王濤，王慶泊，岳浩洋，張貴東，苑昭獎(jiǎng)，連曉華，李恩君，劉博

胃癌（Gastric cancer，GC），是繼肺癌之后，死亡率最高的常見(jiàn)惡性腫瘤，已成為全世界主要的健康負(fù)擔(dān)。中國(guó)的胃癌發(fā)病例數(shù)每年近40萬(wàn)，約占全球的42.6%，死亡率高達(dá)45%，因此我國(guó)面臨著十分嚴(yán)峻的抗擊胃癌形勢(shì)。DNA甲基化是表觀遺傳途徑的基本調(diào)控方式，抑癌基因、DNA修復(fù)基因啟動(dòng)子的異常甲基化，會(huì)抑制基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致功能喪失，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，已有報(bào)道腫瘤抑制基因

APC

在多種腫瘤中高度甲基化的情況。地西他濱（Decitabine，DAC）是一種天然2′-脫氧胞苷酸的腺苷類(lèi)似物，通過(guò)抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，減少DNA的甲基化，為目前已知最強(qiáng)的DNA甲基化特異性抑制劑。地西他濱作為抗腫瘤新藥，在實(shí)體瘤中的作用報(bào)道較少。本研究以胃癌AGS細(xì)胞為研究對(duì)象，探究地西他濱對(duì)AGS細(xì)胞增殖和侵襲的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)HyClone公司；TRIzol試劑購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Invitrogen公司；基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)買(mǎi)于天根生化科技（北京）有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Advantage RT-for-PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（Premix Taq?Version 2.0）購(gòu)買(mǎi)于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；T-A克隆載體（pGEM-T載體系統(tǒng)）購(gòu)買(mǎi)于上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化試劑盒（EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits）購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)QIAGEN公司；APC一抗（兔來(lái)源）、二抗購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于碧云天；DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Transwell小室購(gòu)買(mǎi)于Chemicon公司；地西他濱（5-Aza-2′-deoxycytidine）購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胃癌細(xì)胞系培養(yǎng)

本研究時(shí)間為2017年10月至2018年12月。人胃黏膜細(xì)胞系GES-1、胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。AGS使用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，GES-1使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳，兩天換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 地西他濱（DAC）處理胃癌細(xì)胞

AGS細(xì)胞分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組在培養(yǎng)液中添加相應(yīng)體積的PBS緩沖液；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中添加10 μM的DAC，隔天棄掉舊培養(yǎng)基，添加新鮮的培養(yǎng)基和10μM的DAC，連續(xù)用DAC處理3 d，然后進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)探究。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞，使用胰酶消化吹散成細(xì)胞懸液，稀釋成5×10個(gè)/mL，然后取100μL細(xì)胞懸液（即0.5×10個(gè)細(xì)胞）鋪于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，更換分別含有5μM、10μM、25μM、50μM DAC的培養(yǎng)基100μL，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h。分別在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，于培養(yǎng)的細(xì)胞中加入20μL 5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后每孔細(xì)胞再加入150μL的二甲基亞砜，于搖床上輕輕搖晃10 min，再于酶標(biāo)儀下檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)下的吸光值。以增殖率為縱坐標(biāo)，處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制曲線，每組處理分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化基因組DNA

收集細(xì)胞，5 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，使用基因組DNA提取試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作提取基因組DNA，然后使用亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化修飾。

1.2.5 亞硫酸氫鹽測(cè)序

APC基因啟動(dòng)子亞硫酸氫鹽測(cè)序的擴(kuò)增引物見(jiàn)表1，該引物可擴(kuò)增出APC基因啟動(dòng)的部分序列，長(zhǎng)261bp，覆蓋21個(gè)CpG位點(diǎn)，序列如下：5-ACTGCCATCAACTTCCTTGCTTGCTGGGGACTGGG GCCGCGAGGGCATACCCCCGAGGGGTACGGGGCT AGGGCTAGGCAGGCTGTGCGGTTGGGCGGGGCCC TGTGCCCCACTGCGGAGTGCGGGTCGGGAAGCGG AGAGAGAAGCAGCTGTGTAATCCGCTGGATGCGG ACCAGGGCGCTCCCCATTCCCGTCGGGAGCCCGCC GATTGGCTGGGTGTGGGCGCACGTGACCGACATGTGGCTGTATTGGTGCAGCCCG-3′。

