江智豪 胡燕 王孟清 丁伊 鄧弈駃 鄧夢婷

〔摘要〕 目的 探討五虎湯對咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma， CVA）小鼠可能的作用機制。方法 將 70只BALB/c小鼠分為空白組、CVA組、CVA再激發(fā)組、地塞米松組和五虎湯低、中、高劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組采用雞卵蛋白（ovalbumin， OVA）致敏法激發(fā)建立CVA模型。休息30 d后，空白組與CVA組用生理鹽水進行新一輪霧化，其余組用OVA進行新一輪霧化激發(fā)。五虎湯低、中、高劑量組分別灌胃1.6、3.2、6.4 g/kg五虎湯，地塞米松組腹腔注射1.82 mg/kg地塞米松，空白組、CVA組、CVA再激發(fā)組灌胃等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)10 d后處理小鼠。分離肺組織制作病理切片，行HE及PAS染色;采集肺泡灌洗液進行細胞計數(shù);并用ELISA法檢測血清IgE、IFN-？酌及IL-4、IL-5、IL-23 的含量;流式細胞術檢測肺組織中記憶T細胞CD4+ Tm亞群的比例。結果 肺組織HE及PAS病理染色顯示：空白組小鼠肺部無炎性細胞浸潤;CVA組小鼠肺部有少許的炎性細胞浸潤;CVA再激發(fā)組小鼠氣道炎癥、官腔狹窄表現(xiàn)更為明顯;五虎湯各劑量組及地塞米松組小鼠的氣道炎癥均有不同程度的緩解。肺泡灌洗中細胞計數(shù)結果顯示：CVA組較空白組升高;CVA再激發(fā)組較CVA組升高;五虎湯各劑量組及地塞米松組降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;五虎湯各劑量組與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。ELISA檢測結果顯示：CVA組的IL-4、IL-5、IL-23、IgE水平較空白組上升（P<0.05），IFN-？酌水平較空白組下降（P<0.05）;CVA再激發(fā)組的IL-4、IL-5、IL-23、IgE水平較CVA組上升（P<0.05），IFN-？酌水平較CVA組下降（P>0.05）;五虎湯各劑量組及地塞米松組與CVA再激發(fā)組比較，出現(xiàn)各細胞因子水平的回調，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;五虎湯各劑量組與地塞米松組相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。流式細胞術檢測肺部組織CD4+ Tm亞群結果顯示：記憶性T細胞的占比情況，CVA組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;CVA再激發(fā)組與CVA組相比則明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;五虎湯各劑量組及地塞米松組均減低，與CVA再激發(fā)組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;五虎湯各劑量組與地塞米松組相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論 五虎湯可通過降低記憶性T細胞、減少IgE和炎性細胞因子的分泌、糾正細胞因子失衡，從而調控炎癥記憶而發(fā)揮治療CVA的作用。

