顏思陽 楊仁義 劉利娟 馬強(qiáng) 李俊熙 周德生

〔摘要〕 目的 探討活血榮絡(luò)方對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用及對線粒體自噬的影響。方法 采用生物信息學(xué)方法挖掘腦梗死差異表達(dá)miRNAs，并預(yù)測活血榮絡(luò)方可能通過調(diào)節(jié)“STAT3-miR-17”反饋環(huán)路發(fā)揮作用。將SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、活血榮絡(luò)方組，運用線栓法建立腦缺血再灌注模型。造模前36、12 h及術(shù)后12 h給藥。術(shù)后24 h行神經(jīng)功能評分，并行TTC染色評估腦梗死體積;透射電鏡觀察自噬小體;Western blot檢測線粒體及自噬相關(guān)蛋白，評估線粒體自噬情況;Real-time PCR檢測“STAT3-miR-17”反饋環(huán)中miRNA、mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與模型組相比，活血榮絡(luò)方可明顯改善模型大鼠神經(jīng)功能損傷，減少腦梗死體積（P<0.01），下調(diào)p62、TOMM20的表達(dá)（P<0.05），上調(diào)LC3B的表達(dá)（P<0.01），增加損傷側(cè)腦組織自噬小體;下調(diào)miR-17 miRNA的表達(dá)（P<0.01），上調(diào)STAT3 mRNA的表達(dá)（P<0.01）。結(jié)論 活血榮絡(luò)方可通過上調(diào)線粒體自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控“STAT3-miR-17”反饋環(huán)路相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 腦梗死;活血榮絡(luò)方;STAT3;miR-17;反饋環(huán);線粒體自噬

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.001

〔Abstract〕 Objective To investigate the protective effect of Huoxue Rongluo Decoction on ischemia/reperfusion injury rats and its influence on mitochondrial autophagy. Methods Bioinformatics method was used to mine the differentlyexpressed miRNAs in cerebral infarction， and it was predicted that Huoxue Rongluo Decoction might play a role by regulating the "STAT3-miR-17" feedback loop. SD male rats were randomly divided into sham operation group， model group， and Huoxue Rongluo Decoction group， and the cerebral ischemia reperfusion model was established by thread plug method. Drugs were administered at 36 and 12 hours before modeling and 12 hours after surgery. Neural function score was performed 24 hours after operation， and cerebral infarction volume was assessed by TTC staining; autophagosomes were observed by transmission electron microscope; mitochondria and autophagy-related proteins were detected by Western blot to assess mitochondrial autophagy; real-time PCR was used to detect the expression of miRNA and mRNA in the feedback loop of "STAT3-miR-17". Results Compared with the model group， Huoxue Rongluo Decoction can significantly improve the neurological damage， reduce cerebral infarction volume of rats （P<0.01）， down-regulate the expressions of p62 and TOMM20 （P<0.05）， up-regulate the expression of LC3II （P<0.01）， and increase autophagosomes in the injured brain tissue; down-regulate the expression of miR-17 miRNA （P<0.01）， up-regulate the expression of STAT3 mRNA （P<0.01）. Conclusion Huoxue Rongluo Decoction exerts neuroprotective effect by moderately up-regulating mitochondrial autophagy， and its mechanism may be related to the regulation of "STAT3-miR-17" feedback loop.

〔Keywords〕 cerebral infarction; Huoxue Rongluo Decoction; STAT3; miR-17; feedback loop; mitochondrial autophagy

腦血管病是全球第二大死亡原因，也是全世界致殘的第三常見原因，具有高死亡率、致殘率和復(fù)發(fā)率的特點[1-2]。同時，研究顯示我國腦血管病疾病負(fù)擔(dān)在腦出血呈緩慢下降趨勢時，腦梗死上升趨勢較明顯[3]。因此，腦梗死的防治具有重要的社會意義。線粒體自噬作為一種特殊的自噬類型，可以選擇性地清除受損線粒體，其在應(yīng)激狀態(tài)中（如缺氧、鈣超載等）起著至關(guān)重要的作用。腦缺血再灌注引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)可激活線粒體自噬這一過程[4]，但目前對于線粒體自噬在腦缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury， I/R）的作用仍存在爭議。

