蔣鵬飛 歐晨 彭俊 姚震 田野 楊毅敬 宋厚盼 徐劍 彭清華

〔摘要〕 目的 觀察枸杞子-丹參對rd10小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2表達(dá)的影響。方法 將40只rd10小鼠隨機(jī)分為5組，空白組灌胃生理鹽水;對照組灌胃維生素A溶劑;枸杞組灌胃枸杞子中藥超微配方顆粒溶液;丹參組灌胃丹參中藥超微配方顆粒溶液;枸杞加丹參組（杞參組）灌胃枸杞子加丹參中藥超微配方顆粒溶液;8只C57小鼠為野生組，灌胃生理鹽水。給藥28 d后，RT-qPCR檢測小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2 mRNA表達(dá)情況，免疫組化、免疫熒光法檢測小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 RT-qPCR檢測顯示：除杞參組外，各組小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2 mRNA相對表達(dá)量高于野生組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;杞參組小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2 mRNA相對表達(dá)量低于空白組、對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化檢測顯示：各組小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2平均光密度高于野生組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;杞參組Caspase-12前體、Caspase-2蛋白平均光密度低于空白組、對照組、枸杞組、丹參組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。免疫熒光檢測顯示：各組小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2蛋白平均熒光強(qiáng)度高于野生組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;杞參組Caspase-12前體、Caspase-2蛋白平均熒光強(qiáng)度低于空白組、對照組、枸杞組、丹參組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 枸杞子-丹參可以抑制rd10小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，從而抑制感光細(xì)胞的凋亡，維持視網(wǎng)膜正常功能結(jié)構(gòu)，保護(hù)視功能。

〔關(guān)鍵詞〕 視網(wǎng)膜色素變性;細(xì)胞凋亡;枸杞子;丹參Caspase-2;Caspase-12前體

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.003

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Gouqizi （Lycii Fructus） and Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） on the expression of Caspase-12 precursor and Caspase-2 in rd10 mice. Methods 40 rd10 mice were randomly divided into 5 groups. The blank group was given distilled water; the control group was given intragastric vitamin A solvent; the Gouqizi （Lycii Fructus） group was given intragastric Gouqizi （Lycii Fructus） Chinese medicine ultrafine granular solution; the Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） group was given intragastric Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） Chinese medicine ultrafine formula granule solution; Gouqizi （Lycii Fructus） plus Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） group （QiShen group） was given intragastric Gouqizi （Lycii Fructus） plus Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） Chinese medicine superfine granule solution; 8 C57 mice as the wild group， was given intragastric distilled water. 28 days after the administration， RT-qPCR was used to detect the expression of Caspase-12 precursor and Caspase-2 mRNA in the retina of rd10 mice， and the expression of Caspase-12 precursor and Caspase-2 proteins in the retina was detected by immunohistochemistry and immunofluor？鄄escence. Results The RT-qPCR test showed that except for the QiShen group， the relative expression levels of Caspase-12 precursor and Caspase-2 mRNA in the retina of each group were higher than that of the wild group， and the differences were statistically significant （P<0.05）; the relative expression levels of Caspase-12 precursor and Caspase-2 mRNA in the retina of the QiShen group were lower than that of the blank group and the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Immunohistochemical detection showed that the average optical density of Caspase-12 precursor and Caspase-2 in the retina of mice in each group was higher than that of the wild group， and the differences were statistically significant （P<0.05）; the average optical density of Caspase-12 precursor and Caspase-2 of the QiShen group was lower than that of the blank group， control group， Gouqizi （Lycii Fructus） group， and Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Immunofluorescence detection showed that the average fluorescence intensity of Caspase-12 precursor and Caspase-2 in the retina of mice in each group was higher than that in the wild group， and the differences were statistically significant （P<0.05）; Caspase-12 precursor and Caspase-2 average fluorescence intensity of QiShen group was lower than that of the blank group， control group， Gouqizi （Lycii Fructus） group and Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Gouqizi （Lycii Fructus） and Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma） can inhibit the expression of rd10 mice Caspase-12 precursors， Caspase-2， thereby inhibiting the apoptosis of photoreceptor cells， maintaining normal functional structure of retina， protecting view function.

