鄭瑞生 林雅萍 孫秋瓊 張冰泉 鄭宗平

(1.泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362002；2.安記食品股份有限公司，福建 泉州 362001；3.中紡檢測(cè)〔福建〕有限公司，福建 泉州 362002)

馬鮫魚為暖水性中上層低值魚，肉質(zhì)細(xì)膩、味道鮮美，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。中國(guó)福建馬鮫魚資源豐富，且馬鮫魚加工企業(yè)繁多，加工產(chǎn)品有馬鮫魚卷、馬鮫魚羹等。僅福建省惠安縣某食品企業(yè)馬鮫魚年加工量近1 800 t，加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料(魚皮、魚骨、魚頭等)，占全魚總質(zhì)量的45%～55%。這些下腳料中含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、多糖、礦物質(zhì)、生物活性肽等[2]，目前僅作為制備動(dòng)物飼料之用[3]，附加值低。

近年來(lái)，越來(lái)越多的人開(kāi)始關(guān)注馬鮫魚下腳料的綜合開(kāi)發(fā)利用，如：萃取魚油[4]，提取蛋白酶解產(chǎn)物中的呈味物質(zhì)[5]，提取魚皮膠原蛋白[6]，提取抗氧化肽[7]等，也有利用馬鮫魚魚頭制備寵物犬餅干[8]，以及快速預(yù)測(cè)馬鮫魚貨架期[9]的相關(guān)報(bào)道。但未見(jiàn)利用馬鮫魚下腳料制備海鮮醬的相關(guān)研究報(bào)道。

海鮮醬是以蝦、魚、貝、藻等海洋生物或其下腳料為原料，經(jīng)腌制、發(fā)酵等工藝制成的一種風(fēng)味典型、營(yíng)養(yǎng)豐富的醬類風(fēng)味調(diào)味品。目前中國(guó)海鮮醬制品多以傳統(tǒng)的自然發(fā)酵工藝為主，所制得的海鮮醬制品組織細(xì)膩，風(fēng)味較好，營(yíng)養(yǎng)豐富。但在生產(chǎn)過(guò)程中極易受微生物污染，且生產(chǎn)周期長(zhǎng)，品質(zhì)不穩(wěn)定[10]。試驗(yàn)擬以馬鮫魚下腳料為原料，研究不同酶解工藝對(duì)提高馬鮫魚下腳料蛋白水解度及氨基酸態(tài)氮含量的影響，并利用下腳料酶解液制備具有特殊風(fēng)味的海鮮調(diào)味醬，以期為馬鮫魚下腳料的再利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬鮫魚下腳料：主要為馬鮫魚魚頭、魚皮、魚鰭、魚尾、內(nèi)臟等，惠安瑞芳食品有限公司；

風(fēng)味蛋白酶(酶活12.9萬(wàn)U/g)、木瓜蛋白酶(酶活4.2萬(wàn)U/g)、中性蛋白酶(酶活23.5萬(wàn)U/g)、復(fù)合蛋白酶(酶活11.1萬(wàn)U/g)、堿性蛋白酶(酶活22.3萬(wàn)U/g)：廣西龐博生物工程公司；

硫酸銅：分析純，沈陽(yáng)新西試劑廠；

氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸鉀、硼酸：分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸、甲醛：優(yōu)級(jí)純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：BS124S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱：BGZ-146型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；

高壓滅菌鍋：YXQ-LS-70A型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；

自動(dòng)凱氏定氮儀：K9840型，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；

均質(zhì)機(jī)：T-18型，德國(guó)IKA儀器設(shè)備有限公司；

高速打漿機(jī)：18型，邢臺(tái)裕隆機(jī)械廠；

索氏抽提器：SXT-06型，上海洪記儀器設(shè)備有限公司；

精密pH計(jì)：PHS-3C型，上海雷磁儀器有限公司。

1.3 馬鮫魚下腳料及酶解液各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)

1.3.1 水分 按GB 5009.3—2016執(zhí)行。

1.3.2 蛋白質(zhì)及總氮 按GB 5009.5—2016執(zhí)行。

1.3.3 氨基酸態(tài)氮 按GB 5009.235—2016執(zhí)行。

1.3.4 粗脂肪 按GB 5009.6—2016執(zhí)行。

1.3.5 水解度的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]。

(1)

式中：

D——水解度，%；

AN——酶解液中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度，g/100 mL；

TN——酶解液中總氮質(zhì)量濃度，g/100 mL。

1.4 馬鮫魚下腳料酶解工藝研究

1.4.1 工藝流程

馬鮫魚下腳料→除雜→攪碎→調(diào)節(jié)液料比→酶解→過(guò)濾→均質(zhì)→4 ℃冷藏備用

1.4.2 操作要點(diǎn)