〔關鍵詞〕 咳嗽變異性哮喘;五虎湯;T細胞;炎癥記憶

〔中圖分類號〕R256.1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.004

〔Abstract〕 Objective To explore the possible mechanism of Wuhu Decoction on mice with cough variant asthma （CVA）. Methods 70 BALB/c mice were divided into blank group， CVA group， CVA re-challenge group， dexamethasone group and Wuhu Decoction low， medium and high dose groups， with 10 mice in each group. Except the blank group， the other groups were stimulated by the ovalbumin sensitization method to establish the CVA model. After resting for 30 days， the blank group and CVA group were given a new round of nebulization with normal saline， and the other groups were given a new round of nebulization with OVA. The Wuhu Decoction low， medium， and high dose groups were administered with 1.6， 3.2， and 6.4 g/kg Wuhu Decoction， respectively， the dexamethasone group was intraperitoneally injected with 1.82 mg/kg dexamethasone， and the blank group， CVA group， and CVA re-challenge group were intragastrically treated with the same volume of normal saline， once a day， for 10 consecutive days. Lung tissues were separated to make pathological sections， then HE and PAS staining were performed; alveolar lavage fluid was collected for cell count; and ELISA method was used to detect serum IgE， IFN-?and IL-4， IL-5， IL-23 content; flow cytometry was used to detect the proportion of CD4+ Tm subsets of memory T cells in lung tissue. Results The HE and PAS pathological staining of lung tissues showed that the lung of mice of the blank group had no inflammatory cell infiltration; the lung of mice of the CVA group had a little inflammatory cell infiltration; the airway inflammation and stenosis of the CVA group was more obvious; the airway inflammation of the mice in each dose group of Wuhu Decoction and the dexamethasone group all alleviated to varying degrees. The cell count results in alveolar lavage showed that the CVA group was higher than that of the blank group; the CVA re-challenge group was higher than that of the CVA group; each dose group of Wuhu Decoction and the dexamethasone group were lower， the differences were statistically significant （P<0.05）; compared with the dexamethasone group， each dose group of Wuhu Decoction were no statistically significant differences （P>0.05）. ELISA test results showed that the levels of IL-4， IL-5， IL-23 and IgE in the CVA group were higher than those in the blank group （P<0.05）， and the level of IFN-?was lower than that in the blank group （P<0.05）; the levels of IL-4， IL-5， IL-23， and IgE of CVA re-challenge group were higher than those in the CVA group （P<0.05）， and the level of IFN-?was lower than the CVA group （P>0.05）; each dose group of Wuhu Decoction and dexamethasone group compared with the CVA re-challenging group， there were a callback in the levels of each cytokine， and the differences were statistically significant （P<0.05）; compared with the dexamethasone group， each dose group of Wuhu Decoction were no statistically significant differences （P>0.05）. The results of CD4+ Tm subgroups in lung tissues detected by flow cytometry showed that the proportion of memory T cells was not statistically significant between the CVA group and the blank group （P>0.05）; compared with the CVA group， the ratio of the CVA re-challenge group was increased significantly， and the difference was statistically significant （P<0.05）; each dose group of Wuhu Decoction and the dexamethasone group decreased， compared with the CVA re-challenge group， the differences were statistically significant （P<0.05）; compared with the dexamethasone group， each dose group of Wuhu Decoction were no significant difference （P>0.05）. Conclusion Wuhu Decoction can treat CVA by reducing memory T cells， reducing the secretion of IgE and inflammatory cytokines， and correcting cytokine imbalance， thereby regulating inflammatory memory.

〔Keywords〕 cough variant asthma; Wuhu Decoction; T cell; inflammatory memory

咳嗽變異性哮喘（cough-variant asthma， CVA）是引起兒童反復或慢性咳嗽的重要原因，臨床上表現(xiàn)為4周以上的咳嗽，無感染征象，不伴有喘息[1]。當前的流行病學調查顯示，CVA占中國兒童慢性咳嗽的比例高達41.95%[2]。CVA治療不及時，導致癥狀遷延不愈，不僅影響患兒的生長發(fā)育，還有1/3比例CVA患兒發(fā)展為典型的哮喘[3]。CVA由多種因素共同作用，發(fā)病機制復雜，被認為是一種特殊類型的早期哮喘[4]，氣道的慢性炎癥為其主要病理表現(xiàn)[5]。在臨床中發(fā)現(xiàn)，咳嗽反復的CVA患兒存在炎癥記憶的現(xiàn)象，即第二次就診時臨床表現(xiàn)較第一次發(fā)病更強烈，本病在中醫(yī)學中屬于哮喘“苗期”，主張早期采取措施進行治療[6]，以中藥五虎湯治療取得了良好的療效[7]。本次研究在動物實驗中構建CVA小鼠模型，對CVA病程中是否存在炎癥記憶及五虎湯是否通過干預炎癥記憶發(fā)揮作用進行研究。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實驗動物? SPF級雌性BALB/c小鼠，4～5周齡，體質量15～18 g。所有動物均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物資格證書編號：SCXK（湘）2019-0004。實驗方案經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準，倫理審批號：2020072202。

1.1.2? 藥物? 五虎湯的組成藥材由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房提供。根據(jù)古籍記載與臨床應用，單劑五虎湯的用量擬定為：炙麻黃2.4 g，苦杏仁6.0 g，生石膏9.0 g，生甘草2.4 g，細茶葉4.8 g。把藥物混合加入5倍劑量的蒸餾水中，首先浸泡30 min，然后回流提取40 min，將煎煮液濾凈后再加入5倍量蒸餾水，再回流提取40 min，將前后兩次煎液混勻，使用旋轉蒸發(fā)儀濃縮成含生藥2.46 kg/L的五虎湯灌胃藥液。地塞米松（批號：S1039，美國Sigma公司）;雞卵清蛋白（ovalbumin， OVA，批號：9006-59-1，上海Solarbio公司）;氯化乙酰膽堿（批號：2260-50-6，美國Selleck公司）。