〔Keywords〕 retinitis pigmentosa; apoptosis; Gouqizi （Lycii Fructus）; Danshen （Salviae Miltiorrhizae Radix Et Rhizoma）; Caspase-2; Caspase-12 precursor

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa， RP）是臨床常見的視網(wǎng)膜疾病，以視網(wǎng)膜色素變化為特征，病至后期，可對視力、視野造成嚴(yán)重影響[1]。我國人群發(fā)病率約為1/4 000，男女比例約3∶2[2]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為RP視力損失的主要原因是視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡[3-5]，凋亡是細(xì)胞程序化死亡方式的一種，本研究以視網(wǎng)膜色素變性小鼠rd10小鼠為研究對象，通過觀察枸杞子-丹參對rd10小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Caspase-12前體和Caspase-2的影響，探討枸杞子丹參治療RP的機(jī)制。

1 材料

1.1? 實驗動物

40只4周齡SPF級rd10小鼠，雌雄各半，質(zhì)量18～20 g，購自美國Jackson（JAX）實驗室，證書編號：191A11353;8只4周齡SPF級C57小鼠，雌雄各半，質(zhì)量18～20 g，由湖南斯萊克景達(dá)公司提供，證書編號：43004700062254。實驗動物均飼養(yǎng)于湖南斯萊克景達(dá)公司動物實驗中心SPF房，室溫（22±2） ℃，濕度50%～55%，定期更換墊料，自由飲食。rd10小鼠出生時攜帶PED6基因，在出生8周時大部分感光細(xì)胞完全喪失，是典型的RP動物模型。

1.2? 實驗藥物與試劑

灌胃中藥：枸杞子中藥配方顆粒，每袋裝3.0 g（相當(dāng)于臨床使用量飲片10 g），丹參中藥配方顆粒，每袋裝1.8 g（相當(dāng)于臨床使用量飲片10 g）。Caspase-2（美國PROTEINTECH公司，貨號：24777-1-AP，稀釋比例1∶50）;Caspase-12前體（英國abcam公司，貨號：ab8117，稀釋比例1∶100）;CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L） （SA000013-1）、CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L） （SA000013-2）均由Proteintech中國公司提供;mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：CW2569）、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：CW2141）、UltraSYBR Mixture（批號：CW2601）均由中國北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供;EDTA（中國大連美倫生物技術(shù)有限公司，批號：MB2514）;Tris（美國Sigma-Aldrich公司，批號：V900483）;Trizol（美國Thermo公司，批號：15596026）;核酸染料（中國北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：PB11141）。

1.3? 實驗儀器

臺式冷凍離心機(jī)（中國湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號：H1650R）;熒光定量RCP儀（型號：PIKOREAL96）、熒光PCR板（型號：SPL0960）均購自美國Thermo公司;電泳儀（型號：DYY-2C）、水平瓊脂糖電泳槽（型號：DYCP-31DN）均購自中國北京六一生物科技有限公司;旋渦混合器（中國江蘇其林貝爾儀器制造有限公司，型號：GL-88B）;磁力攪拌器（中國上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，型號：JB-13）;-80 ℃冰箱（中國長虹美菱股份有限公司，型號：DW-HW438）;電磁爐（荷蘭Philips公司，型號：HD4925）;生物樣品均質(zhì)儀（中國杭州奧盛儀器有限公司，型號：BioPrep-24）。

2 方法

2.1? 動物分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只SPF級rd10小鼠隨機(jī)平均分為5組，分別為：空白組、對照組、枸杞組、丹參組、杞參組，每組8只;8只SPF級C57小鼠為野生組;每組雌雄分開飼養(yǎng)。

2.2? 給藥方法

所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后給予灌胃，野生組與空白組：灌胃生理鹽水;對照組：灌胃維生素A溶劑（15粒維生素A溶于40 mL 10% DMSO溶劑）;枸杞組：灌胃枸杞子中藥配方顆粒溶液（3 g枸杞子顆粒溶于40 mL滅菌蒸餾水中）;丹參組：灌胃丹參中藥配方顆粒溶液（1.8 g丹參顆粒溶于40 mL滅菌蒸餾水中）;杞參組：灌胃枸杞子加丹參中藥配方顆粒溶液（3 g枸杞子顆粒+1.8 g丹參顆粒溶于40 mL滅菌蒸餾水中）。每組小鼠給藥劑量按“人-動物體表面積等效劑量比值表”折算，折算系數(shù)W=0.002 5。每組灌胃相應(yīng)藥物劑量為20 mL/（kg·d），每天1次，連續(xù)28 d。

