌作用機制研究

2021-07-02 14:48李欣越茍玉虹申瀚君李育浩尹立子
四川農業(yè)大學學報 2021年3期
關鍵詞:沙門菌液細胞膜

李欣越,茍玉虹,申瀚君,李育浩,王 濤,尹立子

(四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院,成都 611130)

沙門菌屬(Salmonella)是一種在自然界廣泛分布的革蘭氏陰性細菌,可感染人和動物引發(fā)菌血癥、敗血癥、胃腸炎等,威脅人和動物的健康[1-2]。據美國疾病預防控制中心(CDC)統(tǒng)計,沙門菌在美國每年會造成135萬人感染,26 500人住院,400余人死亡;在全球可造成超過9 000萬人感染和15余萬人死亡[3]。因其廣泛存在于肉類、乳類、蛋類、果蔬類食品甚至土壤中,故由其引起的感染主要是食源性的[4]。已有研究發(fā)現(xiàn),從人體和雞肉中分離的沙門菌對四環(huán)素、氨芐西林等多種抗生素產生了高度耐藥性[5]。因此,尋找沙門菌的有效防治方法、維護公共衛(wèi)生已迫在眉睫。

植物精油是從植物的果實、花、葉、根等中提取得到的揮發(fā)性芳香物質,含量低但卻有多種生物活性,近年來在食品抗菌方面的應用研究尤其深入[6-7]。山蒼子精油(Litsea cubeba essential oil,LC-EO)呈淡黃色,由山蒼子果實中提取得到,且有強烈的檸檬味。山蒼子精油有廣譜抗菌作用,Liu T.等[8]和趙露露等[9]的研究表明,山蒼子精油對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等細菌都有良好的抑菌活性。戴錦銘[10]的研究表明山蒼子精油可以破壞大腸桿菌的細胞膜、影響其能量代謝、抑制其蛋白質合成、減少胞內DNA含量等。吳均等[11]的研究發(fā)現(xiàn),山蒼子精油可以改變金黃色葡萄球菌菌體的通透性、降低其蛋白質的利用率。但目前山蒼子精油對沙門菌的抑菌機理方面的研究還很少。本研究旨在從細胞膜通透性、形態(tài)結構、可溶性蛋白質含量、生物被膜形成等方面探究山蒼子精油對鼠傷寒沙門菌的抑菌機制。為防治沙門菌引起的食物中毒、開發(fā)以山蒼子精油為基礎的新型藥食同源產品提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 藥品和菌株

山蒼子精油(純度≥98%,成都瑞芬思公司)用二甲亞砜(成都浩博優(yōu)公司)溶解,配制成質量濃度為40.96 mg/mL的母液備用;鼠傷寒沙門菌標準菌株(ATCC 14028)由四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學實驗室保存。

1.2 試劑和器材

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、腦心浸出液肉湯(BHI)購自杭州微生物試劑公司;PBS磷酸緩沖鹽粉劑、2.5%Gluta固定液、無水葡萄糖購自成都浩博優(yōu)公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自南京建成生物公司;SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、4×雙色蛋白上樣緩沖液、雙色預染蛋白Marker購自成都羅寧生物公司。

UV-2000型紫外分光光度計(UNICO,美國)、ZD-85A氣浴恒溫振蕩器(金壇市科析儀器公司,中國)、DDS-307電導率儀(上海儀電科學儀器公司,中國)、全功能凝膠成像系統(tǒng)儀(Bio-Rad公司,美國)。

1.3 方法

1.3.1 山蒼子精油對沙門菌生長的影響

采用二倍稀釋法測定山蒼子精油對沙門菌的MIC,設立只加菌液的陽性對照組,只加山蒼子精油的陰性對照組,只加培養(yǎng)基的空白對照組,37℃恒溫培養(yǎng)16~24 h后,用肉眼進行觀測,所有透明且澄清的試管中,含最小的山蒼子精油濃度的試管所設定的濃度值,即為MIC[12]。采用平板畫線法測定MBC,從MIC試驗中所有澄清的試管中吸取0.1 mL均勻涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h后觀察計數(shù),以5個以下菌落的培養(yǎng)基所對應的山蒼子精油濃度為MBC[13]。