腦梗死屬中醫(yī)學(xué)“缺血性中風(fēng)”范疇。榮氣，為一切精微物質(zhì)的總稱[5]。因其具備精微物質(zhì)屬性，又具有氣化運動的功能，而榮氣虛與榮氣滯互為因果、消長共存，導(dǎo)致氣化失司、內(nèi)邪交互、神機(jī)失用，發(fā)為腦梗死[6]?；谥形麽t(yī)結(jié)合方法論，將線粒體的生理、病理與榮氣理論相聯(lián)系，認(rèn)為榮氣的物質(zhì)屬性相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的線粒體，而線粒體的功能可以體現(xiàn)榮氣的作用[7]。

基于榮氣虛滯理論創(chuàng)制的活血榮絡(luò)方為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，廣泛應(yīng)用于臨床。前期研究[8]表明活血榮絡(luò)方能夠作用于線粒體，可減輕線粒體活性氧的產(chǎn)生，降低線粒體鈣超載等。但其調(diào)控腦梗死后線粒體自噬的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本項目利用生物信息學(xué)方法結(jié)合腦缺血再灌注大鼠模型，篩選“轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors， TF）-miRNA”反饋環(huán)及下游效應(yīng)機(jī)制，探討活血榮絡(luò)方對I/R的保護(hù)作用及對線粒體自噬的影響。

1 材料

1.1? 實驗動物

2～3月齡雄性SPF級SD大鼠30只，體質(zhì)量250～280 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心（通風(fēng)良好，晝夜交替12 h，溫度21～26 ℃，濕度40%～50%）。實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號：20201010-13）。

1.2? 主要藥物及試劑

活血榮絡(luò)方（院內(nèi)制劑）：雞血藤30 g，石楠藤30 g，生地黃15 g，玄參10 g，黃精15 g，乳香10 g，沒藥10 g，川芎10 g。各藥混合置于圓底燒瓶中，加10倍量水浸泡12 h后用冷凝回流裝置加熱回流2 h，提取液過濾，殘渣加8倍量水，繼續(xù)冷凝回流1 h，提取液過濾，合并2次過濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行濃縮，即得活血榮絡(luò)方浸膏，無菌玻璃瓶分裝，4 ℃貯存?zhèn)溆?。根?jù)人動物體表面積換算法（給藥劑量=0.018×人給藥劑量/大鼠體質(zhì)量），大鼠每天灌胃劑量約為11.7 g/kg。

BCA蛋白定量試劑盒（貨號：70-PQ0012，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）;SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（貨號：CW0022S，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）;Immobilon Western HRP底物（貨號：WBKLS0100，美國Millipore公司）;PageRulerTM Prestained Protein Ladder（貨號：26616，美國賽默飛世爾科技公司）;抗體：LC3B、p62、TOMM20、Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（貨號：ab48394、ab91526、ab186735、ab150120，英國Abcam公司）;HyPureTM Molecular Biology Grade Water（貨號：SH30538.02，美國HyClone公司）;RNA提取液、ServicebioRT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix （Low ROX）（貨號：G3013、G3330、G3321，武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.3? 主要儀器

透射電鏡（型號：Tecnai G2 Spirit Bio TWIN，美國FEI公司）;小型Mini-Protean?Tetra垂直電泳槽、小型Trans-blot轉(zhuǎn)印槽、Power PacTM Basic基礎(chǔ)電泳儀（電源）、化學(xué)凝膠成像分析儀、熒光定量PCR儀（型號：1658001、1703930、1645050、Chemi DocTMXRS+、CFX96TM，美國Bio-Rad公司）;PVDF膜（規(guī)格：26.5 cm×3.75 m/卷，0.22 μm，貨號：ISEQ00010，美國Millipore公司）;臺式高速冷凍型微量離心機(jī)（型號：D3024R，中國DragonLab公司）;超微量分光光度計（型號：NanoDrop2000，美國Thermo Scientific公司）;超凈工作臺（型號：SW-CJ-1FD，中國蘇凈安泰公司）;標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀（型號：GBZ2001-uo-p，中國青島富勒姆科技有限公司）;多功能酶標(biāo)儀（型號：Enspire，美國Perkinelmer公司）。

2 方法

2.1? “藥物-疾病-表型”核心靶點篩選及富集分析

利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）[9]及中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺v2.0數(shù)據(jù)庫（TCMIP， http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html），收集活血榮絡(luò)方中主要藥物（川芎、生地黃、黃精、雞血藤、乳香、沒藥、玄參）的化學(xué)成分。以口服生物利用度（OB）≥30%[10]，化合物類藥性（DL）≥0.18[11]為篩選條件，篩選出活血榮絡(luò)方中具有較高活性的化合物。通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫[12]收集與校對候選化合物名稱，并利用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫[13]對候選化合物相關(guān)靶點進(jìn)行預(yù)測，剔除無3D/2D化學(xué)結(jié)構(gòu)、靶點化合物。

