關(guān)元宙，梁毅

（中國(guó)藥科大學(xué)國(guó)際醫(yī)藥商學(xué)院，南京 211198）

原料藥的生產(chǎn)、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過(guò)程中可能引入雜質(zhì)，這不僅影響藥物純度，還可能引起藥物不良反應(yīng)，其中基因毒性雜質(zhì)能以較低水平濃度導(dǎo)致體內(nèi)DNA受損突變，進(jìn)而引發(fā)癌癥，對(duì)患者用藥安全危害大。經(jīng)過(guò)十幾年的發(fā)展，藥品監(jiān)管部門(mén)及醫(yī)藥行業(yè)對(duì)藥品中基因毒性雜質(zhì)的性質(zhì)、清除及控制均有了新的認(rèn)知，各國(guó)藥品監(jiān)管部門(mén)通報(bào)的基因毒性雜質(zhì)相關(guān)藥品召回事件也引起了工業(yè)界及大眾對(duì)這類雜質(zhì)的關(guān)注。基于現(xiàn)行ICH 指導(dǎo)原則與行業(yè)實(shí)施現(xiàn)狀，本文綜合基因毒性雜質(zhì)特點(diǎn)、分類控制原則、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法、原料藥生產(chǎn)工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面闡述這類雜質(zhì)的控制策略。

1 原料藥中的基因毒性雜質(zhì)

原料藥合成過(guò)程中使用到多種起始物料、試劑及溶劑，反應(yīng)過(guò)程中還存在副反應(yīng)及中間體殘留，原料藥分子在運(yùn)輸儲(chǔ)存過(guò)程中還受時(shí)間、光照、溫度、pH 值、水、輔料及直接接觸包材的影響而發(fā)生降解，以上情況均有可能向原料藥體系引入潛在基因毒性雜質(zhì)，見(jiàn)圖1。在原料藥雜質(zhì)譜建立過(guò)程中，通常需要對(duì)合成路線中原料、中間體、副產(chǎn)物及后續(xù)降解產(chǎn)物進(jìn)行基因毒性分析。常用鑒定雜質(zhì)具有基因毒性的方法：首先篩選雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，確認(rèn)存在已知基因毒性雜質(zhì)相似致突變官能團(tuán)或經(jīng)計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)毒理學(xué)評(píng)估程序判定具有基因毒性結(jié)構(gòu)的，再經(jīng)基因毒性檢測(cè)（如Ames 測(cè)試）得到陽(yáng)性結(jié)果，有時(shí)輔以體內(nèi)檢測(cè)最終確認(rèn)雜質(zhì)基因毒性[1]。

圖1 原料藥中基因毒性雜質(zhì)引入途徑Fig.1 Approaches in genotoxic impurities introducing to drug substances

2 潛在基因毒性化合物相關(guān)反應(yīng)

常見(jiàn)的基因毒性物質(zhì)具有相似的某幾類官能團(tuán)，這些官能團(tuán)常作為警示結(jié)構(gòu)預(yù)估雜質(zhì)是否具有基因毒性。具有警示結(jié)構(gòu)的物質(zhì)常作為反應(yīng)物質(zhì)或反應(yīng)介質(zhì)參與原料藥的合成，本文歸納了常見(jiàn)警示結(jié)構(gòu)化合物在原料藥合成過(guò)程中為體系引入基因毒性雜質(zhì)的相關(guān)反應(yīng)，見(jiàn)表1。

表1 警示結(jié)構(gòu)化合物為原料藥引入基因毒性雜質(zhì)相關(guān)反應(yīng)Tab.1 Structural alerts relevant reactions of genotoxic impurities introducing to drug substances

