張 郃，龍 超，楊 麗，張森兵，董文理

0 引言

腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是腎移植及心血管大手術(shù)后常引發(fā)的急性腎損傷的病理生理過程。經(jīng)典的麻醉藥物嗎啡可在大鼠腎缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)中顯示出藥物預(yù)處理的保護(hù)作用[1]，氫嗎啡酮是嗎啡的半合成衍生物，鎮(zhèn)痛效應(yīng)是嗎啡的10倍，且不良反應(yīng)少，在前期研究發(fā)現(xiàn)，氫嗎啡酮預(yù)處理減輕大鼠心肌[2]、視網(wǎng)膜[3]的缺血再灌注損傷。有研究證實(shí)，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt)信號(hào)通路在RIRI中起著非常重要的調(diào)控作用[4]。本研究擬建立大鼠腎缺血再灌注模型，觀察氫嗎啡酮預(yù)處理對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷中PI3K/Akt信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 氫嗎啡酮注射液,宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；TNF-α、IL-6、MDA、SOD、酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，武漢賽格爾生物科技有限公司生產(chǎn)；Bax、Bcl-2 單克隆抗體，美國(guó) Cell Signaling Technology 公司生產(chǎn)；磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)抗體、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體,上海信裕生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物分組、給藥方法及RIRI模型建立 健康雄性清潔級(jí)成年SD大鼠36只，體重180～220 g，于溫度23 ℃、濕度50%環(huán)境下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖北科技學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(鄂)2018-0016。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(IRI組)和氫嗎啡酮預(yù)處理組，每組12只。造模前25 min實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射氫嗎啡酮30 μg/kg，其余兩組注射等量生理鹽水。腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，常規(guī)消毒鋪巾，三組大鼠背部腎區(qū)切口，鈍性分離肌肉組織和腎筋膜，分離雙側(cè)腎動(dòng)脈，S組大鼠只分離雙側(cè)腎動(dòng)脈但不夾閉，其余兩組夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈至腎臟顏色變?yōu)樯n白，缺血45 min時(shí)松開動(dòng)脈夾，恢復(fù)腎臟灌注至腎臟顏色變?yōu)轷r紅，制備缺血再灌注模型。于再灌注24 h后處死大鼠，取腎組織及血樣本。

1.3 HE染色法觀察各組IRI大鼠腎組織病理形態(tài) 各組隨機(jī)取4只大鼠左腎上極組織，10%福爾馬林固定24 h，隨后依次進(jìn)行酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。選取包含左腎上極組織的縱切面切片，切片厚度為5 μm，行常規(guī)HE染色。每組取5張切片進(jìn)行觀察，光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野(400×)進(jìn)行觀察并拍照。

1.4 ELISA法檢測(cè)血BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD水平 各組隨機(jī)取4只大鼠血清2 ml，室溫靜置20 min，6 000 r/min離心5 min，取上清。參照ELISA試劑盒說明，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD含量。

1.5 Western blot法測(cè)定腎組織Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá) 各組隨機(jī)取4只大鼠腎組織裂解提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離目的蛋白。冰浴轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉室溫封閉1～2 h。加入Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt抗體，4 ℃孵育過夜。二抗孵育1 h后TBST清洗，顯色曝光，掃描 膠片，BandScan軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)改變 S組腎小管、基底膜及刷狀緣結(jié)構(gòu)完整，清晰可見；IRI組腎小管腫脹明顯，基底膜及刷狀緣缺失或脫落，可見空泡狀壞死，腎間質(zhì)水腫明顯，并可見大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；與IRI組相比，H組腎小管、基底膜及刷狀緣結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，空泡狀壞死減少，腎間質(zhì)水腫不明顯，僅見少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織HE染色典型照片(400×)

2.2 各組大鼠血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD含量 與S組比較，IRI組和H組BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA含量均明顯升高，SOD含量均明顯降低(P<0.05)；與IRI組比較，H組BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA含量均明顯降低，SOD含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、SOD含量

2.3 各組大鼠腎組織Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較 與S組比較，IRI組及H組 Bax、p-PI3K、p-Akt相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，Bcl-2明顯降低(P<0.05)；與IRI組比較，H組Bcl-2、p-PI3K、p-Akt相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，Bax明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 大鼠腎組織Bax、Bcl-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，吸入類[5]、右美托咪定[6]等麻醉藥物可在大鼠腎缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)中顯現(xiàn)出預(yù)處理后的保護(hù)作用。既往的基礎(chǔ)研究表明，阿片受體激動(dòng)劑預(yù)處理在腎缺血再灌注損傷模型中的保護(hù)作用機(jī)制多與激活了阿片受體有關(guān)，主要通過啟動(dòng)減弱炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、減少氧自由基生成、抗凋亡挽救激酶信號(hào)途徑等方式得以實(shí)施[1,7]。

氫嗎啡酮是一種強(qiáng)效的阿片類鎮(zhèn)痛藥，在RIRI模型中是否具有類似效應(yīng)，還需進(jìn)一步證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，氫嗎啡酮預(yù)處理后，RIRI模型大鼠腎小管無明顯腫脹，間質(zhì)水腫較少，刷狀緣較整齊，空泡變性壞死輕微，提示氫嗎啡酮可減輕RIRI的腎組織病理損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，IRI組大鼠血清BUN、Scr、TNF-α、IL-6、MDA、Bax升高，SOD、Bcl-2下降，其腎功能受損、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡程度均較S組加重，而采用氫嗎啡酮預(yù)處理后，上述癥狀和指標(biāo)均有明顯改善，說明氫嗎啡酮可在腎缺血再灌注損傷的過程中發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗凋亡的保護(hù)作用。

經(jīng)典PI3K/Akt信號(hào)通路的研究在RIRI模型中，其主要病理過程為外界刺激和(或)創(chuàng)傷促使PI3K的活化，加速其磷酸化轉(zhuǎn)化為PIP3，進(jìn)而誘導(dǎo)Akt的磷酸化，而活化的 Akt可調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等過程[8]。有報(bào)道，嗎啡[9]、舒芬太尼[10]等阿片類藥物均可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)，從而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)細(xì)胞凋亡，也有研究表明，氫嗎啡酮可通過調(diào)節(jié)Bax 及Bcl-2 表達(dá)抑制其凋亡，進(jìn)而減輕其缺血再灌注損傷[11]。在腎缺血再灌注損傷模型的研究中，其他藥物或保護(hù)措施也可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，減少小鼠RIRI的TNF-α、IL-6表達(dá)水平，減輕炎癥反應(yīng)[12-13]；也可抑制腎內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，并減少ROS的釋放，調(diào)節(jié)SOD、MDA的表達(dá)，提高細(xì)胞存活率[14]；并可抑制促凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase等的形成，抑制腎細(xì)胞凋亡[15]，達(dá)到減輕腎缺血再灌注損傷的目的。本研究顯示，IRI組及H組 p-PI3K、p-AKT含量均明顯升高，且H組p-PI3K、p-Akt明顯高于IRI組，說明氫嗎啡酮也可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腎缺血再灌注損傷的程度。

本研究中，IRI組及H組的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡水平均較S組增加，而采用氫嗎啡酮預(yù)處理后，上述變化得以緩解，但p-PI3K、p-AKT的表達(dá)則相對(duì)升高，推測(cè)氫嗎啡酮可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，減輕腎缺血再灌注損傷過程中的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡。

綜上所述，氫嗎啡酮可通過PI3K/Akt 信號(hào)通路調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡水平，減輕大鼠腎缺血再灌注損傷。