通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫[14]，以“Cerebral Ischemia”O(jiān)R“Stroke”AND“Mitochondrial autophagy”（“腦缺血”或“卒中”和“線粒體自噬”）為檢索詞，收集腦梗死線粒體自噬的作用靶點。通過Bioinformatics Gent中Van de Peer Lab取交集獲得活血榮絡(luò)方與缺血性腦卒中線粒體自噬（“藥物-疾病-表型”）的共同靶點。

將共同靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）[15]，選擇Multiple Protenin，限定物種為Homo sapiens，設(shè)定最低要求互動分?jǐn)?shù)為高度信度0.700[16]，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)信息。導(dǎo)入Cytoscape軟件，使PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，行Degree、Closeness、Betweenness拓?fù)浞治觯劢购诵陌悬c。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對作用靶點進(jìn)行GO、KEGG富集分析，利用R軟件ggplot2包對前10位進(jìn)行可視化。

2.2? “mRNA-miRNA”反饋環(huán)路的構(gòu)建

根據(jù)“2.1”篩選獲得PPI、GO、KEGG富集分析結(jié)果，利用在線數(shù)據(jù)庫TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）[17]、miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）[18]、mirDIP（http：//ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp）[19]、miRDB（http：//mirdb.org/）[20]進(jìn)行反向預(yù)測，篩選作用于“藥物-疾病-表型”核心靶點的潛在miRNA。同時利用GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“Cerebral infarction”或“Cerebral ischemia”為檢索詞，獲取腦梗死m(xù)iRNA芯片（GSE117064）[21]。R語言對數(shù)據(jù)表達(dá)矩陣行質(zhì)量控制，采用limma包對表達(dá)矩陣進(jìn)行差異性分析，以|logFC|≥1與adj.P.Val<0.05為篩選條件，篩選出腦梗死后差異表達(dá)的miRNA，繪制火山圖及前50位熱圖。將其與核心靶點反向預(yù)測的miRNA取交集，篩選出腦梗死后差異表達(dá)并能調(diào)控核心靶點的miRNAs。

進(jìn)一步利用數(shù)據(jù)庫TransmiR v2.0篩選核心靶點可能調(diào)控的miRNAs，綜合分析獲得可能的“TF-miRNA”反饋環(huán)路。

2.3? 動物模型的制備與評價

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，術(shù)前12 h內(nèi)禁食不禁水。以10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉滿意后，參考Longa等[22]報道的大腦中動脈阻塞法（middle cerebral artery occlusion， MCAO），鈍性分離右側(cè)頸總動脈（common carotid artery， CCA）、頸外動脈（external carotid artery， ECA）和頸內(nèi)動脈（internal carotid artery， ICA），從ECA與ICA分叉部約4 mm處斜45°剪口進(jìn)栓線，插入栓線約18 mm梗阻右側(cè)大腦中動脈;梗阻2 h后拔出拴線進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組分離CCA、ECA、ICA，不插入栓線，余過程同造模組。將大鼠保溫至蘇醒后分籠喂養(yǎng)，術(shù)后6 h再恢復(fù)進(jìn)食。采用Zea-Longas[22]標(biāo)準(zhǔn)評分法，評分1～3分大鼠納入后續(xù)實驗。

2.4? 分組及給藥

將30只SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別為假手術(shù)（Sham）組、模型（I/R）組、活血榮絡(luò)方（HXRLF）組，每組10只。實驗過程中出現(xiàn)死亡或取材時發(fā)現(xiàn)為腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血等予以剔除，按需要以相同方法造模補(bǔ)充。

HXRLF組劑量參照前期實驗[23]，每天灌胃給藥11.7 g/kg，連續(xù)給藥3次，分別為造模前36 h和12 h以及造模后12 h，Sham組和I/R組給予等劑量蒸餾水。

2.5? 神經(jīng)功能缺損評分

大鼠再灌注后，按Zea-Longas五級標(biāo)準(zhǔn)評分法對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分[22]，評分等級為0～4分，分值越高，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。其中0分無明顯神經(jīng)功能缺損;1分：提尾時對側(cè)前肢不能完全伸直，爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;2分：提尾時對側(cè)前肢屈曲內(nèi)收，爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分：站立不穩(wěn)，爬行時向偏癱側(cè)跌倒;4分：意識障礙，不能夠自發(fā)行走。取評分在1～3分者進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.6? TTC染色觀察大鼠腦組織變化

