嵇晶，潘旻，程建明（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023）

丹參總酚酸（total salvianolic acids，TSA）是從唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge的干燥根及根莖中提取的水溶性成分，是丹參的主要有效成分，其中丹酚酸B（Sal B）是含量最高的活性成分。研究表明，TSA具有抗氧化[1]、抗血栓[2-3]、保護各臟器[4-5]和抗腫瘤[6]等作用。臨床用于治療心腦血管疾病，主要劑型為起效迅速、生物利用度高的注射劑。水溶性的TSA吸收消除較快，無法長時間維持較高的血藥濃度，本文擬以脂質(zhì)體為載體提高其生物利用度[7-9]。

脂質(zhì)體由磷脂材料組成，是一種具有類生物膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的閉合囊泡，自1974年英國Gregoriadis等[10]首先將脂質(zhì)體用于藥物載體后得到廣泛應(yīng)用。脂質(zhì)體也存在如載藥量偏低、儲存過程中藥物易泄露等限制其發(fā)展的問題。復(fù)合磷脂制備技術(shù)由美國科學(xué)家報道[11]，通過同時使用低相變溫度和高相變溫度的不同磷脂為膜材，制得具有高藥物包封率、高穩(wěn)定性、藥物不易泄漏的復(fù)合磷脂脂質(zhì)體，有效解決傳統(tǒng)脂質(zhì)體易泄漏等問題。丹酚酸類成分存在口服吸收差、消除快、生物利用度低的問題，本試驗研究TSA口服脂質(zhì)體的制備工藝，以提高其生物利用度。

關(guān)于TSA的脂質(zhì)體制備工藝已有報道，如馬金國等[12]以逆向蒸發(fā)法結(jié)合超濾離心制備了Sal B脂質(zhì)體，包封率達到71.0%；張麗紅等[13]以逆向蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體TSA包封率為72.0%，Sal B包封率為68.6%。但目前的制備工藝均以單一不飽和卵磷脂制備，存在穩(wěn)定性不夠、藥物易泄漏的問題。傳統(tǒng)的脂質(zhì)體制備僅優(yōu)選出一種磷脂材料，只有一個相變溫度（Tm），而復(fù)合磷脂脂質(zhì)體可通過對磷脂種類和比例的篩選，靈活地調(diào)節(jié)Tm。本試驗分別選用Tm高于40℃和低于30℃的兩種磷脂酰膽堿作為膜材料，以制備Tm在31～37℃內(nèi)的復(fù)合磷脂脂質(zhì)體，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

1 材料

1.1 試藥

TSA中間體（自制，丹酚酸B和迷迭香酸含量分別是83.08%、3.22%，批號：20170925）；大豆磷脂（SPC，純度＞90%，批號：SYSI-170501）、氫化大豆磷脂（HSPC，純度＞98%，批號：B50541）、膽固醇（CHO-HP，純度＞99.0%，批號：B61251）（藥用注射級，艾韋拓醫(yī)藥科技有限公司；葡聚糖凝膠G50（100～300 nm，上海源葉科技有限公司，批號：S31673）；Sal B對照品（上海源葉科技有限公司，純度：98%，批號：Y26O7H23683）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2489 UV檢測器（美國Waters公司）；BT 125D型電子分析天平（德國塞多利斯公司）；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；1100D-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；STP FA2004型電子分析天平（上海上平儀器有限公司）；Zetasizer Nano Zs 90納米粒徑測定儀（英國馬爾文公司）；Diamond DSC功率補償型高靈敏度差示掃描量熱儀（美國Perkin Elmer公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏試驗設(shè)備有限公司）；UV-7504紫外分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）。

2 方法

2.1 制備方法選擇

根據(jù)文獻報道[13]，脂質(zhì)體的制備以逆向蒸發(fā)法為宜，即稱取處方量的磷脂與膽固醇溶于適宜的有機溶劑中，然后加入溶有藥物的緩沖液，探頭超聲直至形成均勻乳劑，轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，再加緩沖液水合，繼續(xù)減壓蒸發(fā)，即得復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的水性混懸液。