1.1.3? 主要試劑及儀器? 蘇木精-伊紅染色液（批號：P032IH），中性樹膠（批號：P033IH），二甲苯（批號：10023418），無水乙醇（批號：10009218）均購自國藥控股湖南有限公司;IL-4（批號：E20181109001）、IL-5（批號：E20181109017）、IL-23（批號：E20181109019）、IFN-？酌（批號：E20180713006）與總IgE（批號：E20181109003）ELISA試劑盒均購自上海晶天生物科技有限公司。

MACSQuant Analyzer 流式細胞儀（型號：130-092-197，德國Miltenyi公司）;超聲霧化器（型號：S888E，南京道芬電子有限公司）;小動物呼吸機（型號：DHX-50，美國BUXCO公司）;生物組織攤烤片機（型號：YT-6C，孝感宏翔生物醫(yī)械技術有限公司）;透射電子顯微鏡（型號：HT7700，日立高新技術公司）;臺式離心機（型號：12008007，金壇市大地自動化儀器廠）。

1.2? 方法

1.2.1? 實驗動物分組? 將小鼠編號后，隨機分為空白組15只、造模組65只，從兩組中分別隨機選5只小鼠以小動物呼吸機檢測氣道反應性，驗證造模是否成功，再將造模組分為CVA組、CVA再激發(fā)組、地塞米松組和五虎湯低、中、高劑量組。共7組，每組10只。

1.2.2? 動物模型建立及給藥? 采用OVA和氫氧化鋁聯(lián)合激發(fā)致敏建立CVA小鼠模型[8-9]。所有小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，在第1、7、14天，空白組小鼠腹腔注射生理鹽水200 μL/只，其他各組小鼠腹腔注射200 μL的致敏液（含OVA 100 μg，氫氧化鋁20 μg，溶解于生理鹽水之中）以致敏。末次致敏7 d之后，將空白組放入自制的霧化箱內(nèi)以10 mL的生理鹽水進行超聲霧化，其余各組小鼠則以10 mL的1.5% OVA進行超聲霧化激發(fā)，30 min/d，連續(xù)激發(fā)10 d。休息30 d后，空白組與CVA組用10 mL生理鹽水替代1.5% OVA進行新一輪霧化，同時給予生理鹽水灌胃。其余組小鼠則用10 mL 1.5% OVA再進行一輪霧化激發(fā)，本輪霧化前1 h，CVA再激發(fā)組給予生理鹽水灌胃，五虎湯低、中、高劑量組灌胃1.6、3.2、6.4 g/kg的五虎湯藥液，地塞米松組腹腔注射1.82 mg/kg地塞米松，連續(xù)10 d后取材檢測。

1.2.3? 氣道反應性檢測? 將小鼠麻醉，待小鼠四肢松弛后，將小鼠固定消毒，外科剪切開頸部皮膚，暴露氣管，予靜脈留置針行頸靜脈穿刺固定，V字形剪開氣管，用深靜脈穿刺針做氣管插管，接小動物呼吸機，行氣管切開插管固定。呼吸機參數(shù)調整至呼吸頻率75次/min，潮氣量為8 mL/kg。記錄氣道壓力、氣道流量和潮氣量的變化。待小鼠氣道壓力穩(wěn)定后用0.1 mL不同濃度的乙酰膽堿（0、6.25、12.5、25、50 μg/mL）霧化。吸入乙酰膽堿后，收集吸入5 s至1 min的數(shù)據(jù)，以計算機動物肺功能分析軟件檢測基礎吸氣相氣道阻力和用藥后的氣道阻力，以氣道阻力的變化代表氣道反應性。

1.2.4? 肺組織病理檢測? 將小鼠胸腔打開，取左側肺組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋、切片，分別用HE、PAS兩種染色方法對標本染色，鏡下觀察并拍照。

1.2.5? BALF中細胞計數(shù)? 實驗結束后，打開小鼠胸腔，暴露主支氣管及肺組織，以PBS進行離體肺泡灌洗，回收BALF，測定細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞百分比。

1.2.6? ELISA法測定細胞因子水平? 采集小鼠外周血血清，依據(jù)ELISA試劑盒說明書的方法步驟測定小鼠血清中總IgE及IL-4、IL-5、IL-23、IFN-的水平。

1.2.7? 流式細胞術檢測各組肺組織記憶T細胞亞群? 將新鮮肺組織碾碎，制成混懸液，參考文獻[10]對肺組織中CD4+ Tm細胞所占比例進行流式細胞術檢測，每組重復測3次。