再灌注24 h后，大鼠麻醉滿意后固定，腹主動脈采血后快速斷頭取腦，于-20 ℃冰箱冷凍30 min，切除嗅球，沿冠狀面切片，置于37 ℃水浴鍋預(yù)熱的2% TTC染液中，避光雙面染色20 min。染色結(jié)束后于4%多聚甲醛中固定，4 ℃冰箱過夜后置于深色背景面觀察，紅色為正常腦組織，白色為梗死腦組織。缺血區(qū)腦梗死體積比=各切片白色缺血區(qū)面積之和/各切片腦片面積之和。用Image-J軟件計算腦梗死面積并分析。

2.7? 透射電鏡觀察各組大鼠腦組織中線粒體自噬現(xiàn)象

再灌注24 h后，大鼠深度麻醉后固定，腹主動脈采血后先后經(jīng)心臟灌注生理鹽水及4%多聚甲醛，灌注充分后斷頭取腦，分離出損傷側(cè)皮質(zhì)腦組織，于冰上制備成1 mm3大小的組織塊，置于4 ℃預(yù)冷的戊二醛溶液中固定，電鏡室包埋、檢測。

2.8? Western blot法檢測各組大鼠腦組織中LC3B、p62、TOMM20的表達(dá)水平

再灌注24 h后，大鼠深度麻醉下斷頭取腦，取損傷側(cè)腦組織分裝于凍存管中，液氮急凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。取相應(yīng)組別大鼠腦組織置于冰上，加入裂解液（組織裂解液∶PMSF=100∶1）后，經(jīng)組織搗碎均漿機(jī)充分研磨提取總蛋白。采用BCA法測定總蛋白濃度。蛋白上樣量為3 μg/μL，10 μL/孔。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，一抗（LC3B：1∶1 000，p62：1∶1 000，TOMM20：1∶1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜3次，10 min/次，二抗（山羊抗兔：1∶10 000）37 ℃恒溫水浴箱孵育，再次洗膜后顯色成像。使用Image-Lab檢測圖像灰度值并進(jìn)行分析，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示相對蛋白表達(dá)量。

2.9? Real-time PCR法檢測各組大鼠腦組織“TF-miRNA”反饋環(huán)路miRNA、mRNA基因表達(dá)

取-80 ℃凍存的腦組織100 mg，加入1 mL Trizol Reagent，組織搗碎均漿機(jī)充分研磨提取總RNA，使用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄后，按試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×qPCR Mix 7.5 μL，2.5 μM基因引物1.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。預(yù)變性95 ℃10 min，循環(huán)（40次）95 ℃，15 s→60 ℃，60 s，熔解曲線60 ℃→95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃。miRNA內(nèi)參為U6，mRNA內(nèi)參為GAPDH，相對表達(dá)量用2-ΔΔCt表達(dá)。PCR引物序列見表1。

2.10? 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以“x±s”表示，神經(jīng)功能評分采用Mann-Whitney test分析，其余指標(biāo)滿足方差齊性，則各組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行比較，若不滿足方差齊性，則采用Kruskal Wallis H檢驗。

3 結(jié)果

3.1? “藥物-疾病-表型”核心靶點篩選及富集分析結(jié)果

通過TCMSP及TCMID數(shù)據(jù)庫共獲得符合篩選條件的活血榮絡(luò)方中具有較高活性的化合物99個（川芎7個，生地黃2個，雞血藤24個，玄參9個，黃精12個，乳香8個，沒藥45個）。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對篩選出的化合物進(jìn)行相關(guān)靶點預(yù)測，剔除無化學(xué)結(jié)構(gòu)式及無靶點化合物，得到活血榮絡(luò)方可能作用的靶點1 109個。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫收集到腦梗死線粒體自噬靶點1 653個靶點。利用Bioinformatics Gent取交集獲得活血榮絡(luò)方主要化合物與腦梗死線粒體自噬（藥物-疾病-表型）共同靶點，共同靶點372個。見圖1。

利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件對共同靶點蛋白進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)聚焦，分別行Degree、Closeness、Betweenness拓?fù)浞治?，聚焦于?0位核心靶點。見圖2。