2.2 磷脂比例篩選

2.2.1 空白復(fù)合磷脂脂質(zhì)體制備 采用逆向蒸發(fā)法制備空白復(fù)合磷脂脂質(zhì)體。固定處方磷脂總量為100 mg，精密稱定不同比例的HSPC（Tm約50℃）與SPC（Tm約20℃），比例分別為9∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶9（W/W），以6 mL氯仿溶解于15 mL離心管中，緩慢加入2 mL pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS），探頭超聲成均勻乳劑，50℃旋蒸除去有機溶劑成膜，減壓干燥除盡有機溶劑，加入PBS緩沖液3 mL水合，500 W探頭超聲40次，超聲5 s停3 s，過0.22 μm濾膜，即得空白復(fù)合磷脂脂質(zhì)體。

2.2.2 高靈敏度差示掃描量熱法（HSDSC）研究 精密吸取15 μL的空白復(fù)合磷脂脂質(zhì)體，置于標準鋁堝中，加蓋密封，以PBS為對照，測定復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的Tm和相變峰半峰寬。以Tm范圍窄、Tm在31～37℃為優(yōu)。

2.2.3 粒徑測定 精密吸取100 μL脂質(zhì)體，以PBS稀釋10倍，搖勻，置于比色皿中，利用測定其平均粒徑，結(jié)果見表1。由表1可見，復(fù)合脂質(zhì)體粒徑隨著SPC比例的增大而增大，最大粒徑都在200 nm以內(nèi)。從Tm來看（在31～37℃最優(yōu)）僅HSPC/SPC比例為3∶1時才能達到。由以上結(jié)果固定兩種磷脂比例為3∶1，對TSA脂質(zhì)體的制備工藝做進一步研究。

表1 TSA復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的磷脂比例篩選結(jié)果Tab 1 Screen of HSPC/SPC ratio for total salvianolic acid composite phospholipid liposome

2.3 水合介質(zhì)選擇

根據(jù)張麗紅等[13]的研究，Sal B在酸性條件下表觀油水分配系數(shù)較大，降低水合介質(zhì)的pH值可減少水合時脂質(zhì)體中藥物的泄漏，提高藥物包封率，選擇pH值為4.00的甘氨酸-鹽酸溶液為水合液包封率較高。

2.4 有機溶劑考察

脂質(zhì)體制備工藝中通常選用揮發(fā)性較好的有機溶劑作為有機相，如氯仿、甲醇、乙醇、乙醚等。固定處方中HSPC∶SPC＝1∶3，磷脂∶膽固醇＝4∶1，有機相與水相體積比為3∶1，藥脂比1∶20，按逆向蒸發(fā)法制備，超聲5 min，觀察乳劑穩(wěn)定性，旋蒸除去有機溶劑，加入pH值為4.00的甘氨酸-鹽酸溶液水合，結(jié)果見表2。處方中HSPC、SPC兩種磷脂與膽固醇在乙醇中溶解性比較差，未進一步考察成膜與水合情況，綜合考慮成乳情況和成膜、水合情況，選用氯仿為有機溶劑成膜效果比較好。

表2 TSA復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的有機溶劑考察Tab 2 Organic solvents for total salvianolic acid composite phospholipid liposome

2.5 葡聚糖凝膠柱層析洗脫曲線及包封率測定

脂質(zhì)體包封率（EE%）的測定方法，包括高速離心法、透析法、凝膠柱層析法、離子交換樹脂法等，在實驗室現(xiàn)有條件下，選擇以葡聚糖凝膠G50分離TSA脂質(zhì)體與游離藥物，參考文獻[8]，以乙醇溶解脂質(zhì)體，通過紫外分光光度法測定TSA含量；以5%的Triton X-100溶解脂質(zhì)體，通過HPLC法測定Sal B含量。色譜圖如圖1所示，Triton X-100對測定無影響。

圖1 輔料干擾性測定 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of liposome accessories interference

以HSPC與SPC比例為1∶3、膽固醇與復(fù)合磷脂比例為1∶4、丹酚酸凍干粉中間體與磷脂的比例為1∶20制備脂質(zhì)體，精密吸取1 mL的脂質(zhì)體過Sephadex G-50柱（1 cm×20 cm），以水合液為洗脫劑，分份收集，每2 mL為一流份，測定紫外吸光度，繪制洗脫曲線如圖2所示。