(1)馬鮫魚下腳料采集：主要為馬鮫魚魚頭、魚皮、魚鰭、魚尾、內(nèi)臟等，-20 ℃隔夜冷凍后裝入泡沫保溫箱運(yùn)輸至海洋與食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃凍藏備用。

(2)除雜、攪碎：將馬鮫魚下腳料(魚皮、魚頭、魚尾、魚鰭、內(nèi)臟)去除雜質(zhì)，混合放入打漿機(jī)中進(jìn)行絞碎，取出，分裝后放入-20 ℃冷凍備用。

(3)酶解：取馬鮫魚下腳料500 g，設(shè)定不同的蛋白酶種類、酶解時(shí)間、液料比、溫度、pH、加酶量6個(gè)因素，進(jìn)行馬鮫魚下腳料的酶解試驗(yàn)。

(4)過(guò)濾：酶解液過(guò)100目濾篩，去除多余雜質(zhì)。

(5)均質(zhì)：利用T18型IKA均質(zhì)機(jī)對(duì)濃縮酶解液進(jìn)行處理，每均質(zhì)30 s暫停5 s，持續(xù)5 min。

1.4.3 酶解工藝優(yōu)化

(1)蛋白酶種類對(duì)酶解效果的影響：選擇風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，在加酶量2 000 U/g、液料比(V水∶m下腳料)4∶1(mL/g)、酶解時(shí)間4 h，以及各自適宜pH和溫度下進(jìn)行酶解，以氨基酸態(tài)氮含量、感官及使用成本等為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選適宜的蛋白酶。

(2)液料比對(duì)酶解效果的影響：分別設(shè)置液料比(V水∶m下腳料)為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1(mL/g)，在酶解時(shí)間4 h、加酶量2 000 U/g、酶解溫度50 ℃、pH 7.0 條件下進(jìn)行酶解，以氨基酸態(tài)氮含量及水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選適宜的液料比。

(3)加酶量對(duì)酶解效果的影響：分別設(shè)置加酶量為0，500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 U/g，在酶解時(shí)間4 h、液料比(V水∶m下腳料)4∶1(mL/g)、酶解溫度50 ℃、pH 7.0條件下進(jìn)行酶解。以氨基酸態(tài)氮含量及水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選適宜的酶添加量。

(4)酶解溫度對(duì)酶解效果的影響：分別設(shè)置酶解溫度為40，45，50，55，60 ℃，在加酶量2 000 U/g、液料比(V水∶m下腳料)4∶1(mL/g)、pH 7.0、酶解時(shí)間4 h條件下進(jìn)行酶解，以氨基酸態(tài)氮含量及水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選適宜的酶解溫度。

(5)酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響:分別設(shè)置酶解時(shí)間為1，2，3，4，5，6 h，在液料比(V水∶m下腳料)4∶1(mL/g)、加酶量2 000 U/g、酶解溫度50 ℃、pH 7.0條件下進(jìn)行酶解，以氨基酸態(tài)氮含量及水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選適宜的酶解時(shí)間。

(6)pH對(duì)酶解效果的影響：分別設(shè)置pH為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，在液料比(V水∶m下腳料)4∶1(mL/g)、加酶量2 000 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間4 h條件下，以氨基酸態(tài)氮含量及水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選適宜的pH。

(7)正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取影響較為顯著的液料比、酶解時(shí)間、pH和酶解溫度4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，確定最佳的酶解工藝條件。

1.5 馬鮫魚下腳料酶解液海鮮醬的制備

1.5.1 工藝流程

馬鮫魚下腳料酶解液→調(diào)味→加熱→均質(zhì)→排氣→裝罐→封口→滅菌→冷卻→成品檢驗(yàn)

1.5.2 操作要點(diǎn)

(1)原輔料的調(diào)味：利用酶解液進(jìn)一步開(kāi)發(fā)海鮮醬，經(jīng)過(guò)前期調(diào)味試驗(yàn)，確定最終配方原輔料添加量為酶解液80%～85%、鹽5%～8%、糖2%～3%、咖喱粉1%～3%、姜汁1%～2%、老抽0.5%～1.0%、花椒0.03%～0.05%、黃原膠0.5%～1.0%。

(2)加熱：將馬鮫魚下腳料酶解液倒入鍋中，依次加入鹽、咖喱粉、姜汁、花椒油、料酒、糖與黃原膠混合物，攪拌均勻，加熱至85～100 ℃，熬制5～10 min，使海鮮醬形成黏稠狀即可。