3 基因毒性雜質(zhì)分類控制原則及限度要求

3.1 危害性評(píng)估

根據(jù)雜質(zhì)的致癌性、基因毒性以及原料藥基因毒性，可將雜質(zhì)分為5 類（表2）[2]，并給予不同的控制要求（圖2）。當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)雜質(zhì)具有致癌性或基因毒性時(shí)，首先考慮清除或避免引入該雜質(zhì)，實(shí)際不可行時(shí)則采用可接受標(biāo)準(zhǔn)控制雜質(zhì)含量，常用有允許日暴露量（Permissible Daily Exposures，PDE）及毒性學(xué)關(guān)注閾值（Threshold of Concern，TTC）兩種可接受限度計(jì)算方法[2]，具體使用見(jiàn)3.2 節(jié)。對(duì)于無(wú)警示結(jié)構(gòu)或警示結(jié)構(gòu)與無(wú)基因毒性原料藥一致的雜質(zhì)，則可按照無(wú)基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行控制。若已知原料藥具有基因毒性，且雜質(zhì)具有警示結(jié)構(gòu)或確認(rèn)基因毒性，則可忽略該雜質(zhì)帶來(lái)的致癌風(fēng)險(xiǎn)，也將其列為非基因毒性雜質(zhì)控制。

表2 基于致癌性及基因毒性歸類的5 類雜質(zhì)Tab.2 5 tier of impurities classified by carcinogenicity and genotoxicity

圖2 原料藥中基因毒性雜質(zhì)分類控制路徑圖Fig.2 Control strategies for classified genotoxic impurities in drug substances

3.2 風(fēng)險(xiǎn)表征

1～3 類具有基因毒性的雜質(zhì)根據(jù)可接受攝入量的風(fēng)險(xiǎn)表征原則設(shè)計(jì)原料藥中雜質(zhì)可接受限度?？山邮軘z入量是指一個(gè)特定的雜質(zhì)攝入水平，該水平下攝入雜質(zhì)所增加的致癌風(fēng)險(xiǎn)可忽略不計(jì)或低于疾病威脅，若已知雜質(zhì)的致癌閾值（如1 類雜質(zhì)及某些3類雜質(zhì)），可依照該閾值設(shè)置PDE，并根據(jù)相關(guān)治療周期進(jìn)行調(diào)整。若沒(méi)有足夠的致癌性數(shù)據(jù)支持雜質(zhì)限度的設(shè)定，則需要采用保守的致癌性估算方法，即TTC 控制。TTC，指未知致癌或其他毒性作用風(fēng)險(xiǎn)的化學(xué)物質(zhì)的可接受攝入量，其以化學(xué)物質(zhì)作用于最敏感物種及最敏感部位能產(chǎn)生50%腫瘤發(fā)生率的濃度（TD50）作為計(jì)算基準(zhǔn)，線性外推至腫瘤發(fā)生率百萬(wàn)分之一處而得，在藥物研發(fā)后期還可將TTC 提高到產(chǎn)生十萬(wàn)分之一腫瘤發(fā)生率的濃度，即1.5 μg/d的限度[3]。若藥物的暴露短于終生時(shí)，滿足雜質(zhì)累計(jì)攝入總量不變的前提下還可以放寬其可接受日攝入量，參考表3。

表3 基于TTC 原則及治療周期的單個(gè)基因毒性雜質(zhì)可接受日攝入量Tab.3 Acceptable daily intake of single genotoxic impurity based on TTC approach and treatment period

4 原料藥中基因毒性雜質(zhì)控制措施

對(duì)于基因毒性雜質(zhì)，總體控制思路是：“避免-清除-控制”[4]，即設(shè)計(jì)合成路線時(shí)避開(kāi)選用基因毒性物料，調(diào)整工藝參數(shù)及增加純化手段清除基因毒性雜質(zhì)，最后開(kāi)發(fā)安全的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及靈敏準(zhǔn)確的分析方法以控制殘留的基因毒性雜質(zhì)[5]。根據(jù)基因毒性雜質(zhì)的特性及引入的工藝位置，確定合適的控制手段，詳見(jiàn)圖3。

圖3 原料藥中基因毒性雜質(zhì)控制流程圖Fig.3 Scheme of genotoxic impurities controlling in drug substance

4.1 生產(chǎn)工藝優(yōu)化

4.1.1 合成路線設(shè)計(jì)