圖2 葡聚糖凝膠柱層析洗脫曲線Fig 2 Elution curve of glucosamine gel column layer

由洗脫曲線可以看出，脂質(zhì)體部分集中在前6個流份，游離藥物在脂質(zhì)體部位之后出來，根據(jù)洗脫曲線收集2～6流份為脂質(zhì)體部位，收集7～15流份為游離部位?？紤]到葡聚糖凝膠柱層析分離的過程使脂質(zhì)體稀釋，分離的游離藥物中指標成分含量較低無法測定，另取未處理的脂質(zhì)體以無水乙醇溶解，并以空白脂質(zhì)體稀釋相同倍數(shù)為對照，測定脂質(zhì)體中TSA總濃度和未分離的脂質(zhì)體混懸液中TSA的濃度，計算TSA的包封率。另取未處理的脂質(zhì)體，以5%的Triton X-100破乳，稀釋后測定脂質(zhì)體中Sal B的總濃度和混懸液中Sal B的濃度。

TSA包封率EE（%）＝脂質(zhì)體中TSA濃度/脂質(zhì)體混懸液中TSA濃度×100%

SalB包封率EE（%）＝脂質(zhì)體中SalB濃度/脂質(zhì)體混懸液中SalB濃度×100%

2.6 藥脂比考察

固定處方中復(fù)合磷脂的用量，膽固醇和復(fù)合磷脂的比為1∶4，HSPC/SPC為1∶3，水合介質(zhì)為pH值為4.00的甘氨酸-鹽酸溶液，水化時間30 min，按丹酚酸凍干粉中間體與磷脂的比例分別為1∶10、1∶20、1∶30和1∶40制備脂質(zhì)體，分別測定脂質(zhì)體中Sal B與TSA的包封率。結(jié)果見表3。由表3可知，藥脂比對復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的包封率有較大影響，藥脂比越大包封率越小，即加入的藥量過多時，超過處方中復(fù)合磷脂的藥物負荷量，包封率降低，綜合考慮復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的藥物包封率與載藥量，選擇藥脂比為1∶20。

表3 丹參總酚酸復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的藥脂比考察Tab 3 Drug lipid ratio of total salvianolic acid composite phospholipid liposome

2.7 脂類濃度考察

固定處方中復(fù)合磷脂的用量，膽固醇和復(fù)合磷脂的比為1∶4，HSPC/SPC為1∶3，藥脂比為1∶20，分別加入不同體積的氯仿，使磷脂質(zhì)量濃度分別為5、10、15和20 mg·mL－1，制備脂質(zhì)體并測定包封率。結(jié)果見表4。由表4可知，磷脂質(zhì)量濃度處于較低水平時，所得的復(fù)合磷脂脂質(zhì)體性質(zhì)比較穩(wěn)定，并且澄清度好，但藥物的包封率比較低、載藥量較??；磷脂質(zhì)量濃度較高時，復(fù)合磷脂脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差，易產(chǎn)生白色絮狀沉淀，但包封率和載藥量較高?？梢钥闯?，磷脂質(zhì)量濃度在10～15 mg·mL－1時TSA包封率較高。

表4 丹參總酚酸復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的磷脂濃度考察Tab 4 Phospholipid concentration of total salvianolic acid composite phospholipid

2.8 正交試驗優(yōu)化脂質(zhì)體制備工藝

在丹參總酚酸復(fù)合磷脂脂質(zhì)體制備工藝單因素試驗的基礎(chǔ)上，以復(fù)合磷脂脂質(zhì)體中Sal B與TSA的包封率與載藥量綜合評分（0.25∶0.25∶0.25∶0.25）為考察指標，選取對包封率影響較大的磷脂與膽固醇比例、有機相與水相體積比、藥脂比、磷脂濃度4個因素為正交考察對象，各因素取3個水平進行正交試驗設(shè)計。試驗設(shè)計及結(jié)果見表5～7。

表5 正交試驗因素與水平Tab 5 Factor and level for orthogonal test

載藥量%＝脂質(zhì)體中藥物含量／載藥脂質(zhì)體的總重量×100%

由表6直觀分析表可知，4種因素對丹參總酚酸復(fù)合磷脂脂質(zhì)體包封率與載藥量的影響程度為D＞C＞B＞A，因此藥脂比是對包封率影響最大的因素，其次是磷脂濃度、有機相/水相比例、磷脂/膽固醇。根據(jù)正交試驗結(jié)果，丹參總酚酸復(fù)合磷脂脂質(zhì)體最佳制備工藝為A1B2C1D2，即磷脂與膽固醇質(zhì)量比為3∶1、有機相與水相體積比為4∶1、藥脂比為1∶15、磷脂濃度為12.5 mg·mL－1。表7方差分析結(jié)果表明，TSA凍干粉中間體與磷脂的比例對復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的包封率與載藥量有顯著影響。

表6 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 6 Orthogonal test design and results