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對作用靶點進(jìn)行GO、KEGG富集分析，對P值取負(fù)對數(shù)，得出“-lgP”值，-lgP值越大，富集程度越大，篩選出富集程度前10位進(jìn)行分析，并利用R軟件ggplot2分析包進(jìn)行可視化。見圖3。活血榮絡(luò)方作用靶點主要分布在胞質(zhì)、胞核、溶酶體等細(xì)胞組分中，通過調(diào)控ATP結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等，調(diào)節(jié)多種蛋白磷酸化、炎癥反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)、血管生成、轉(zhuǎn)錄、抑制凋亡等，通過HIF-1信號通路、PI3K/Akt信號通路等調(diào)節(jié)腦梗死后線粒體自噬。結(jié)合前期研究[23-24]，活血榮絡(luò)方可激活腦梗死后JAK2/STAT3通路、調(diào)控STAT3/miRNA反饋環(huán)路，激活下游HIF-1通路等。故本研究聚焦于STAT3、HIF1-α，進(jìn)一步篩選相關(guān)miRNAs。

3.2? “TF-miRNA”反饋環(huán)路的構(gòu)建

利用在線數(shù)據(jù)庫TargetScan、miRWalk、mirDIP、miRBD進(jìn)行反向預(yù)測，篩選可能作用于STAT3、HIF-1α的潛在miRNA，其中27個可調(diào)控STAT3，64個可調(diào)控HIF-1α，見圖4。利用GEO數(shù)據(jù)庫，獲取GSE117064數(shù)據(jù)集，歸一化與差異化分析后繪制差異miRNAs火山圖，結(jié)果表明腦梗死后差異表達(dá)的miRNAs共2 565個，其中1 799個表達(dá)上調(diào)，766個表達(dá)下調(diào)。三者取交集得2個腦梗死后差異表達(dá)并能調(diào)控核心靶點的miRNAs（miR-17-5p、miR-20b-5p）。見圖5。

進(jìn)一步于TransmiR v2.0數(shù)據(jù)庫中檢索STAT3、HIF-1α調(diào)控表達(dá)的miRNAs，知STAT3、HIF-1α可轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-17的表達(dá)，初步構(gòu)成“STAT3-miR-17”、“HIF-1α-miR-17”反饋環(huán)。而STAT3可作為HIF-1α上游發(fā)揮作用，調(diào)控HIF-1α轉(zhuǎn)錄表達(dá)[25]。綜上，整合多個數(shù)據(jù)庫，預(yù)測活血榮絡(luò)方可通過調(diào)控STAT3/miRNA-17反饋環(huán)介導(dǎo)下游通路調(diào)控腦梗死后線粒體自噬以保護(hù)受損腦組織。

綜上，整合多個數(shù)據(jù)庫，預(yù)測活血榮絡(luò)方可通過調(diào)控STAT3/miRNA-17反饋環(huán)介導(dǎo)下游通路調(diào)控腦梗死后線粒體自噬以保護(hù)受損腦組織。

3.3? 各組大鼠神經(jīng)功能評分

與Sham組比較，I/R組神經(jīng)功能評分明顯升高，神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重（P<0.01）;與I/R組相比，HXRLF組評分降低，提示活血榮絡(luò)方可改善神經(jīng)功能缺損評分（P<0.01）。見表2。

3.4? 各組大鼠TTC染色情況

TTC染色結(jié)果表明，與I/R組相比，活血榮絡(luò)方可明顯減少I/R大鼠損傷側(cè)腦梗死體積。見表3。

3.5? 各組大鼠損傷側(cè)腦組織透射電鏡結(jié)果

損傷側(cè)腦組織透射電鏡結(jié)果顯示，I/R組損傷側(cè)腦組織中雙層膜結(jié)構(gòu)自噬小體較Sham組增多;與I/R組相比，HXRLF組雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體明顯增多。見圖6。

3.6? 各組大鼠腦組織中LC3B、p62、TOMM20的表達(dá)水平比較

與Sham組相比，I/R組損傷側(cè)腦組織自噬相關(guān)蛋白LC3B、p62表達(dá)水平上調(diào)（P<0.01），線粒體膜蛋白TOMM20表達(dá)水平下調(diào)（P<0.01）;而與I/R組相比，活血榮絡(luò)方可顯著上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3B（P<0.01），下調(diào)TOMM20和p62（P<0.05）。見圖7。

3.7? 各組大鼠腦組織中“STAT3-miR-17”反饋環(huán)路mRNA及miRNA的表達(dá)