吸取80 μL過夜培養(yǎng)的沙門菌菌液于30 mL BHI培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),當菌液OD600=0.3時,加入山蒼子精油,并使其質量濃度為 0、32、64、128、256 和512 μg/mL,振蕩培養(yǎng)。并在第 0、1、2、4、6、8、16、24 h測定其OD600值,繪制生長曲線。

1.3.2 山蒼子精油對沙門菌電導率的影響

參考F.Bendali等[14]的方法,取培養(yǎng)至對數(shù)期的沙門菌液1 mL接種于50 mL TSB液體培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)16 h后,加入山蒼子精油使其質量濃度等于2 MIC,對照組加入同體積的DMSO。37℃恒溫培養(yǎng),在第0、1、2、4、6和 8h時,分別取5 mL菌液,4500r/min離心10 min,取適量上層澄清液體,將其按1∶40比例與5%的無菌葡萄糖溶液混合,用電導率儀測定混合溶液的電導率。

1.3.3 山蒼子精油對沙門菌細胞膜電位的影響

呂:當然,你的《德克薩斯》的價值除了展現(xiàn)戰(zhàn)爭跳動的旋律和令人窒息的危險,在表述戰(zhàn)爭的慣性恐怖感受和作戰(zhàn)的超現(xiàn)實主義方面成功外,啟示人們用另一種眼光來審視世界的,給讀者更大闡釋空間的是你對處在戰(zhàn)爭這一非常態(tài)下的情愛的描寫,對非常態(tài)的情愛的這種人文關懷同樣令我癡迷。特別想聽聽你自己是如何詮釋小說中蘇珊與克洛特·蓋博之間的情愛的。

參考楊磊等[15]的方法,將沙門菌于MH培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5~0.6后,取適量菌液,3 000 r/min離心10 min,舍棄上層澄清液體,用5 mmol/L含葡萄糖的HEPES緩沖液洗滌沉淀并將其稀釋至OD600=0.05左右。向適量稀釋后的菌液中加入0.4 mmol/L DISC3(5)工作液并使其最終濃度為 0.8 μmol/L,在室溫下避光振蕩1.5 h后,加入4 mol/L KCL工作液并使其最終濃度為100 mmol/L,在室溫下避光振蕩0.5 h。取200 μL制備的菌液,在避光處迅速加入山蒼子精油并使其最終濃度為 0、64、128、256、512 μg/mL,激發(fā)光622 nm、發(fā)射光670 nm條件下,間隔5 min,時長30 min,檢測熒光強度。

1.3.4 山蒼子精油對沙門菌細胞形態(tài)結構的影響

將沙門菌在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期,加入山蒼子精油使其濃度等于2 MIC,對照組加入同體積的DMSO,振蕩培養(yǎng)。分別在第12、16、24 h時取適量菌液,4 500 r/min離心10 min,保留沉淀并用PBS緩沖液洗滌2次,用Gluta固定液固定,12、16 h樣品經脫水、浸透、包埋、修塊、切片、染色處理,在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)結構[16];24 h樣品經脫水、干燥、鍍金后在掃描電鏡下觀察細胞的形態(tài)結構[17]。

1.3.5 山蒼子精油對沙門菌可溶性蛋白的影響

按探究山蒼子精油對沙門菌的形態(tài)結構的影響樣品制備步驟,用PBS緩沖液洗滌下層菌體沉淀3次并定容至1 mL。將定容后的菌液超聲破碎后,6 000 r/min離心10 min,取適量上層清液,用BCA蛋白試劑盒測定其中的蛋白質含量。將上清液與蛋白上樣緩沖液按3∶1體積比混合,高溫變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳實驗,經染色、脫色、成像后觀察蛋白質電泳結果[18]。