(3)均質(zhì)：均質(zhì)壓力0.25 MPa，均質(zhì)2次。

(4)裝罐、密封：將熬制好的海鮮醬趁熱灌裝，溫度控制在70 ℃以上。

(5)滅菌、冷卻：121 ℃下滅菌15 min，用自來(lái)水冷卻至室溫，常溫貯藏。

1.5.3 感官評(píng)價(jià) 選擇10名經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的人員，根據(jù)表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)海鮮醬產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)價(jià)[12]。

表1 海鮮醬的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.5.4 理化、微生物及營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)檢測(cè) 由福建中紡檢測(cè)有限公司檢測(cè)。各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行雙平行試驗(yàn)，使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行正交統(tǒng)計(jì)分析、使用LSD(最小顯著法)進(jìn)行顯著性差異分析；利用Excel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鮫魚下腳料主要營(yíng)養(yǎng)成分

馬鮫魚下腳料中粗脂肪[(8.26±0.46)%]、蛋白質(zhì)[(14.46±0.87)%]、氨基酸態(tài)氮[(0.515±0.048)%]質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(65.90±0.44)%，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可作為海鮮醬的原料進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。

2.2 馬鮫魚下腳料酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 蛋白酶種類對(duì)酶解效果的影響 由表2可知，幾種蛋白酶對(duì)馬鮫魚下腳料進(jìn)行酶解，氨基酸態(tài)氮含量從高到低依次為：風(fēng)味蛋白酶>中性蛋白酶>復(fù)合蛋白酶>堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶。感官方面，中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解液的腥味較弱，復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的異味較重。成本方面，中性蛋白酶的最低，而酶解效果較好的風(fēng)味蛋白酶使用成本是中性蛋白酶的1.82倍。中性蛋白酶屬于內(nèi)切酶，可水解Tyr、Phe等疏水性氨基酸殘基的羧基端肽鍵，有利于其他蛋白酶發(fā)揮外切作用，改善產(chǎn)物的口感[13]，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物蛋白的水解，生產(chǎn)高級(jí)調(diào)味品和食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑等。風(fēng)味蛋白酶具有內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性，并能將多肽鏈的末端和內(nèi)部的肽鍵水解，但易受鉛、銅、汞、砷等重金屬離子和氧化劑的抑制及破壞[14]。海魚下腳料中常帶有一定鉛、汞、砷等重金屬，抑制了風(fēng)味蛋白酶的活性[15]。而堿性蛋白酶屬于一種絲氨酸胞外高堿性蛋白酶，具有較強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)的能力[16]，在一些水產(chǎn)資源上明顯具有優(yōu)越性。但從酶活力角度而言，中性蛋白酶和堿性蛋白酶要遠(yuǎn)勝于其他幾種酶。綜合評(píng)價(jià)氨基酸態(tài)氮含量、感官評(píng)價(jià)、酶活力以及使用成本等指標(biāo)，最終選用中性蛋白酶用于后期酶解試驗(yàn)。

表2 不同蛋白酶的酶解效果

2.2.2 液料比對(duì)酶解效果的影響 如圖1所示，隨著液料比的不斷增加，馬鮫魚下腳料酶解液中的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度呈下降趨勢(shì)，且差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。但水解度卻呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)液料比(V水∶m下腳料)為3∶1(mL/g)時(shí)，酶解液的水解度達(dá)到最大值(30.43±1.56)%，此時(shí)酶與底物反應(yīng)最為充分。擬選擇液料比(V水∶m下腳料)3∶1(mL/g)進(jìn)行后期酶解試驗(yàn)。

同指標(biāo)字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.3 加酶量對(duì)酶解效果的影響 如圖2所示，隨著加酶量的不斷增加，馬鮫魚下腳料酶解液中的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度及水解度均呈上升趨勢(shì)，但添加500～3 000 U/g中性蛋白酶的酶解效果差異不顯著(P>0.05)。這可能是因?yàn)轳R鮫魚下腳料自身存在一定的內(nèi)源酶，且底物量固定，添加過(guò)多的外源酶并不能明顯改善其酶解效果?？紤]酶解效果及使用成本，擬選擇加酶量500 U/g進(jìn)行后期酶解試驗(yàn)。

同指標(biāo)字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.4 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響 如圖3所示，隨著酶解溫度升高，馬鮫魚下腳料酶解液中的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度及水解度均呈先上升后下降的趨勢(shì)，差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。中性蛋白酶是一種內(nèi)切酶，最適溫度范圍在45～60 ℃，最適溫度或因作用底物的不同略有差異。當(dāng)酶解溫度為55 ℃時(shí)，中性蛋白酶作用于馬鮫魚下腳料分解產(chǎn)生的氨基酸態(tài)氮量及水解度最高。姜淼等[17]也研究發(fā)現(xiàn)57 ℃更有利于中性蛋白酶應(yīng)用于海參調(diào)味料的脫腥。因此，擬選擇酶解溫度55 ℃進(jìn)行后期酶解試驗(yàn)。