表1 亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化測(cè)序引物

PCR的擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，62℃30 s，72℃30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收，回收后的產(chǎn)物與pGEM-T質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，重組的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂氨芐平板，挑取10個(gè)菌落進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)（qRT-PCR）

使用TRIzol提取處理后的細(xì)胞總RNA，然后使用TaKaRa的RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用

β-actin

作為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增分析，每組包含3個(gè)重復(fù)。相關(guān)引物信息見(jiàn)表2。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，56℃20 s，72℃20 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。根據(jù)擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)Ct值，使用相對(duì)定量2法來(lái)對(duì)比相關(guān)基因mRNA的表達(dá)情況。

表2 qRT-PCR引物

1.2.7 Western blot

收集細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)定量，使用總量40μg的蛋白質(zhì)進(jìn)行常規(guī)的電泳，半干法將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%的牛血清白蛋白溶液封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜2 h，TBST緩沖液漂洗3次，然后敷育一抗，一抗的稀釋比例為1∶1 000，4℃搖床過(guò)夜。TBST充分漂洗PVDF膜3次，然后加入熒光標(biāo)記的二抗孵育，避光37℃搖床2 h。再經(jīng)TBST漂洗3次后，于BIO-RAD的凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行掃描成像分析。

1.2.8 錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)分析

經(jīng)10μM DAC處理72 h后的AGS細(xì)胞，用胰酶消化吹散成細(xì)胞懸液，取1 mL細(xì)胞懸液（包含2×10個(gè)細(xì)胞）與1 mL 1%瓊脂糖溶液混合，鋪于6孔板中，每周覆蓋新鮮的軟瓊脂培養(yǎng)液，培養(yǎng)4周，然后觀察細(xì)胞的克隆情況，并拍照進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.2.9 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分析

將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，在上室中加入300μL無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，棄去培養(yǎng)基。然后將經(jīng)過(guò)不同濃度DAC處理后的AGS細(xì)胞（1×10個(gè)細(xì)胞）重懸于100μL無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，然后加入小室的上室，下室則加入200μL含10%FBS的DMEN/F12培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24 h。之后取出上室，用棉簽刮去上室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，再用甲醇固定侵襲的細(xì)胞，使用蘇木素染色，然后使用倒置顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。隨機(jī)選擇3個(gè)視野，對(duì)通過(guò)基質(zhì)層侵襲進(jìn)入的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每次測(cè)定重復(fù)三次。

2 結(jié)果

2.1 地西他濱對(duì)胃癌AGS細(xì)胞活力的影響

首先為了驗(yàn)證去甲基化藥物地西他濱（DAC）對(duì)于胃癌AGS細(xì)胞的活力是否有影響，以及為了篩選合適的藥物處理濃度和處理時(shí)間，我們分別使用5μM、10μM、25 μM和50μM的DAC處理AGS細(xì)胞，并于24 h、48 h、72 h和96 h后使用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DAC對(duì)于胃癌AGS細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性（圖1）。當(dāng)使用10μM的DAC處理72 h后，AGS細(xì)胞的活力仍在60%以上（63.2%），而當(dāng)使用更高的濃度或者更長(zhǎng)的時(shí)間處理時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力的影響比較大，且細(xì)胞形態(tài)也不好。所以，我們選擇10μM、72 h作為DAC處理AGS細(xì)胞的基本條件。

圖1 不同濃度和處理時(shí)間的地西他濱對(duì)AGS細(xì)胞活力的影響

2.2 地西他濱對(duì)APC基因啟動(dòng)子甲基化的影響

亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化測(cè)序法是目前檢測(cè)DNA甲基化最經(jīng)典的方法，首先，我們檢測(cè)了胃癌AGS細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)