1.3.6 山蒼子精油對沙門菌生物被膜形成的影響

向5個TSB培養(yǎng)基中加入山蒼子精油并使其濃度為 0、8、16、32、64 μg/mL,將沙門菌振蕩培養(yǎng)至OD600=0.2后,取10 μL菌懸液于96孔板中,每孔再加290 μL含蔗糖和對應濃度山蒼子精油的TSB培養(yǎng)基,37℃靜置培養(yǎng)48~72 h。移除96孔板中混合溶液,加入10 μL 10%甲醛溶液并室溫培養(yǎng)過夜,移除甲醛溶液,加入100 μL 0.1%的結晶紫并在室溫放置30 min,移除結晶紫,用雙蒸水小心沖洗孔板,加入200 μL 33%乙酸溶液后,用酶標儀測OD570值[19]。

2 結果與分析

2.1 山蒼子精油對沙門菌生長的影響

圖1 山蒼子精油對沙門菌生長曲線的影響Figure 1 The growth curve of LC-EO against Salmonella

2.2 山蒼子精油對沙門菌電導率的影響

當細菌細胞膜通透性改變時,其細胞內的無機鹽等會滲透過細胞膜到細胞外,從而引起菌液電導率的增加[20]。據此原理,本實驗對加入2 MIC濃度的山蒼子精油的鼠傷寒沙門菌液電導率進行測定。據圖2,與0 h的數(shù)據相比,菌懸液培養(yǎng)1 h的電導率為(8.39±0.50)%(P<0.01);培養(yǎng) 2 h的電導率為(9.82±0.49)%(P<0.01);培養(yǎng) 8 h 的電導率為(8.39±0.37)%(P<0.01)。而加入 DMSO 的菌液的電導率基本不變。由此可看出,山蒼子精油可迅速且顯著地改變沙門菌細胞膜的通透性。

圖2 2 MIC的山蒼子精油對沙門菌菌懸液電導率的影響Figure 2 Effect of 2 MIC LC-EO on conductivity of Salmonella suspension

2.3 山蒼子精油對沙門菌細胞膜電位的影響

當細菌細胞膜破損或發(fā)生去極化時,DISC3(5)熒光探針可進入細胞水相溶液發(fā)出可檢測熒光,引起熒光值變化[15]。據圖3,與未加入山蒼子精油的對照組相比,加有山蒼子精油的沙門菌的熒光強度均增大,且呈濃度依賴性。在30 min內,加有山蒼子精油的沙門菌熒光強度總體略呈增加趨勢,而對照組率呈降低趨勢。表明山蒼子精油使沙門菌細胞膜發(fā)生了破損,改變了其通透性。

圖3 不同濃度的山蒼子精油對沙門菌細胞膜電位的影響Figure 3 Effect of different mass concentration LC-EO on membrane potential of Salmonella

2.4 山蒼子精油對沙門菌細胞形態(tài)結構的影響

據圖4,對照組細胞形態(tài)結構完整、邊界清晰,胞內染色質和生物被膜豐富。而經山蒼子精油處理的菌體,在透射電鏡下觀察到細胞變形,細胞膜皺縮、破損甚至溶解,從而使細胞內容物流出,胞質減少而染色變淺,且出現(xiàn)大量空泡化;在掃描電鏡下觀察到細胞膜塌陷,細胞發(fā)生粘連而邊界不清晰,形態(tài)結構不完整。

圖4 山蒼子精油對沙門菌形態(tài)結構的影響Figure 4 Effects of LC-EO on morphological structures of Salmonella cells

2.5 山蒼子精油對沙門菌可溶性蛋白的影響

BCA蛋白試劑盒測定結果顯示,山蒼子精油作用12、16 h后,鼠傷寒沙門菌的可溶性蛋白分別減少(41.69±0.97)%(P<0.01)、(39.05±0.92)%(P<0.01)。據圖5,經2 MIC的山蒼子精油處理后,分子量在40 000和70 000左右的可溶性蛋白質減少,分子量在25 000~30 000間的蛋白質明顯減少甚至消失。由此可看出,山蒼子精油可使沙門菌的可溶性蛋白質減少。

