廖梅

藥用紫草是我國傳統(tǒng)中藥，研究應(yīng)用廣泛，主要指新疆紫草

Arnebia euchroma

（Royle）Johnst（AE）、內(nèi)蒙古紫草

Arnebia guttata

Bunge（AG）及紫草

Lithospermumerythrorhizon

Sieb.et Zucc（LE）的干燥根。實踐證明，紫草及其復(fù)方制劑可用于治療子宮絨毛膜上皮癌、胃癌、食道癌等疾病。作為紫草的主要有效成分，紫草素及其衍生物對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（A549）顯示較好體內(nèi)和體外抑制活性，其抗腫瘤作用機制可能與抑制細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、上調(diào)p53基因（p53）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白（Bax）、裂解半胱天冬酶-9（cleaved-caspase-9）、裂 解 半 胱 天 冬 酶-9（cleaved-caspase-3）和下調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）的表達，激活細(xì)胞線粒體凋亡途徑，誘使受體相互作用蛋白激酶1（RIP1）和受體相互作用蛋白激酶3（RIP3）的增高導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死等途徑有關(guān)。本研究前期采用MTT法評價，結(jié)果顯示紫草甲醇提取物對A549表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞增殖抑制活性，其抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，某些產(chǎn)地樣品的半數(shù)抑制濃度（IC值）與陽性藥紫杉醇相當(dāng)。

近年來，LC-MS/MS將液相色譜特別是超高效液相色譜與高靈敏度的質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，能夠獲得豐富的結(jié)構(gòu)信息，從而建立快速、高效的分析方法。UHPLC-QTRAP-MS/MS（MRM）特征輪廓譜是在LC-MS/MS技術(shù)基礎(chǔ)上建立的能全面、特異性識別、表征和定量某一類結(jié)構(gòu)性質(zhì)相關(guān)化學(xué)成分的特殊指紋圖譜。由于MRM功能的高選擇性和靈敏性，根據(jù)樣品中每個MRM離子對表征的色譜峰面積可用于相對定量，在獲得單體化合物的標(biāo)準(zhǔn)品后可進行絕對定量?；赨HPLC-QTRAP-MS/MS（MRM）技術(shù)的紫草素類成分特征輪廓譜在定量的同時能實現(xiàn)化合物的定性需要，有效解決了大量譜效關(guān)系研究只篩選活性色譜峰而對其結(jié)構(gòu)不明的問題。紫草素成分復(fù)雜，結(jié)構(gòu)多樣，主要成分和微量成分的含量懸殊、分離純化困難，致使紫草素類成分與其抗腫瘤藥效關(guān)系仍不明確，影響其內(nèi)在質(zhì)量評價體系的建立。因此，筆者首先采用UHPLCQTRAP-MS/MS（MRM）特征輪廓譜技術(shù)建立不同產(chǎn)地紫草提取物的指紋圖譜，采用MTT法測定紫草甲醇提取物對A549細(xì)胞的抑制率作為藥效指標(biāo)，然后通過偏最小二乘回歸法（PLSR）分析辨識與抗腫瘤活性具有重要影響的特征峰，最后對部分化合物進行活性驗證，為闡明藥用紫草的抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

QTRAP4000質(zhì)譜儀配備ESI離子源及Analyst 1.6.3，Peak View1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國AB SCIEX公司），配備LC20ADXR高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；MS103DU電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Rt2100C型酶標(biāo)檢測儀（深圳Rayto公司）。

1.2 試藥

色譜純甲醇、乙腈（美國Fisher公司）；分析純98%甲酸和甲酸銨（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；雙氯芬酸鉀（中國食品藥品檢定研究院，批號100880）；紫杉醇（Sigma公司，批號T1912）；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone，批號SH30809.01B）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號141215）；胰酶（AMRESCO Inc，批號0457）；MTT（AMRESCOInc，批號0793）；DMSO（AMRESCOInc，批號0231）。

藥用紫草飲片購買自安徽省亳州市百姓平價藥業(yè)有限責(zé)任公司，由嘉應(yīng)學(xué)院張聲源副教授鑒定，樣品信息見表1。

表1 紫草樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 藥用紫草UHPLC-QTRAP-MS/MS（MRM）特征輪廓譜的建立

2.1.1 內(nèi)標(biāo)物溶液的制備

精密稱取雙氯芬酸鉀10 mg，加甲醇配成1 mg/mL的儲備液，吸取該溶液適量，甲醇稀釋至1μg/mL，作為內(nèi)標(biāo)物溶液，4°C下密封保存?zhèn)溆谩?p>2.1.2 供試品溶液的制備