控制原料藥中基因毒性雜質(zhì)的危害首選措施是避免選用具有基因毒性的原料及試劑，同時(shí)選擇無(wú)基因毒性雜質(zhì)生產(chǎn)的合成路線。原料藥合成過(guò)程中常用到磷酸酯、鹵代烷烴、烷基磺酸酯、環(huán)氧化合物、偶氮、醛類與芳香胺等基因毒性化合物[6-7]，其中烷基磺酸酯類及鹵代烷烴類化合物還可通過(guò)多種副反應(yīng)生成其他基因毒性雜質(zhì)，所以應(yīng)盡可能選擇其他化合物代替反應(yīng)。ICH Q3 規(guī)定的1 類溶劑（如：苯、四氯化碳、二氯乙烷）及2 類溶劑（如：氯仿、四氫化萘、己烷、乙二醇）存在致癌風(fēng)險(xiǎn)[8]，可按照Q3 指導(dǎo)原則規(guī)定的控制方法避免使用或降低至可接受標(biāo)準(zhǔn)以下。

4.1.2 工藝參數(shù)調(diào)整

然而許多實(shí)際情況導(dǎo)致無(wú)法避免基因毒性雜質(zhì)的引入，一些原料的基因毒性警示結(jié)構(gòu)恰好是合成步驟的活性基團(tuán)，而在研發(fā)后期商業(yè)化放大后變更合成路線也不現(xiàn)實(shí)，這時(shí)則需要優(yōu)化工藝參數(shù)以減少基因毒性雜質(zhì)的含量。通過(guò)適當(dāng)調(diào)整工藝中反應(yīng)pH值、溫度、時(shí)長(zhǎng)及反應(yīng)溶劑的比例等參數(shù)，可以改變基因毒性副產(chǎn)物生成反應(yīng)的反應(yīng)程度，達(dá)到去除基因毒性雜質(zhì)的效果。如：磺酸酯具有基因毒性，藥物Tasaglitazar[9]生產(chǎn)工藝中使用了芳香類二甲磺酸酯進(jìn)行醚生成反應(yīng)，這一步驟向反應(yīng)體系引入了基因毒性雜質(zhì)。若將反應(yīng)pH 值調(diào)整為7 并增加回流時(shí)間至8 小時(shí)，則促進(jìn)該基因毒性試劑反應(yīng)完全，反應(yīng)后期向體系引入水可加速磺酸酯的降解，最終降低雜質(zhì)殘 留。

4.1.3 原料藥粗品純化

原料藥生產(chǎn)工藝過(guò)程中的回流、萃取、活性炭吸附及重結(jié)晶等操作本身就具備去除基因毒性雜質(zhì)的功能，可以根據(jù)雜質(zhì)及原料藥物理化學(xué)性質(zhì)的差異調(diào)整參數(shù)以清除效率，還可以借助膜過(guò)濾、超臨界流體萃取及分子印跡吸附等技術(shù)進(jìn)一步純化原料藥[10]。

4.2 質(zhì)量控制完善

4.2.1 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定

基于對(duì)當(dāng)前原料藥整體特性、生產(chǎn)工藝及物料屬性的理解，分析各流程為終產(chǎn)品引入基因毒性雜質(zhì)的可能性及程度，為雜質(zhì)檢測(cè)部分增加合理的基因毒性雜質(zhì)限度及開(kāi)發(fā)適當(dāng)?shù)姆治龇椒╗11-12]。如果明確存在前述1～3 類基因毒性雜質(zhì)，應(yīng)構(gòu)建專門(mén)的控制策略。在連續(xù)6 批中試規(guī)?；? 批商業(yè)規(guī)模的原料藥中基因毒性雜質(zhì)檢出量低于限度30%的，可將基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)列為周期性檢驗(yàn)項(xiàng)目而不進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)[2]。

4.2.2 原料及過(guò)程控制

結(jié)合起始物料生產(chǎn)工藝及原料藥合成路線中雜質(zhì)的去向，將起始物料、試劑及中間產(chǎn)物中基因毒性雜質(zhì)含量控制在原料藥限度下，或設(shè)置過(guò)程控制項(xiàng)目以保證最終產(chǎn)品質(zhì)量。根據(jù)基因毒性雜質(zhì)引入步驟在工藝中的位置并結(jié)合雜質(zhì)的反應(yīng)活性、溶解度、解離度及揮發(fā)性確定其清除因子，若能合理解釋工藝本身對(duì)雜質(zhì)的清除作用，且能明確雜質(zhì)最終含量低于可接受標(biāo)準(zhǔn)，可不對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制[2]。