1.3? 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均采用“x±s”表示，兩組之間比較滿足正態(tài)分布者采用t檢驗，多組之間比較，首先進行正態(tài)分布檢驗，若符合正態(tài)分布，兩組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊者采用LSD檢驗，不齊者用Dunett's T3檢驗，若不滿足則用秩和檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 空白組與CVA組小鼠氣道阻力值比較

乙酰膽堿濃度為0 μg/mL時，空白組與CVA組氣道阻力值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;隨著吸入乙酰膽堿濃度的逐漸增加，兩組氣道阻力值增高，乙酰膽堿濃度為6.25、12.5、25、50 μg/mL時，CVA組的氣道阻力值明顯高于空白組（P<0.05），氣道阻力值增高代表氣道反應性增強，是CVA的重要標志，表明造模成功。見表1。

2.2? 各組小鼠肺組織病理變化情況

空白組的小鼠支氣管結構正常，支氣管黏膜平整，無黏液腺增生及黏膜的基底膜增厚，管腔內(nèi)未見纖毛上皮剝離，平滑肌厚度均勻，未見炎性細胞浸潤;而CVA組可見黏膜上皮層中杯狀細胞增多，黏液腺增生，黏膜的基底膜增厚，黏膜下組織水腫;CVA再激發(fā)組見管壁平滑肌肥大，黏膜下及肥厚的肌層內(nèi)有嗜酸性粒細胞及單核細胞浸潤;在五虎湯各劑量組和地塞米松組小鼠肺組織損傷明顯減輕，炎癥細胞浸潤程度較CVA再激發(fā)組明顯減輕。見圖1。

空白組的上皮杯狀細胞產(chǎn)生和黏液分泌正常;CVA組PAS染色陽性細胞顯著增加;CVA再激發(fā)組PAS染色陽性細胞顯著增加;五虎湯各劑量組以及地塞米松組上皮杯狀細胞產(chǎn)生和黏液分泌明顯降低。見圖2。

2.3? 各組小鼠BALF中白細胞計數(shù)及嗜酸性粒細胞百分率比較

與空白組比較，CVA組白細胞計數(shù)顯著增加，嗜酸性粒細胞（eosinophilic， Eos）百分率明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與CVA組比較，CVA再激發(fā)組白細胞計數(shù)及Eos的百分率增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;五虎湯低、中、高組以及地塞米松組的白細胞計數(shù)及Eos的百分率均低于CVA再激發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;五虎湯各劑量組與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;五虎湯各劑量組間未呈現(xiàn)典型的量效關系，組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.4? 各組小鼠血清IL-4、IL-5、IL-23、IFN-？酌及IgE水平比較

與空白組比較，CVA組中的IL-4、IL-5、IL-23、IgE升高，IFN-γ明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與CVA組比較，CVA再激發(fā)組中的IL-4、IL-5、IL-23、IgE明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），IFN-γ稍有降低，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;五虎湯各劑量組以及地塞米松組中的IL-4、IL-5、IL-23、IgE均低于CVA再激發(fā)組，IFN-γ高于CVA再激發(fā)組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;五虎湯各劑量組與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;五虎湯各劑量組未呈現(xiàn)典型的量效關系，組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2.5? 各組小鼠記憶T細胞亞群檢測結果比較

CVA組記憶性T細胞所占比例與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與CVA組相比，CVA再激發(fā)組記憶性T細胞亞群明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與CVA再激發(fā)組比較，五虎湯各劑量組及地塞米松組記憶性T細胞所占比例均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;五虎湯各劑量組與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;五虎湯各劑量組未呈現(xiàn)典型的量效關系，組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表4。

3 討論

兒童CVA多由塵螨、冷空氣、霧霾等致敏因素引起，與免疫變態(tài)反應密切相關[11]。CVA患兒反復而又長期地與過敏物質接觸是導致纏綿難愈的重要原因[12]。免疫記憶是免疫系統(tǒng)“記憶”過去致敏原的能力，表現(xiàn)為再次接觸到與初次感染相同的致敏物質時，免疫系統(tǒng)的應答比初次應答更快速、強烈和持久[13]。免疫記憶主要由CD4+ Tm記憶T細胞來實現(xiàn)，有研究[14]表明，哮喘中經(jīng)過致敏的記憶T細胞可以存在氣道黏膜與淋巴中數(shù)年之久。當前，雖未見T細胞炎癥記憶在CVA中的報道，但很多專家認為CVA本質上屬于支氣管哮喘的早期階段，與哮喘存在類似的發(fā)病機制[15]，考慮CVA反復發(fā)作的特點，我們推測CVA的發(fā)生與T細胞的炎癥記憶有密切的關聯(lián)。