同指標(biāo)字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響 如圖4所示，隨著酶解時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，馬鮫魚下腳料酶解液中的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度及水解度也不斷增加。當(dāng)酶解4 h時(shí)氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度、水解度分別達(dá)到(0.294±0.002)g/100 mL，(33.99±0.29)%之后趨于平穩(wěn)，與酶解5～6 h差異不顯著(P<0.05)。這是由于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶與底物充分反應(yīng)，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度及水解度增加。但反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，底物濃度降低，酶活力下降，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度及水解度趨于穩(wěn)定狀態(tài)。因此，擬選擇酶解時(shí)間4 h進(jìn)行后期酶解試驗(yàn)。

同指標(biāo)字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.6 pH對(duì)酶解效果的影響 如圖5所示，隨pH升高，馬鮫魚下腳料酶解液中的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度及水解度呈先上升后下降趨勢(shì)，差異達(dá)到極顯著性(P<0.01)。pH為7.0時(shí)氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度及水解度達(dá)到最高值。由于采用的是中性蛋白酶，其最佳pH在6.0～7.5。因此，選擇pH 7.0進(jìn)行后期酶解試驗(yàn)。

同指標(biāo)字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.2.7 正交試驗(yàn) 利用中性蛋白酶，在加酶量500 U/g的條件下，選取影響顯著的酶解溫度、酶解pH、液料比和酶解時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3～表5。

表3 正交試驗(yàn)因素和水平

由表4可知，酶解的最優(yōu)組合為A2B3C1D3，即酶解溫度55 ℃，pH 7.5，液料比(V水∶m下腳料)3∶1(mL/g)，酶解時(shí)間5 h。通過(guò)方差分析(表5)可知，馬鮫魚下腳料酶解效果影響因素依次為：液料比>酶解溫度>pH>酶解時(shí)間，4個(gè)因素對(duì)氨基酸態(tài)氮含量差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。通過(guò)對(duì)A2B3C1D3的最優(yōu)組合進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，酶解馬鮫魚下腳料的氨基酸態(tài)氮平均質(zhì)量濃度高達(dá)(0.325±0.004)g/100 mL，高于表4中的任一組合，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

表4 酶解工藝條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及極差分析結(jié)果

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表

2.3 馬鮫魚下腳料酶解液海鮮醬品質(zhì)分析

2.3.1 感官品質(zhì) 由10名品評(píng)人員對(duì)市售海鮮醬(對(duì)照組)與馬鮫魚下腳料酶解液制備的海鮮醬進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。對(duì)兩款產(chǎn)品打亂順序進(jìn)行盲評(píng)，由品評(píng)人員對(duì)其進(jìn)行打分。由表6可知，馬鮫魚下腳料酶解液制備的海鮮醬無(wú)論從色澤、風(fēng)味、形態(tài)、質(zhì)地均優(yōu)于市售海鮮醬，綜合感官評(píng)分也高于市售海鮮醬，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。由此可見(jiàn)，自制海鮮醬制品已達(dá)到甚至超過(guò)市售海鮮醬的口感，符合消費(fèi)者口味需求。

表6 海鮮醬的感官評(píng)價(jià)?

2.3.2 理化、微生物及營(yíng)養(yǎng)指標(biāo) 將馬鮫魚下腳料酶解液制備的海鮮醬送第三方機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7～表9。由表7～表9可知，自制海鮮醬所檢測(cè)理化及微生物指標(biāo)均符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[18]要求。

表7 海鮮醬主要理化指標(biāo)

表8 海鮮醬微生物指標(biāo)

表9 海鮮醬營(yíng)養(yǎng)成分表

3 結(jié)論

為充分利用馬鮫魚下腳料，減少資源浪費(fèi)及降低環(huán)境污染，利用馬鮫魚下腳料制備海鮮醬。馬鮫魚下腳料的最佳酶解工藝條件為：采用中性蛋白酶，加酶量500 U/g，液料比(V水∶m下腳料)3∶1(mL/g)，酶解溫度55 ℃，pH值7.5，酶解時(shí)間5 h。該條件下，酶解液的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度高達(dá)(0.325±0.004)g/100 mL。以其制備的海鮮醬與市售海鮮醬的感官品質(zhì)相當(dāng)。為更加安全有效的利用馬鮫魚下腳料，后續(xù)將重點(diǎn)研究下腳料有害物質(zhì)的檢測(cè)與去除方法，為馬鮫魚下腳料加工再利用提供安全技術(shù)保障。