各紫草樣品經(jīng)適當(dāng)粉碎后過40目篩，稱取1 g粉末，每個樣品重復(fù)制備3份。加20 mL甲醇搖勻，室溫超聲提取30 min，放冷至室溫，過濾要濾液；濾渣加10 mL甲醇重復(fù)提取2次，合并3次提取液。吸取提取液1 mL，10 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL適量，甲醇稀釋10倍，即為供試品溶液。分別取各供試品溶液1 mL，渦旋混合2 min，即為質(zhì)控樣品（QC）溶液。進樣前，精密吸取供試品溶液200μL，內(nèi)標(biāo)物溶液20μL，小心吹打混勻，進樣分析。

2.1.3 分析條件

色譜柱為Welch Ultimate XB-C（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；5 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.01%甲酸）為A相，乙腈為B相；洗脫條件為：0～0.1 min，20%B；0.1～10.0 min，20%～50%B；10.0～30.0 min，50%～60%B；30.0～35.0 min，60%～95%B；35.0～40.0 min，95%B；40.0～40.1 min，95%～20%B；40.1～45.0 min，20%B；柱溫40℃；進樣器溫度4℃；流速0.3 mL/min；進樣量10μL。

ESI離子源，負(fù)離子電離模式。質(zhì)譜參數(shù)為：CUR：30 psi，GS1：50 psi，GS2：50 psi，ISVF：-4.5 kV，TEM：500℃，DP：-60 V，CE：-30 eV，CES：15 v，MRM模式。

2.1.4 特征輪廓譜的建立

將22批紫草飲片按“2.1.2”項制得供試品溶液，按照“2.1.3”項下的測定條件進樣測定，并記錄各批次樣品色譜數(shù)據(jù)。為了考察儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性和色譜峰的重現(xiàn)性，參考文獻方法設(shè)置QC進樣順序，采用MarkerView1.2.1軟件提取色譜峰數(shù)據(jù)。以雙氯芬酸鉀內(nèi)標(biāo)峰為參照執(zhí)行保留時間（RT）校正和峰面積歸一化命令，最終相對定量57個特征峰（表2）。結(jié)果顯示各QC樣品中各特征峰的相對峰面積和RT值的RSD值分別在3.1%～8.6%和0.1%～2.5%。說明系統(tǒng)重現(xiàn)性良好，測定變量的差異是由樣品本身的差異引起。

表2 22批紫草提取物中特征峰的相對峰面積

續(xù)表2 22批紫草提取物中特征峰的相對峰面積

續(xù)表2 22批紫草提取物中特征峰的相對峰面積

續(xù)表2 22批紫草提取物中特征峰的相對峰面積

2.2 紫草體外抗腫瘤藥效學(xué)實驗

2.2.1 樣品溶液的制備

分別取“2.1.2”項下的供試品溶液適量，10 000 r/min離心10 min，精密吸取上清液4 mL，氮氣吹干甲醇，加0.5 mL DMSO溶解配成工作儲備液，培養(yǎng)基稀釋1 000倍后配成生藥濃度為0.2 mg/mL的含藥培養(yǎng)基即為樣品溶液。最后取100μL含藥培養(yǎng)基加入100μL細(xì)胞液中，每個樣品設(shè)6個復(fù)孔。

2.2.2 抗腫瘤活性的測定

取對數(shù)生長期A549細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×10個/mL的單細(xì)胞懸液，參考文獻測定各樣品的細(xì)胞抑制率（見表3）。結(jié)果顯示，在等生藥量濃度條件下，22批樣品的抑制率在0.182～0.989，可見不同來源紫草甲醇提取物對A549細(xì)胞的抑制作用存在較大差異，原因可能是不同紫草中所含紫草素類化合物含量存在差異，這種顯著性差異為譜效關(guān)系研究提供了良好的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