5 應(yīng)用

根據(jù)上述原料藥基因毒性雜質(zhì)清除及控制的原理，可對(duì)符合歐洲標(biāo)準(zhǔn)10.0 版的抗敏感類藥物活性成分鹽酸西替利嗪的合成路線及生產(chǎn)工藝過(guò)程中可能引入的基因毒性雜質(zhì)的位置及類型進(jìn)行分析，并根據(jù)基因毒性雜質(zhì)特性提出相應(yīng)的控制策略。

5.1 鹽酸西替利嗪合成路線

鹽酸西替利嗪原料藥由起始物料4-氯二苯氯甲烷（化合物A）與N-羥乙基哌嗪（化合物B）在碳酸鈉溶液中進(jìn)行親核取代反應(yīng)，得到化合物C，其在堿性條件下與氯乙酸鈉發(fā)生取代反應(yīng)生成化合物D，后者在兩步鹽酸反應(yīng)下最終生成鹽酸西替利嗪（化合物F）。反應(yīng)過(guò)程中除溶劑水外，還使用了N，N-二甲基甲酰胺（DMF）以及丙酮等有機(jī)溶劑作為反應(yīng)載體。

圖4 鹽酸西替利嗪合成路線Fig.4 Synthesis pathway for cetirizine hydrochloride

5.2 基因毒性雜質(zhì)篩查

根據(jù)基因毒性雜質(zhì)的來(lái)源，結(jié)合歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)，從起始物料、中間體、殘留溶劑、副產(chǎn)物及降解產(chǎn)物等方面對(duì)該合成路線生產(chǎn)的鹽酸西替利嗪的潛在基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行分析。

5.2.1 藥典雜質(zhì)

表4 匯總了歐洲藥典10.0 版中記載的鹽酸西替利嗪生產(chǎn)過(guò)程中可能出現(xiàn)的雜質(zhì)及其可能來(lái)源，可將藥典雜質(zhì)作為成品常規(guī)必檢項(xiàng)目，同時(shí)根據(jù)實(shí)際合成路線及工藝條件，增加包括工藝相關(guān)的有關(guān)物質(zhì)及殘留溶劑檢測(cè)項(xiàng)目。

表4 鹽酸西替利嗪歐洲藥典10.0 版記載雜質(zhì)信息匯總Tab.4 Information of impurities of cetirizine hydrochloride in European Pharmacopeia 10.0

5.2.2 起始物料及其副產(chǎn)物

該合成路線包含兩個(gè)起始物料（化合物A、B），其中化合物A 為鹵代烴，具有基因毒性警示結(jié)構(gòu)，需要納入后期基因毒性雜質(zhì)控制范疇。而起始物料化合物A 與B 本身均可能攜帶相應(yīng)雜質(zhì)，在第一步親核取代反應(yīng)中起始物料引入的雜質(zhì)能通過(guò)副反應(yīng)產(chǎn)生雜質(zhì)A、C、D、E 和F，經(jīng)過(guò)比對(duì)，未在這五類雜質(zhì)中發(fā)現(xiàn)基因毒性警示結(jié)構(gòu)，故可按照藥典標(biāo)準(zhǔn)以普通雜質(zhì)進(jìn)行控制。

5.2.3 中間體

該合成路線包含三個(gè)中間體（化合物C、D、E），三個(gè)中間體化學(xué)結(jié)構(gòu)均不具有基因毒性警示結(jié)構(gòu)，化合物D 在酸性條件下不穩(wěn)定，在后續(xù)反應(yīng)中將轉(zhuǎn)化為化合物E，且化合物E 與成品具有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)，故可按照藥典標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)化合物C 以普通雜質(zhì)進(jìn)行控 制。

5.2.4 殘留溶劑及其副產(chǎn)物

該合成路線在第二步親核取代反應(yīng)中使用到了ICH Q3C 規(guī)定[13]的二類溶劑DMF，具有一定的基因毒性，需按照指導(dǎo)原則對(duì)其進(jìn)行中間控制及放行檢查。同時(shí)關(guān)注DMF 及丙酮在反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的潛在基因毒性副產(chǎn)物。如DMF 曾被報(bào)道[14]在酸性條件下不穩(wěn)定，容易生成基因毒性雜質(zhì)N-二甲基亞硝胺（NDMA）；丙酮在酸性條件下易與自身發(fā)生反應(yīng)（見(jiàn)圖5），產(chǎn)生副產(chǎn)物2，6-二甲基-2，5-庚二烯-4-酮（化合物H）、3-氯-4-甲基-2-戊酮（化合物J）、4-氯，甲基-2-戊酮（化合物K）和2，6-二氯，二甲基-4-庚酮（化合物L(fēng)），四個(gè)副產(chǎn)物分別具有烯酮及鹵代烴等基因毒性警示結(jié)構(gòu)，需要納入基因毒性雜質(zhì)控制范疇。