2.3? 取材方法

取材時相為灌胃第28天結(jié)束后1 d。1%苯巴比妥鈉3.0 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，75%酒精消毒小鼠雙眼眼瞼周圍，眼科彎組織剪直接分離球周組織，剪斷視神經(jīng)后摘除眼球，每只小鼠選取1只眼球，立即放入4%多聚甲醛中固定，石臘包埋、切片，備行免疫組化、免疫熒光檢測Caspase-12前體、Caspase-2蛋白表達(dá)。另外1只眼球保存于-80 ℃冰箱中，備行RT-qPCR檢測Caspase-12前體、Caspase-2 mRNA表達(dá)。

2.4? 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1? RT-qPCR檢測小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2 mRNA表達(dá)? 視網(wǎng)膜組織充分研磨勻漿，在室溫下裂解5 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，然后測定RNA濃度與純度。140 V恒壓進(jìn)行RNA的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。以總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA（反應(yīng)體系見表1）。在NCBI上搜索目的基因的序列，運(yùn)用primer5軟件設(shè)計引物，由上海生工合成引物，見表2。實時定量PCR：每個樣本每個指標(biāo)3個孔，共30 μL體系，每孔9 μL，反應(yīng)條件為：在95 ℃中10 min，在95 ℃（15 s）和60 ℃（30 s）中40進(jìn)行個PCR循環(huán)。

2.4.2? 免疫組化檢測小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2蛋白表達(dá)? 將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中，連續(xù)煮24 min，切片冷卻后PBS沖洗3 min×3次，滴加稀釋的一抗，PBS沖洗5 min×3次，滴加50～100 μL抗-小鼠IgG抗體37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，蘇木素復(fù)染10 min，蒸餾水沖洗，酒精逐級脫水，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

2.4.3? 免疫熒光檢測小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2蛋白表達(dá)? 將切片置于硼氫化鈉溶液中30 min，漂洗后置于蘇丹黑染液中5 min，滴加適當(dāng)稀釋的一抗，滴加100 μL抗-兔-IgG標(biāo)記熒光抗體，緩沖甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。

2.5? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 23.0分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以“x±s”表示，多組比較采用ANOVA（LDS）分析（滿足正態(tài)分布及方差齊性）或秩和檢驗（不滿足正態(tài)分布及方差齊性）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 枸杞子-丹參對各組小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2 mRNA表達(dá)的影響

3.1.1? 各組小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2

mRNA熔解曲線? 通過逐漸增加溫度，熒光信號可產(chǎn)生熔解曲線，熔解曲線顯示單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好。見圖1-2。

3.1.2? 各組小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2

mRNA擴(kuò)增曲線? 在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系。見圖3-4。

3.1.3? 各組小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2

mRNA相對表達(dá)量? 各組rd10小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-2 mRNA相對表達(dá)量高于野生組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;除杞參組外，各組rd10小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-12前體mRNA相對表達(dá)量高于野生組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;各藥物干預(yù)組小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-12前體、Caspase-2 mRNA相對表達(dá)量低于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;杞參組小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-2 mRNA相對表達(dá)量低于對照組、枸杞組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;杞參組小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-12前體mRNA相對表達(dá)量低于對照組、枸杞組、丹參組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3.2? 枸杞子-丹參對各組小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2蛋白表達(dá)的影響

3.2.1? 各組小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2蛋白免疫組化檢測結(jié)果? 各組rd10小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-12前體、Caspase-2蛋白平均光密度高于野生組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;枸杞組、丹參組、杞參組小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-12前體、Caspase-2蛋白平均光密度低于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;杞參組小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-12前體、Caspase-2蛋白平均光密度低于對照組、枸杞組、丹參組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4、圖5-6。

3.2.2? 各組小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2蛋白免疫熒光檢測結(jié)果? 各組小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-12前體、Caspase-2蛋白平均熒光強(qiáng)度高于野生組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;各藥物干預(yù)組小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-12前體、Caspase-2蛋白平均熒光強(qiáng)度低于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;杞參組小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-12前體、Caspase-2蛋白平均熒光強(qiáng)度低于對照組、枸杞組、丹參組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表5、圖7-8。

