連娟 劉佳賢 暴雪麗 段小華 劉羽桐 呂博含 安甜 姜廣建

〔摘要〕 目的 研究黃瓜籽復(fù)合物對骨質(zhì)疏松癥大鼠的防治作用。方法 將24只雌性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（OVX組）、雌二醇（E2）組（EV組）、黃瓜籽復(fù)合物組（QCL組）。雙側(cè)卵巢切除術(shù)建立骨質(zhì)疏松癥模型。術(shù)后灌胃給藥12周后，用全自動生化儀測血清鈣（S-Ca）、血清磷（S-P）水平;ELISA法檢測E2、堿性磷酸酶（ALP）、I型膠原氨基端前肽（PINP）、I型膠原羧基端肽（CTX-I）、尿脫氧吡啶啉（DPD）水平;Micro-CT分析骨密度;HE染色觀察股骨組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果 與Sham組相比，OVX組S-Ca、S-P、E2、PINP及骨密度水平降低（P<0.01），ALP、CTX-I、DPD水平升高（P<0.01）;與OVX組相比，QCL組、EV組S-Ca、S-P、E2、PINP及骨密度水平升高（P<0.01），ALP、CTX-I、DPD水平降低（P<0.01，P<0.05）;與EV組相比，QCL組S-Ca水平升高，PINP水平降低，DPD水平升高（P<0.01）。與Sham組相比，OVX組骨小梁結(jié)構(gòu)松散不規(guī)則，骨髓腔變大;與OVX組相比，EV組和QCL組骨組織形態(tài)得到改善。結(jié)論 黃瓜籽復(fù)合物能有效預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，可能與提高E2、S-Ca、S-P水平，降低骨轉(zhuǎn)換有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 黃瓜籽復(fù)合物;骨質(zhì)疏松癥;骨代謝;骨密度

〔中圖分類號〕R274? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.006

〔Abstract〕 Objective To study the effect of cucumber seed compound on the prevention and treatment of osteoporosis in rats. Methods 24 female rats were randomly divided into sham operation group （Sham group）， model group （OVX group）， estradiol （E2） group （EV group） and cucumber seed compound group （QCL group）. Bilateral oophorectomy was performed to establish the osteoporosis model. After 12 weeks of intervention by intragastric administration， serum calcium （S-Ca） and serum phosphorus （S-P） levels were detected by automatic biochemical analyzer; E2， alkaline phosphatase （ALP）， collagen I amino terminal peptide （PINP）， collagen I carboxyl terminal peptide （CTX-I） and deoxypyridinoline （DPD） levels were detected by ELISA; bone mineral density was analyzed with Micro-CT; the morphology of femur was observed by HE staining. Results Compared with the Sham group， the levels of S-Ca， S-P， E2， PINP and bone mineral density in the OVX group decreased （P<0.01）， the levels of ALP， CTX-I and DPD increased （P<0.01）. Compared with the OVX group， the levels of S-Ca， S-P， E2， PINP and bone mineral density in the QCL group and EV group increased （P<0.01）， the levels of ALP， CTX-I and DPD decreased （P<0.01， P<0.05）. Compared with the EV group， the S-Ca level increased， the PINP level decreased and the DPD level increased in the QCL group （P<0.01）. Compared with the Sham group， the trabecular bone structure of the OVX group was loose and irregular， the bone marrow cavity became larger. Compared with the OVX group， the morphology of the EV group and the QCL group have been significantly improved. Conclusion Cucumber seed compound can effectively prevent osteoporosis， which may be related to up-regulate E2， S-Ca， S-P levels and down-regulate bone turnover.