APC

基因啟動(dòng)子高度甲基化（（85.7±5.4）%）。作為對(duì)比，我們也檢測(cè)了胃黏膜細(xì)胞系GES-1的情況，其

APC

基因啟動(dòng)子無(wú)甲基化（0%）。然后AGS細(xì)胞經(jīng)10 μMDAC處理72 h后，

APC

基因啟動(dòng)子的甲基化程度降低（（33.3±2.5）%）（

n

=20，

t

=13.051，

P

＜0.001）。以上結(jié)果表明，在胃癌AGS細(xì)胞中，

APC

基因啟動(dòng)子高度甲基化，而DAC有良好的去甲基化作用。

2.3 地西他濱對(duì)APC基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

我們檢測(cè)了AGS細(xì)胞經(jīng)DAC處理后

，APC

基因mRNA的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)5μM、10 μM、25μM、50μMDAC處理72 h后，

APC

基因mRNA的表達(dá)量分別增加了（2.3±0.1）倍（n=15，

P

＜0.001）、（3.6±0.2）倍（n=15，

P

＜0.001）、（4.1±0.1）倍（n=15，

P

＜0.001）和（3.9±0.2）倍（n=15，

P

＜0.001），與未經(jīng)處理的AGS組對(duì)比，表達(dá)水平均升高。蛋白質(zhì)的表達(dá)情況與mRNA大致相同，經(jīng)DAC處理后，APC蛋白的表達(dá)提高（圖2）。以上結(jié)果表明，AGS細(xì)胞中

APC

基因的表達(dá)被抑制了，而DAC可以恢復(fù)

APC

基因的表達(dá)。

圖2 地西他濱對(duì)AGS細(xì)胞中APC蛋白表達(dá)的影響

2.4 地西他濱對(duì)AGS細(xì)胞增殖和侵襲的影響

APC

基因表達(dá)的缺失會(huì)引起一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞分裂的加速。為了研究

APC

基因去甲基化重新表達(dá)后對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，我們進(jìn)行了細(xì)胞錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)分析和Transwell細(xì)胞侵襲分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在軟瓊脂中，AGS細(xì)胞能形成大量的細(xì)胞克隆，且克隆簇大而清晰，說(shuō)明AGS細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下增殖良好（圖3）。而經(jīng)過(guò)10μMDAC處理72 h后，AGS在軟瓊脂中并無(wú)明顯克隆簇形成，細(xì)胞克隆數(shù)顯著下降（圖3，

n

=6，

t

=13.404，

P

＜0.001）。Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AGS細(xì)胞侵襲的最多，大約（290.3±5.7）個(gè)細(xì)胞，經(jīng)5μM、10μM、25μM、50μM DAC處理72 h后的細(xì)胞侵 襲 數(shù) 分 別 為（213.2±6.7）個(gè)（n=15，

P

＜0.001）、（160.4±7.3）個(gè)（

n

=15，

P

＜0.001）、（145.8±6.2）個(gè)（n=15，

P

＜0.001）和（119.2±8.6）個(gè)（n=15，

P

＜0.001），與AGS組比較，侵襲能力均逐漸下降。以上結(jié)果表明經(jīng)過(guò)DAC處理后，AGS細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低。

圖3 細(xì)胞侵襲能力分析：A為AGS細(xì)胞；B為10μMDAC處理后的AGS細(xì)胞

3 討論

胃癌是亞洲常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分別位列全球第5和第6位，且近幾年來(lái)隨著現(xiàn)代生活的發(fā)展，受不良生活習(xí)慣及環(huán)境污染的影響，胃癌出現(xiàn)了年輕化的趨勢(shì)。通常胃癌的預(yù)后不佳，平均五年生存率低于20%，因?yàn)槲赴┑拇_診往往已經(jīng)到了晚期，早期胃癌沒(méi)有明顯癥狀。因此，我國(guó)胃癌防治任重道遠(yuǎn)。