4 討論

中醫(yī)學(xué)將RP歸為“高風(fēng)內(nèi)障”范疇，古代醫(yī)家多認(rèn)為RP病機(jī)為虛，如《原機(jī)啟微》中認(rèn)為本病乃陽衰不能抗陰所致，《目精大成·陰風(fēng)障》中記載本病“至晚不見，曉則復(fù)明，蓋元陽不足之病?！薄峨s病源流犀燭·目病源流》曰：“亦有生成如此，并由父母遺體?！泵鞔_指出本病乃遺傳性疾病，并且在治療中提及“不必治，治亦無效”，認(rèn)為本病難以治愈[6-7]。目前對RP的認(rèn)識大多承襲古代醫(yī)家的論述，認(rèn)為RP以虛為主，或陰虛，或陽虛[8-9]。彭清華教授經(jīng)大量的臨床研究證實RP患者多為虛中夾瘀之證，提出補(bǔ)虛活血法治療RP，實驗研究[7]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)虛活血中藥枸杞子-丹參對虛中夾瘀證RP模型大鼠有較好的治療作用，可明顯抑制RP模型大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡，但其具體作用途徑仍不清楚。

枸杞子味甘，性平，歸入肝經(jīng)與腎經(jīng)，有補(bǔ)益肝腎的功效，丹參味苦，性微寒，歸入心、肝經(jīng)，有活血化瘀的功效。本研究選擇了補(bǔ)虛活血法的代表性藥物枸杞子和丹參作為干預(yù)藥物，經(jīng)28 d灌胃后，發(fā)現(xiàn)枸杞子丹參能降低視網(wǎng)膜中Caspase-12前體、Caspase-2蛋白及mRNA的表達(dá)，而Caspase-12前體與Caspase-2是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞凋亡途徑的關(guān)鍵靶點。

凋亡酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的激活是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵途徑。在RP病變中，研究報道[10]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress， ERS）誘導(dǎo)的凋亡與RP疾病進(jìn)展有關(guān)。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑激活Caspase-12前體，而后激活Caspase-12成熟體，最終激活下游一系列凋亡信號，促使細(xì)胞凋亡的進(jìn)程[11]。Caspase-12是ERS誘導(dǎo)凋亡中的關(guān)鍵分子[12]，大量報道[13-14]顯示Caspase-12是組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，Caspase-12參與了ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。研究[16]表明在視網(wǎng)膜使用KUS121，可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，從而很明顯抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)光感受器細(xì)胞，尤其視錐細(xì)胞，這對維持晚期RP患者的中心視力有非常積極重要作用。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑中，Caspase-2既是啟動酶也是效應(yīng)酶，Caspase-2抑制劑可有效抑制細(xì)胞凋亡[17-18]。

本研究檢測了rd10小鼠視網(wǎng)膜中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡相關(guān)因子Caspase-12前體、Caspase-2蛋白及mRNA的表達(dá)，PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)rd10小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-12前體、Caspase-2 mRNA表達(dá)量明顯高于正常小鼠，經(jīng)過枸杞子丹參灌胃28 d后，杞參組小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-12前體mRNA表達(dá)量與正常小鼠相比，差異無統(tǒng)計學(xué)差異;與枸杞組、丹參組相比，枸杞子-丹參聯(lián)合使用可更好地降低Caspase-12前體mRNA表達(dá)的作用。免疫組化與免疫熒光結(jié)果表明，枸杞子-丹參能降低視網(wǎng)膜中Caspase-12前體、Caspase-2蛋白的表達(dá)，枸杞子-丹參藥物聯(lián)用優(yōu)于單用丹參或單用枸杞子，從動物實驗角度論證了補(bǔ)虛活血法治療RP的有效性。本研究通過對視網(wǎng)膜進(jìn)行免疫組化染色、免疫熒光染色及RT-qPCR法檢測視網(wǎng)膜組織中凋亡相關(guān)因子Caspase-12前體、Caspase-2蛋白及mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)枸杞子-丹參對rd10小鼠視網(wǎng)膜Caspase-12前體、Caspase-2蛋白及mRNA的表達(dá)有抑制作用，從而抑制感光細(xì)胞的凋亡，具有較為廣闊的應(yīng)用前景。

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