〔Keywords〕 cucumber seed compound; osteoporosis; bone metabolism; bone density

骨質(zhì)疏松癥是一種非代謝性骨病，其特點(diǎn)是由于骨蛋白和礦物質(zhì)含量的過度流失而導(dǎo)致骨密度和強(qiáng)度下降[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis， PMOP）是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中最常見的，而且PMOP的發(fā)病率正在迅速增加[2]。隨著中醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中藥和天然植物活性成分對實(shí)驗(yàn)性PMOP顯示良好的藥效作用[3]，因此，尋找一種天然的安全有效的治療PMOP的手段具有重要意義。

黃瓜籽為葫蘆科植物黃瓜的干燥成熟種子。黃瓜籽富含脂肪酸、糖類、苷類、植物甾醇、礦物質(zhì)元素等豐富的化學(xué)成分[4]?！吨腥A本草》中記載其具有續(xù)筋接骨、祛風(fēng)、消痰的功效，主治骨折筋傷、風(fēng)濕痹痛[5]。生菜是一種綠色多葉蔬菜，含有豐富的鉀、鈉、鈣、鎂等微量元素和其他植物化學(xué)物質(zhì)[6]。據(jù)《中華本草》中介紹，生菜籽具有通乳汁、利小便、活血行瘀等功效，主治乳汁不通、小便不利、跌打損傷、瘀腫疼痛等[5]。藜麥具有“超級谷物”之美稱，含有人體所需全部必需氨基酸、膳食纖維、礦物質(zhì)和維生素，而且具有豐富的酚類、皂苷、三萜、甾醇、甜菜堿、蛻皮激素等次生代謝物質(zhì)，是一種高蛋白、低熱量、活性物質(zhì)豐富的堿性食物資源[7-8]。研究[9-10]表明藜麥在哺乳動物中表現(xiàn)出廣泛的治療作用，包括抗PMOP。因此，本研究以去卵巢大鼠為研究對象，探討黃瓜籽復(fù)合物（以下簡稱QCL）對去卵巢大鼠骨量和骨代謝的影響。

1 材料與方法

1.1? 動物

健康雌性大鼠6～8周齡，體質(zhì)量（230±10） g，購自北京維通利華動物科技有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0011。動物飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學(xué)的SPF級動物房。該環(huán)境有舒適的溫度（22±1） ℃、合適的濕度55%±5%和12 h∶12 h的光/暗循環(huán)。在無病原體條件下，給所有大鼠提供標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動物飼料和飲水。所有的動物實(shí)驗(yàn)和護(hù)理均獲得了北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2? 試劑及儀器

雌二醇（estradiol， E2）ELISA試劑盒（批號：20190417，天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司）;堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）ELISA試劑盒（批號：I11038421）、I型膠原氨基端前肽（N-terminal propeptide of type I collagen， PINP）ELISA 試劑盒（批號：F09032025）均購自武漢華美生物科技有限公司;I型膠原羧基端肽（C-terminal propeptide of type I collagen， CTX-I）ELISA試劑盒（批號：20190423）、尿脫氧吡啶啉（urinary deoxypyridinoline， DPD）ELISA試劑盒（批號：20190510） 均購自北京康佳宏原生物科技有限公司;EDTA脫鈣液（批號：2019072601）、蘇木素染色液（批號：20190909）、伊紅染色液（批號：20190318）均購自北京索萊寶生物科技有限公司;日立7600全自動生化儀（日本Hitachi公司）;EG 1150H包埋機(jī)、EG 1150 C冰凍機(jī)、RM 2255輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（Leica Biosystems有限公司）;Olympus BX53倒置熒光顯微鏡（Olympus有限公司）;Perkin Elmer Quantum GX-micro-CT小動物活體斷層掃描儀（美國Perkin Elmer公司）。

1.3? 主要藥物

黃瓜籽（批號：SC11622052330005）、生菜籽（批號：SC11622052330005）購自吉林省金谷生態(tài)食品有限公司;藜麥（批號：SC10162062300206）購自甘肅純潔高原農(nóng)業(yè)有限公司。QCL的制備在北京中醫(yī)藥大學(xué)糖尿病研究中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。根據(jù)黃瓜籽、生菜籽人（70 kg）日用量各20 g來設(shè)置本實(shí)驗(yàn)用量各4.2 g/kg，根據(jù)10 h進(jìn)食量實(shí)驗(yàn)測得，體質(zhì)量300 g大鼠進(jìn)食量為12 g，計(jì)算總進(jìn)食量為40 g/kg，并得出藜麥用量為31.6 g/kg，最終三者混合物的比例為1∶1∶7.5。用電動攪拌機(jī)將黃瓜籽、生菜籽、藜麥打成粉末混合，制作成標(biāo)準(zhǔn)鼠糧大小的食物，4 ℃儲存。