與Sham組比較，I/R組miR-17表達(dá)明顯升高（P<0.01），STAT3 mRNA表達(dá)降低（P<0.05）;與I/R組比較，HXRLF組miR-17的表達(dá)可明顯下調(diào)（P<0.01）;STAT3 mRNA的表達(dá)上調(diào)（P<0.01）。見圖8。

4 討論

腦梗死會引起細(xì)胞內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors， TFs）、微/小分子RNA（microRNAs， miRNAs）發(fā)生變化。細(xì)胞核內(nèi)某些TF可以調(diào)控特定miRNA的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)其表達(dá);而胞質(zhì)中某些miRNA可與TF mRNA的3UTR相結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯，下調(diào)蛋白表達(dá)，減少入核轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)miRNA的轉(zhuǎn)錄，構(gòu)成特定的“TF-miRNA”反饋環(huán)路[24]。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)，結(jié)合前期研究[24]，預(yù)測活血榮絡(luò)方可能調(diào)節(jié)“STAT3-miR-17”反饋環(huán)路以調(diào)控腦梗死后線粒體自噬以發(fā)揮腦保護(hù)作用。

榮氣是一切精微物質(zhì)的總稱[5]，作為“動力工廠”的線粒體在某種意義上反映了“榮氣”的作用。課題組基于榮氣與線粒體的相關(guān)性，從榮氣氣化不足所致榮氣虛與線粒體自噬過度及榮氣氣化阻滯所致榮氣滯與線粒體自噬不足進(jìn)行了闡釋，揭示了榮氣虛滯與線粒體自噬的相關(guān)性[7]。并制定了活血榮絡(luò)方以調(diào)理氣化來調(diào)整榮氣的升降出入運動，使其恢復(fù)到氣化神機(jī)的協(xié)調(diào)狀態(tài)。前期研究[23，26]證實活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠起腦保護(hù)作用;并可改善線粒體功能[8]。因此，本研究采用MCAO/R大鼠模型，初步驗證“STAT3-miRNA”反饋環(huán)在腦梗死中的作用及活血榮絡(luò)方的調(diào)控作用。研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，活血榮絡(luò)方可明顯改善I/R組大鼠的神經(jīng)功能缺血，減少腦梗死體積，增加自噬小體數(shù)量，上調(diào)線粒體自噬標(biāo)記蛋白的表達(dá)，并可下調(diào)miR-17 miRNA的表達(dá)，上調(diào)STAT3 mRNA表達(dá)。提示活血榮絡(luò)方的神經(jīng)保護(hù)作用與上調(diào)線粒體自噬有關(guān)，其機(jī)制可能與調(diào)控“STAT3-miR-17”反饋環(huán)路相關(guān)。

STAT3是多種細(xì)胞因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)，參與細(xì)胞自噬、增殖、凋亡、血管新生等多個生物過程[25，27]。應(yīng)激狀態(tài)下激活形成穩(wěn)定的二聚體并進(jìn)入細(xì)胞核，協(xié)調(diào)各種轉(zhuǎn)錄程序[28-29]，是自噬相關(guān)基因的主要轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子[25]。He等[30]研究表明miR-17可直接靶向STAT3發(fā)揮作用。而miR-17與STAT3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，抑制miR-17，可上調(diào)STAT3、p-STAT3的表達(dá)[31-32]。本研究表明，I/R組miR-17 miRNA表達(dá)升高，而STAT3 mRNA有所下降;活血榮絡(luò)方可抑制miR-17 miRNA的表達(dá)，上調(diào)STAT3 mRNA的表達(dá)。提示活血榮絡(luò)方可能通過調(diào)節(jié)“STAT3-miR-17”調(diào)控下游相關(guān)通路發(fā)揮作用。