圖5 山蒼子精油對沙門菌可溶性蛋白質含量的影響Figure 5 Effect of LC-EO on the soluble protein contents of Salmonella

2.6 山蒼子精油對沙門菌生物被膜的影響

據圖6,與對照組相比,經不同亞抑菌濃度的山蒼子精油處理后,8 μg/mL組的生物被膜總量減少(19.25±3.42)%(P<0.01);16 μg/mL 組的生物被膜總量減少(37.73±2.84)%(P<0.01);32 μg/mL 組的生物被膜總量減少(56.91±3.40)%(P<0.01);64 μg/mL組的生物被膜總量減少(65.91±4.41)%(P<0.01)。據此可知,經亞抑菌濃度的山蒼子精油處理后,沙門菌生物被膜的形成均被抑制,且隨山蒼子精油濃度增高,抑制作用增強,呈濃度依賴性。

圖6 不同濃度的山蒼子精油對沙門菌生物被膜形成的影響Figure 6 Effects of different concentrations of LC-EO on biofilm formation of Salmonella

3 討論與結論

沙門菌感染是食源性疾病的主要原因,研究表明目前沙門菌已有較高的耐藥性[21]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),山蒼子精油對鼠傷寒沙門菌的MIC和MBC均為256 μg/mL,表明山蒼子精油對沙門菌有明顯的抑制和殺滅作用,山蒼子精油可作為沙門菌的殺菌藥,因此,以山蒼子精油為基礎開發(fā)相關產品,治療沙門菌引起的感染性疾病有很大前景。

細胞膜是細胞的屏障,受損會改變細胞的通透性,影響細胞的新陳代謝[22]。膜電位試驗中,加有山蒼子精油的沙門菌的細胞膜電位與對照組相比均增大,表明山蒼子精油改變了沙門菌的通透性。電導率試驗再次證明了這一觀點。這與孟玉霞等[23]的結論一致。

蛋白質是生命的物質基礎。何學文等[24]發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度的肉桂醛可使沙門菌蛋白質條帶變淺甚至部分條帶消失。本實驗研究發(fā)現(xiàn),山蒼子精油可使沙門菌的蛋白質含量減少,部分蛋白質條帶變淺甚至消失,這可能是因為山蒼子精油改變了沙門菌膜結構的通透性和完整性,蛋白質外流所致。

生物被膜不僅可幫助菌體適應環(huán)境利于生存,還可以導致細菌的耐藥性和持續(xù)性感染。本實驗發(fā)現(xiàn),亞抑菌濃度的山蒼子精油可明顯抑制沙門菌生物被膜的形成。崔海英等[25]的研究表明山蒼子精油可通過清除胞外聚合物來破壞MRSA生物膜的結構,抑制膜內細菌的代謝水平,山蒼子精油對沙門菌生物被膜的作用機制可能如此。

山蒼子精油來源廣泛,價格低廉,具有副作用小、不易產生耐藥性的優(yōu)勢。根據GB2760-86標準,我國已批準山蒼子精油用于食品中,因其無毒副作用,其還被廣泛用于醫(yī)藥、化工等行業(yè)[26]。因此,以山蒼子精油為原料,將其制成食品保鮮劑或藥食同源產品有良好前景。

綜上所述,山蒼子精油可明顯抑制沙門菌生長,可通過改變沙門菌的細胞通透性、抑制生物被膜合成、減少可溶性蛋白質含量、改變細菌形態(tài)結構來影響沙門菌的新陳代謝,從而起到抑菌和殺菌作用。為更好地開發(fā)出山蒼子精油的相關產品以抑制沙門殺菌,還應探究山蒼子精油對沙門菌遺傳物質的作用,并進行相關體內抑菌實驗。

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