1.4? OVX大鼠模型制備、分組及給藥

在卵巢切除術(shù)中，用1%戊巴比妥鈉（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉動物，切除雙側(cè)卵巢，建立骨質(zhì)疏松癥模型。同時，假手術(shù)組只切除卵巢周圍同樣大小的白色脂肪組織。手術(shù)成功的動物隨機(jī)分為4組，每組6只。（1）假手術(shù)組（Sham組）：生理鹽水灌胃[0.1 mg/（kg·d）];（2）模型組（OVX組）：生理鹽水灌胃[0.1 mg/（kg·d）];（3）雌二醇組（EV組）：戊酸雌二醇灌胃[0.1 mg/（kg·d）];（4）QCL組：黃瓜籽、生菜籽、藜麥混合物喂食[40 g/（kg·d）]。連續(xù)治療12周，在處死的前一天，用無菌容器采集尿液、糞便樣本，立即在-80 ℃低溫冷凍。腹腔注射1%戊巴比妥鈉 （0.4 mL/100 g），對所有動物實(shí)施安樂死。從腹主動脈血中收集血清，離心20 min（3 000 r/min，離心半徑8 cm），收集雙側(cè)股骨，固定于4%多聚甲醛中待檢測。

1.5? 生化檢測

取血液和尿液樣本，用全自動生化分析儀檢測血清鈣（serum calcium， S-Ca）、血清磷（serum phosphorus， S-P）含量，按照ELISA試劑盒說明書測定E2、ALP、PINP、CTX-I、DPD的含量。

1.6? 骨密度分析

用PerkinElmer Quantum GX-micro-CT對右股骨進(jìn)行分析。使用軟件PerkinElmer Quantum self-software重建數(shù)據(jù)集，用evaluate analysis 12.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.7? 股骨HE染色

用10% EDTA（pH 7.0）進(jìn)行脫鈣，每兩周更換一次，重復(fù)12周。用50%～100%的分級乙醇對脫鈣股骨進(jìn)行脫水，然后石蠟包埋。連續(xù)5 μm厚度切片，并進(jìn)行HE染色，用光鏡觀察結(jié)果。

1.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“x±s”表示，GraphPad Prism 6軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，滿足正態(tài)分布，當(dāng)方差齊時，采用單因素方差分析（ANNOVA）;當(dāng)方差不齊時，使用Dunnetts T3檢驗(yàn);不滿足正態(tài)分布時，使用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠E2水平比較

與Sham組相比，OVX組E2水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與OVX組相比，EV組及QCL組E2水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與EV組相比，QCL組E2水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

2.2? 各組大鼠鈣磷水平比較

與Sham組相比，OVX組血清中S-Ca和S-P水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與OVX組相比，EV組及QCL組S-Ca和S-P水平均有不同程度的升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與EV組相比，QCL組中S-Ca水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而S-P水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

2.3? 各組大鼠骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物水平比較

與Sham組相比，OVX組ALP、CTX-1、DPD含量明顯升高，PINP含量明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與OVX組相比，EV組ALP、CTX-1、DPD含量降低，PINP含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與OVX組相比，QCL組ALP、DPD降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），但CTX-1和PINP含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與EV組相比，QCL組PINP水平降低，DPD水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖3。

2.4? 各組大鼠骨密度水平比較

與Sham組相比，OVX組骨密度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與OVX組相比，EV組及QCL組骨密度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與EV組相比，QCL組骨密度水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖4。