APC

基因?yàn)槟[瘤抑制基因，位于染色體的5q21，其編碼的腫瘤抑制蛋白為Wnt信號(hào)通路的拮抗劑，同時(shí)還涉及其他的生理過(guò)程，包括細(xì)胞遷移和粘附、轉(zhuǎn)錄激活和凋亡，該基因的缺陷會(huì)導(dǎo)致家族性腺瘤性息肉病（FAP），這是一種常染色體顯性的惡性疾病，通常會(huì)發(fā)展為惡性腫瘤。

APC

基因與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有報(bào)道85%的結(jié)腸癌中存在

APC

基因缺失或失活的情況。除了基因突變，DNA異常甲基化也會(huì)影響基因的表達(dá)。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的基本修飾方式，近年來(lái)也成為腫瘤研究的焦點(diǎn)，DNA甲基化程度和模式的改變是腫瘤發(fā)生和發(fā)展一個(gè)重要因素。在肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌中，

APC

基因存在過(guò)甲基化的情況，在消化道腫瘤當(dāng)中，

APC

基因是失活的抑癌基因之一。在本研究中，我們通過(guò)亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化測(cè)序法，觀察到胃癌AGS細(xì)胞系中，

APC

基因啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)胞嘧啶存在異常高度甲基化的情況，而作為對(duì)比，正常的胃黏膜細(xì)胞系GES-1中則不存在甲基化。

APC

基因啟動(dòng)子甲基化之后，mRNA和蛋白表達(dá)減少，功能失活，可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲等相關(guān)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是DNA甲基化過(guò)程中的關(guān)鍵因素，地西他濱作為去甲基化藥物，可以被整合到復(fù)制的DNA中并與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)形成不可逆的共價(jià)鍵，從而抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，達(dá)到去甲基化的作用，重新活化DNA。已有研究表明，地西他濱在多種血液疾病中具有良好的療效，包括骨髓增生異常綜合征（MDS）、急性髓性白血?。ˋML）、慢性髓性白血?。–ML）和鐮狀細(xì)胞性貧血等，而對(duì)于實(shí)體瘤的療效還需進(jìn)一步研究。在本研究中，我們觀察到地西他濱對(duì)于胃癌AGS細(xì)胞活力也有抑制作用，且地西他濱濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越明顯。亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化測(cè)序?qū)嶒?yàn)也表明，地西他濱可以去除AGS細(xì)胞中

APC

基因啟動(dòng)子上的甲基化，隨后的qRT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)也表明，地西他濱可以恢復(fù)

APC

基因的表達(dá)。細(xì)胞錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)可觀察腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲情況，在軟瓊脂糖中培養(yǎng)的懸浮狀態(tài)下，AGS細(xì)胞依舊可以很好地生長(zhǎng)增殖及侵襲，形成多克隆簇，而經(jīng)地西他濱處理后的AGS細(xì)胞增殖能力減弱，Transwell實(shí)驗(yàn)也表明經(jīng)地西他濱處理后的AGS細(xì)胞侵襲能力減弱。由此表明地西他濱可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其機(jī)制可能為通過(guò)逆轉(zhuǎn)

APC

基因的甲基化。綜上，胃癌AGS細(xì)胞中存在異常高程度的

APC

基因啟動(dòng)子甲基化，導(dǎo)致基因失活，這對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲具有重要意義。地西他濱具有抑制AGS細(xì)胞增殖和侵襲的能力，其機(jī)制可能與逆轉(zhuǎn)

APC

基因啟動(dòng)子的甲基化、恢復(fù)

APC

基因的表達(dá)相關(guān)。本研究探討了地西他濱對(duì)于胃癌細(xì)胞的影響，并初步闡明了地西他濱抑制胃癌AGS細(xì)胞的作用機(jī)制，可對(duì)地西他濱用于胃癌治療提供一定的理論依據(jù)。