現(xiàn)有研究[25，33]表明，STAT3可調(diào)節(jié)HIF-1α在低氧狀態(tài)下的表達(dá)來執(zhí)行其激活自噬的功能。亦可直接靶向BNIP3調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生，其磷酸化可能增加BNIP3表達(dá)激活線粒體自噬[34-35]。此外，STAT3向線粒體的易位可能在自噬調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[36]。而LC3作為自噬標(biāo)記蛋白，主要包括胞質(zhì)中的LC3I（LC3A）和定位于自噬小體膜上的LC3II（LC3B）兩種形式，兩者之間可相互轉(zhuǎn)化，而LC3II通常被認(rèn)為是自噬形成的標(biāo)志分子。p62可充當(dāng)支架蛋白與LC3相結(jié)合，進(jìn)而被溶酶體降解，其表達(dá)常與自噬水平呈負(fù)相關(guān)，即自噬水平升高時，p62的表達(dá)水平降低，反之，則表達(dá)升高;而當(dāng)自噬小體與溶酶體形成受阻時，自噬小體的降解受阻，LC3II和p62則會累積[37]。并選取了線粒體膜蛋白TOMM20來反應(yīng)線粒體變化情況。研究發(fā)現(xiàn)，活血榮絡(luò)方可上調(diào)LC3B的表達(dá)，并下調(diào)p62、TOMM20的表達(dá)，但對下游相關(guān)通路的調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠腦組織I/R損傷有保護(hù)作用。其可能機(jī)制與調(diào)節(jié)“STAT3/miR-17”反饋環(huán)路，上調(diào)線粒體自噬，清除受損線粒體，維持線粒體功能有關(guān)。為中醫(yī)藥研究提供新的研究方向或思路。

參考文獻(xiàn)

[1] GBD CAUSES oF DEATH COLLABORATORS. Global， regional， and national age-sex-specific mortality for 282 causes of death in 195 countries and territories， 1980-2017： A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J]. Lancet， 2018， 392（10159）： 1736-1788.

[2] GBD 2017 DALYs， HALE Collaborators. Global， regional， and national disability-adjusted life-years （DALYs） for 359 diseases and injuries and healthy life expectancy （HALE） for 195 countries and territories， 1990-2017： A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J]. Lancet， 2018， 392（10159）： 1859-1922.

[3] 彭? 琴，李海玲，王? 媛，等.1990-2016年中國人群腦血管病疾病負(fù)擔(dān)變化趨勢[J].中華流行病學(xué)雜志，2019，40（4）：400-405.

[4] ZHANG X N， YAN H J， YUAN Y， et al. Cerebral ischemia-reperfusion-induced autophagy protects against neuronal injury by mitochondrial clearance[J]. Autophagy， 2013， 9（9）： 1321-1333.

[5] 周德生，張雪花，譚? 靜.榮氣虛滯論[J].中醫(yī)藥通報，2005，4（2）：22-25.

[6] 周德生，陳湘鵬，胡? 華，等.腦梗死榮氣虛滯病機(jī)特征之探討[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2014，12（12）：1560-1561，1576.

[7] 顏思陽，周德生.基于榮氣虛滯理論探討腦梗死后線粒體自噬及臨床辨治[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2020，18（6）：1000-1002.

[8] 陳湘鵬，周德生，胡? 華，等.活血榮絡(luò)片對急性腦梗死患者血漿CF6及線粒體游離Ca2+濃度水平的影響[J].河南中醫(yī)，2016，36（6）：1006-1008.

[9] RU J， LI P， WANG J， et al. TCMSP： A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. Journal of Cheminformatics， 2014. 6： 13.

[10] TIAN S， LI Y Y， WANG J M， et al. ADME evaluation in drug discovery. 9. Prediction of oral bioavailability in humans based on molecular properties and structural fingerprints[J]. Molecular Pharmaceutics， 2011， 8（3）： 841-851.

[11] GIBALDI M， LEVY G. Pharmacokinetics in clinical practice. I. Concepts[J]. JAMA， 1976， 235（17）： 1864-1867.

[12] KIM S， CHEN J， CHENG T J， et al. PubChem 2019 update： Improved access to chemical data[J]. Nucleic Acids Research， 2019， 47（D1）： D1102-D1109.

[13] GFELLER D， MICHIELIN O， ZOETE V. Shaping the interaction landscape of bioactive molecules[J]. Bioinformatics， 2013， 29（23）： 3073-3079.

[14] FISHILEVICH S， NUDEL R， RAPPAPORT N， et al. GeneHancer： genome-wide integration of enhancers and target genes in GeneCards[J]. Database， 2017， 2017： 1-17.

[15] VON MERING C， JENSEN L J， SNEL B， et al. STRING： known and predicted protein-protein associations， integrated and transferred across organisms[J]. Nucleic Acids Research， 2005， 33： D433-D437.

[16] SZKLARCZYK D， GABLE A L， LYON D， et al. STRING v11： protein-protein association networks with increased coverage， supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets[J]. Nucleic Acids Research， 2019， 47（D1）： D607-D613.