2.5? 大鼠股骨HE染色結(jié)果

Sham組股骨骨小梁排列緊密，結(jié)構(gòu)完整，骨髓腔飽滿，大小均一;OVX組股骨骨小梁結(jié)構(gòu)松散不規(guī)則，細(xì)長疏稀，出現(xiàn)斷裂，骨髓腔變大且形狀大小不均勻;EV組及QCL組股骨骨小梁增多，排列緊密，骨髓腔較飽滿，骨微結(jié)構(gòu)形態(tài)得到改善。見圖5。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”的范疇。本病的發(fā)生發(fā)展與“腎氣”緊密相關(guān)。氣血津液乃營養(yǎng)皮肉筋骨的物質(zhì)基礎(chǔ)，“經(jīng)脈者，所以行氣血而營陰陽，濡筋骨，利關(guān)節(jié)者也”。骨痿時，腎虛元?dú)獠蛔悖霸獨(dú)饧忍?，必不能布于血管，血管無氣，必停留而瘀”[11]。因此，補(bǔ)腎氣、活血化瘀是防治骨痿重要的治療法則。研究[12]表明黃瓜籽和生菜籽具有續(xù)筋接骨，活血化瘀的作用。古代有“一谷補(bǔ)一臟”的說法，現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)認(rèn)為藜麥中微量元素、酚類物質(zhì)、皂苷能夠保護(hù)骨骼[13]?；诖耍x擇以復(fù)合物的形式進(jìn)行干預(yù)，起到協(xié)同增效的作用。

去卵巢大鼠模型廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥研究，可與絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)丟失相媲美[14]。骨質(zhì)疏松癥藥物研究指南規(guī)定，預(yù)防性用藥應(yīng)觀察2～3月，治療性用藥應(yīng)觀察需超過1個骨重建周期[15]，大約45 d為1個骨重建周期，因此，本實(shí)驗(yàn)研究選取2個骨重建周期（12周）。骨密度能夠判斷骨量的情況，是臨床中用于診斷骨質(zhì)疏松癥的金標(biāo)準(zhǔn)[16]。骨的病理組織形態(tài)學(xué)可以直觀觀察骨組織并客觀反應(yīng)骨質(zhì)疏松癥的病理變化。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明OVX組大鼠骨密度較Sham組降低，大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)松散不規(guī)則，細(xì)長疏稀，出現(xiàn)斷裂，骨髓腔變大且形狀大小不均勻，說明骨質(zhì)疏松癥模型建立成功。研究結(jié)果顯示，給與QCL 12周后，大鼠骨密度提高，骨量有所改善，組織形態(tài)得到改善。

破骨細(xì)胞是雌激素直接的作用靶點(diǎn)，雌激素可分泌誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡及抑制破骨細(xì)胞的分化增殖[17]，本實(shí)驗(yàn)中，QCL逆轉(zhuǎn)了去卵巢大鼠E2的下降趨勢，說明QCL通過上調(diào)E2水平抑制破骨細(xì)胞形成從而減少骨丟失。黃瓜籽和生菜籽含有豐富的鈣、鎂等微量元素，可以促進(jìn)骨骼中礦物質(zhì)的平衡[4，6]。鈣和磷是骨組織的主要成分，本實(shí)驗(yàn)研究表明QCL能顯著提高血清鈣磷水平。

骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物含量的變化可反映骨轉(zhuǎn)換過程情況，同時可以預(yù)測骨折的發(fā)生，監(jiān)測藥物治療效果[18]。去卵巢誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥是一種高轉(zhuǎn)換狀態(tài)的骨代謝過程，表現(xiàn)為血清中ALP活性明顯增高[19]。

骨形成的生化指標(biāo)是血清PINP，骨吸收的生化指標(biāo)是血清CTX-I和尿DPD。研究[20-21]發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠表現(xiàn)為高骨轉(zhuǎn)換率，骨形成和骨吸收增強(qiáng)，PINP含量降低;CTX-I和DPD含量升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中QCL可以降低ALP、CTX-1、DPD水平，提高PINP水平，從而降低骨轉(zhuǎn)換，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。

綜上所述，QCL對骨質(zhì)疏松癥具有良好的預(yù)防作用，可能是通過改善鈣磷代謝、提高雌激素水平、降低骨轉(zhuǎn)換，從而提高骨密度。

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（本文編輯? 匡靜之 周? 旦）