古方五虎湯為小兒治喘名方，出自朱丹溪所著的《幼科全書》，由炙麻黃、苦杏仁、生石膏、生甘草、細茶葉五味藥物組成，有清肺止咳的功效，是小兒肺系疾病的常用方劑[16]。朱丹溪《醫(yī)部全錄·小兒哮喘嗽門》謂此方為“發(fā)散之劑，一服神效”;萬全在《幼科發(fā)揮》中稱：“麻黃、杏仁、甘草各等分加生石膏、臘茶葉，名五虎，神效”。五虎湯善于平喘，以往的研究多集中在五虎湯治療以喘息為主的小兒肺炎、哮喘上[17]，近些年本課題組在臨床中發(fā)現(xiàn)，反復發(fā)作的CVA患兒，雖沒有喘息癥狀，但屬于哮喘的苗期，多數(shù)表現(xiàn)為痰熱閉肺證候，此類患兒應用五虎湯也取得了很好的療效，推測五虎湯可通過干預免疫記憶發(fā)揮對哮喘苗期的治療作用。本實驗通過OVA和氫氧化鋁激發(fā)致敏建立CVA小鼠模型，氣道反應性檢測與HE、PAS染色結果顯示造模成功。經(jīng)五虎湯治療后小鼠的氣道炎癥均有不同程度的緩解，BALF中細胞計數(shù)顯示白細胞計數(shù)及嗜酸性粒細胞百分率粒細胞百分率降低，說明在CVA病程中存在二次免疫應答更強烈的現(xiàn)象。記憶型T細胞所分泌的炎性因子是氣道炎癥的重要指標，T細胞所介導的炎癥記憶中是否存在炎性因子分泌的失衡，進一步檢測結果顯示，其中IL-4、IL-5由Th2細胞產(chǎn)生，可促進IgE產(chǎn)生，從而刺激嗜酸性粒細胞增殖、活化，進而分泌多種炎癥介質引起氣道慢性炎癥[18]。IFN-γ由Th1細胞產(chǎn)生，可抑制Th2細胞因子的產(chǎn)生、降低氣道高反應性以及減少肺內(nèi)嗜酸性粒細胞的浸潤[19]。有研究[20]表明，IL-17、IL-23之間具有緊密聯(lián)系，兩者可能共同參與了CVA的病理生理過程，CVA患兒血清IL-17、IL-23的水平均明顯增高，IL-23主要由樹突狀細胞、巨噬細胞分泌，可能通過促進記憶性 T淋巴細胞增殖。而IL-23/Th17軸在CVA的發(fā)生發(fā)展中也起著重要的作用[19]。本研究結果顯示，CVA再激發(fā)組較CVA組的IL-4、IL-5、IL-23、IgE水平上升，IFN-？酌水平下降，經(jīng)五虎湯治療后細胞因子的失衡緩解，提示CVA病程中的免疫記憶，可影響Th1/Th2與IL-23/Th17軸平衡，誘發(fā)更強烈的氣道炎癥，五虎湯可影響炎癥細胞因子緩解氣道炎癥。

當前對T細胞炎癥記憶的研究較少，具體產(chǎn)生機制并不清楚，但比較明確的是肺部的CD4+ Tm記憶T細胞在參與氣道的持續(xù)炎癥反應中起關鍵作用[22-23]。CD44+ 和CD62L-為CD4+記憶T細胞的表面標志物，課題組通過流式細胞術檢測肺部組織CD4+ Tm亞群，結果顯示，CVA組記憶性T細胞所占比例與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與CVA組相比，CVA再激發(fā)組記憶性T細胞亞群則明顯上升（P<0.05），經(jīng)五虎湯治療后記憶性T細胞所占比例均減低。由此推測，五虎湯緩解氣道炎癥的作用是通過影響記憶性T細胞的炎癥記憶發(fā)揮的作用。

綜上所述，本研究結果表明CVA病程中存在記憶性T細胞參與的炎癥記憶，使病情纏綿難愈，五虎湯能夠有效干預這種記憶改善CVA模型小鼠的氣道炎癥，發(fā)現(xiàn)一方面為五虎湯的臨床應用提供了有力的實驗依據(jù);另一方面為兒童CVA的研究提供了新的研究思路，下一步課題組將繼續(xù)開展相關的體內(nèi)、體外實驗，對炎癥記憶在CVA的作用機制作進一步研究。

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（本文編輯? 匡靜之 周? 旦）