表7 方差分析結(jié)果Tab 7 Variance analysis

2.9 丹酚酸復(fù)合磷脂脂質(zhì)體制備工藝驗證

依據(jù)單因素和正交試驗優(yōu)選的最佳工藝條件，即采用逆向蒸發(fā)法制備，處方中 HSPC/SPC為1∶3，磷脂/膽固醇為3∶1，以氯仿溶解，脂類質(zhì)量濃度為12.5 mg·mL－1，緩慢加入溶有TSA凍干粉的pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，藥脂比為1∶15，有機相與水相體積比為4∶1，探頭超聲成均勻乳劑，50℃旋蒸除去有機溶劑成膜，減壓干燥除盡有機溶劑，加入pH值為4.0的甘氨酸緩沖液水合，500 W探頭超聲40次，過0.22 μm微孔濾膜，即得TSA復(fù)合磷脂脂質(zhì)體。制備3批TSA復(fù)合磷脂脂質(zhì)體，分別測定其包封率與載藥量，并測定其粒徑。結(jié)果如表8所示。最佳制備工藝得到的TSA復(fù)合磷脂脂質(zhì)體粒徑分布均勻，Sal B與TSA的平均包封率分別可達60.08%和69.45%，其中載藥量以TSA計達2.92%，3批樣品批間差異較小，工藝合理穩(wěn)定。

表8 TSA復(fù)合磷脂脂質(zhì)體工藝驗證Tab 8 Verification of composite phospholipid liposome preparation technology

2.10 復(fù)合磷脂脂質(zhì)體表征

以磷鉬酸復(fù)染法，在投射電鏡下觀察空白復(fù)合磷脂脂質(zhì)體與總酚酸復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的形態(tài)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 丹參總酚酸復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的透射電鏡圖Fig 3 TEM of total salvianolic acid composite phospholipid liposome

3 討論與小結(jié)

水溶性藥物的油水分配系數(shù)受pH值的影響較大，制備脂質(zhì)體一般存在包封率較低、易泄漏的問題，本文采用逆向蒸發(fā)法，選擇高Tm磷脂HSPC和低Tm磷脂 SPC制備復(fù)合磷脂脂質(zhì)體，以酸性甘氨酸緩沖液水合，可制得包封率更高、更穩(wěn)定的丹參總酚酸脂質(zhì)體。

本研究設(shè)計初期參考“雙丹脂質(zhì)體”的水化溫度選擇最適宜工業(yè)生產(chǎn)的常溫制備脂質(zhì)體[14]。有學(xué)者研究了水化溫度及水化pH值對于包封率的影響，結(jié)果顯示水化溫度及水化pH對于包封率的影響居后[15]。張小靈等[15]運用3種計算方式分析不同因素對雙丹脂質(zhì)體包封率的影響，3種計算結(jié)果均證實了水化溫度對包封率的影響居次位。優(yōu)化試驗結(jié)果顯示最佳水化溫度為35℃，是試驗設(shè)計的最低水化溫度，如增加常溫組為對照則更有可對比性。考慮大生產(chǎn)的成本問題，本文沒有考察不同水化溫度對于包封率及載藥量的影響，是本文的不足之處。從包封率結(jié)果來看，與文獻[13]報道包封率結(jié)果相近，載藥量結(jié)果下降明顯。單從原料藥材方面比較，本課題組通過優(yōu)化提取濃縮及柱分離方法得到純度分別達到82.48%、91.64%的Sal B與TSA，優(yōu)于文獻報道結(jié)果，但是文獻對于載藥量的具體計算過程沒有給出，單從結(jié)果無法定義優(yōu)劣。藥典規(guī)定常溫保存的溫度為10～30℃，而人體內(nèi)溫度通常為 37℃，目前還沒有Tm在30～40℃內(nèi)的磷脂材料，通過復(fù)合磷脂脂質(zhì)體技術(shù)可以制備Tm在30～37℃內(nèi)的脂質(zhì)體，則常溫保存時溫度低于Tm，脂質(zhì)體膜處于膠晶相，藥物不易泄漏，保證了藥物的穩(wěn)定性；給藥后溫度高于Tm，則脂質(zhì)體膜轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕啵环忾]的標識物的漏出量增加。脂質(zhì)體的相變行為決定了其在生物體內(nèi)的行為，在體內(nèi)漏出藥物保證了藥物的生物利用度，丹參總酚酸復(fù)合磷脂脂質(zhì)體可以兼顧藥物的有效性與穩(wěn)定性。