[17] LEWIS B P， BURGE C B， BARTEL D P. Conserved seed pairing， often flanked by adenosines， indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J]. Cell， 2005， 120（1）： 15-20.

[18] DING J， LI X M， HU H Y. TarPmiR： a new approach for microRNA target site prediction[J]. Bioinformatics， 2016， 32（18）： 2768-2775.

[19] TOKAR T， PASTRELLO C， ROSSOS A， et al. mirDIP 4.1-integrative database of human microRNA target predictions[J]. Nucleic Acids Research， 2018， 46（D1）： D360-D370.

[20] CHEN Y H， WANG X W. miRDB： an online database for prediction of functional microRNA targets[J]. Nucleic Acids Research， 2020， 48（D1）： D127-D131.

[21] SONODA T， MATSUZAKI J， YAMAMOTO Y， et al. Serum MicroRNA-based risk prediction for stroke[J]. Stroke， 2019， 50（6）： 1510-1518.

[22] LONGA E Z， WEINSTEIN P R， CARLSON S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989， 20（1）： 84-91.

[23] 周穎璨，王洪海，周德生，等.活血榮絡(luò)方對大鼠腦缺血再灌注損傷JAK2、STAT3表達(dá)的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2017，28（9）： 2111-2114.

[24] 楊仁義，周德生，傅馨瑩，等.基于STAT3/miRNA反饋環(huán)路探討中醫(yī)藥促腦梗死后血管新生的調(diào)控機(jī)制[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2020，26（20）：221-228.

[25] YOU L K， WANG Z G， LI H S， et al. The role of STAT3 in autophagy[J]. Autophagy， 2015， 11（5）： 729-739.

[26] 周德生，劉利娟，寇志剛，等.活血榮絡(luò)片對大腦中動脈缺血模型大鼠腦組織微囊蛋白-1表達(dá)的影響[J].河北中醫(yī)，2016，38（1）：80-84，163.

[27] BROMBERG J F， WRZESZCZYNSKA M H， DEVGAN G， et al. Stat3 as an oncogene[J]. Cell， 1999， 98（3）： 295-303.

[28] SRIVASTAVA J， DIGIOVANNI J. Non-canonical Stat3 signaling in cancer[J]. Molecular Carcinogenesis， 2016， 55（12）： 1889-1898.

[29] GUANIZO A C， FERNANDO C D， GARAMA D J， et al. STAT3： A multifaceted oncoprotein[J]. Growth Factors， 2018， 36（1/2）： 1-14.

[30] HE M， WANG Q Y， YIN Q Q， et al. HIF-1α downregulates miR-17/20a directly targeting p21 and STAT3： a role in myeloid leukemic cell differentiation[J]. Cell Death and Differentiation， 2013. 20（3）： 408-418.

[31] 李國良，劉德衍，楊彥華，等.miR-17及其靶基因HIF-1α、STAT3在心源性猝死心肌組織中的表達(dá)及其意義[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志， 2019，34（6）：562-566.

[32] WANG Z， YUAN W， LI B， et al. PEITC promotes neurite growth in primary sensory neurons via the miR-17-5p/STAT3/GAP-43 axis[J]. Journal of Drug Targeting， 2019， 27（1）： 82-93.

[33] SHEN S S， NISO-SANTANO M， ADJEMIAN S， et al. Cytoplasmic STAT3 represses autophagy by inhibiting PKR activity[J]. Molecular Cell， 2012， 48（5）： 667-680.

[34] PRATT J， ANNABI B. Induction of autophagy biomarker BNIP3 requires a JAK2/STAT3 and MT1-MMP signaling interplay in Concanavalin-A-activated U87 glioblastoma cells[J]. Cellular Signalling， 2014， 26（5）： 917-924.

[35] LI S， XIA Y， CHEN K， et al. Epigallocatechin-3-gallate attenuates apoptosis and autophagy in concanavalin A-induced hepatitis by inhibiting BNIP3[J]. Drug Design， Development and Therapy， 2016， 10： 631-47.

[36] SZCZEPANEK K， CHEN Q， LARNER A C， et al. Cytoprotection by the modulation of mitochondrial electron transport chain： The emerging role of mitochondrial STAT3[J]. Mitochondrion， 2012， 12（2）： 180-189.

[37] 余婧萍，宋禎彥，李富周，等.芍藥苷通過促進(jìn)細(xì)胞自噬抑制H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，40（6）：653-659.

（本文編輯? 蘇? 維）