表3 22批藥用紫草提取物的細(xì)胞抑制率（n=6）/±s

2.3 譜效關(guān)系辨識結(jié)果分析

PLSR集成了典型相關(guān)分析、主成分分析和多元線性回歸分析的基本功能，可以最大限度地利用數(shù)據(jù)信息，預(yù)測精度高，主要用于多因變量對多自變量的回歸建模，能較好地解決樣本量少于變量的問題，是一種模型擬合度好和預(yù)測能力強的數(shù)據(jù)處理方法，在譜效關(guān)系研究中被廣泛采用。本研究分別將22批次紫草的57個特征峰的相對峰面積作為自變量X，將A549細(xì)胞的抑制率作為因變量Y導(dǎo)入SIMCA-14.1軟件，采用PLSR模型將數(shù)據(jù)X和Y進行回歸分析，計算得到57個特征峰與抑制率的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)和變量投影重要性系數(shù)（VIP）值，見表4。VIP＞1時，自變量在解釋因變量時差異有重要意義。由圖2可知，VIP均大于1且由大到小的順序為峰59、9、66、32、62、45、46、58、43、71、13、63、41、44、5、39、34、65、49、21、12、3、22和60，說明其對應(yīng)的物質(zhì)對A549細(xì)胞的抑制作用有重要影響。經(jīng)過與對照品比對及質(zhì)譜分析鑒定，確定了各峰代表的化合物（見表5）。

表4 各化合物對藥效的變量投影重要性系數(shù)（VIP）值

表5 經(jīng)偏最小二乘回歸（PLSR）譜效關(guān)系辨識的化合物

2.4 體外抗腫瘤驗證試驗

對于有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物，筆者采用MTT法驗證其對A549細(xì)胞的體外抑制活性，以紫杉醇為陽性對照。分別稱取各化合物適量，加DMSO溶解配成100 mmol/L的儲備液，臨用前培養(yǎng)基稀釋成0、0.1、0.5、1、5、10、25、50μmol/L的含藥培養(yǎng)基，最后取100μL含藥培養(yǎng)基加入100μL細(xì)胞液中，每個樣品設(shè)6個復(fù)孔。按“2.2.2”項下方法操作并計算化合物的IC值，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示各化合物的IC值在0.74～22.60μmol/L之間，其細(xì)胞抑制率隨著濃度升高而增強，可能是紫草發(fā)揮體外抗腫瘤作用的重要成分。

表6 化合物的體外抗腫瘤活性

3 討論

紫草中的紫草素類成分同分異構(gòu)體多樣，由于幾個主要成分的干擾，其他微量成分根本無法在常規(guī)的紫外檢測器上顯示，色譜分離分析困難，目前關(guān)于如何有效建立紫草中的紫草素類成分指紋圖譜還未見文獻報導(dǎo)。本實驗采用UHPLC-QTRAPMS/MS（MRM）技術(shù)建立的紫草特征輪廓譜能同時對化合物進行定量和定性分析，有助于后期譜效關(guān)系研究對化合物的指認(rèn)和鑒定。

目前，中藥譜效關(guān)系研究中多采用1個指標(biāo)，或者將幾個藥效指標(biāo)同時評價起到相互補充、相互佐證的作用，但有時卻會因幾個藥效指標(biāo)同時評價得到相互矛盾的結(jié)果。因此，選擇有針對性、能代表藥物主要作用的指標(biāo)至關(guān)重要。紫草素及其衍生物對A549細(xì)胞的抗腫瘤作用已有多篇文獻報導(dǎo)，藥效確切。課題組進一步通過MTT法確證了藥用紫草甲醇提取物也具有相當(dāng)強的抗A549細(xì)胞活性；在相同生藥劑量時，不同來源紫草藥材對細(xì)胞的抑制率不同；相同來源的藥材其抑制率呈劑量依賴性。因此選擇對紫草提取物反應(yīng)靈敏的A549細(xì)胞抑制率作為藥效指標(biāo)對于評價紫草體外抗腫瘤活性是可行的。

目前譜效關(guān)系研究的數(shù)據(jù)處理方法眾多，具有各自的優(yōu)勢和應(yīng)用范圍。本研究采用PLSR法分析了紫草藥材樣品特征峰與其抗腫瘤作用的相關(guān)性。結(jié)果辨識出24種紫草素類成分與其抗腫瘤作用呈正相關(guān)，說明紫草的抗腫瘤效應(yīng)是多種成分共同作用的結(jié)果。活性驗證結(jié)果顯示紫草呋喃A（5）、紫草素（9）、紫草呋喃E（21）、乙酰紫草素（32）、去氧紫草素（46）、異丁酰紫草素（58）、β，β-二甲基丙烯酰紫草素（65）和α-甲基丁酰紫草素（66）均對A549細(xì)胞有一定抑制作用，其IC值為0.74-22.60μmol/L，在一定程度上驗證了上述譜效關(guān)系研究結(jié)果。由于分離純化工作仍在進行，對于辨識出的其他化合物是否具有確切的藥效還有待課題組進一步深入探討。

綜上所述，本研究通過藥用紫草的譜效關(guān)系初步明確了與其抗腫瘤活性相關(guān)的物質(zhì)，為紫草后續(xù)研究和開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。