圖5 丙醇在酸性條件下所產(chǎn)生的副產(chǎn)物Fig.5 By-products acetone introduced in acid condition

5.2.5 降解產(chǎn)物

成品及雜質(zhì)G 在存儲(chǔ)運(yùn)輸過(guò)程中容易降解或氧化生成雜質(zhì)B，因其不具有基因毒性警示結(jié)構(gòu)，故可按照藥典標(biāo)準(zhǔn)以普通雜質(zhì)對(duì)雜質(zhì)B 進(jìn)行放行檢測(cè)、復(fù)驗(yàn)期檢測(cè)及穩(wěn)定性檢測(cè)。

5.3 基因毒性雜質(zhì)控制

根據(jù)上述基因毒性雜質(zhì)篩查結(jié)果，需要按照基因雜質(zhì)清除及控制策略對(duì)起始物料化合物A；殘留溶劑DMF；副產(chǎn)物NDMA 及副產(chǎn)物H～L 等進(jìn)行嚴(yán)格控制。

對(duì)于起始物料A，由于其的引入位于四步合成反應(yīng)的第一步，距離成品鹽酸西替利嗪的成鹽及后續(xù)結(jié)晶純化步驟較遠(yuǎn)，且其低溶解度的性質(zhì)使其在該步結(jié)晶過(guò)程中與可溶性中間體C 分離，難以參與后續(xù)反應(yīng)，故可采用中間控制的手段控制其含量。如在第一步親核取代后將其作為雜質(zhì)項(xiàng)目，控制含量限度在0.1%以下即可保證其后續(xù)清除效率，若連續(xù)三批驗(yàn)證批次檢測(cè)結(jié)果均低于標(biāo)準(zhǔn)30%，也可不納入常規(guī)檢驗(yàn)。

對(duì)于殘留溶劑DMF，由于其歸屬于具有基因毒性的二類溶劑范疇，且其在后續(xù)反應(yīng)的酸性條件下不穩(wěn)定易生成NDMA，故需要在該步驟設(shè)置嚴(yán)格的中間控制，同時(shí)在成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行把關(guān)，可根據(jù)ICH Q3C 將控制限度設(shè)置為8.80×10-4以保證DMF的清除同時(shí)預(yù)防其在后續(xù)酸性反應(yīng)中生成NDMA。

溶劑丙酮在酸性條件下生成基因毒性副產(chǎn)物H～L，但目前尚未找到合適的替代溶劑，故需要通過(guò)工藝參數(shù)調(diào)整、多步純化以及質(zhì)量控制等手段保證成品中該類雜質(zhì)的含量控制在可接受水平之中。副反應(yīng)效率與保溫回流時(shí)間以及反應(yīng)pH 值相關(guān)，可在工藝驗(yàn)證數(shù)據(jù)支持下適當(dāng)縮短保溫回流時(shí)間，少量多次加入鹽酸以保持pH 值變化穩(wěn)定，降低整體副反應(yīng)效率，減少副產(chǎn)物生成；化合物H～L 具有良好的醇溶性，可利用乙醇對(duì)鹽酸西替利嗪粗品進(jìn)行重結(jié)晶純化；同時(shí)根據(jù)TTC 原則計(jì)算雜質(zhì)限度：目前尚未有文獻(xiàn)記載化合物H～L 的致癌劑量，考慮到鹽酸西替利嗪是過(guò)敏患者長(zhǎng)期用藥的選擇，劑量為20 mg/ d，以基因毒性雜質(zhì)可接受日劑量1.5 μg/d 作為計(jì)算依據(jù)，故基因毒性副產(chǎn)物H～L 的可接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)設(shè)置為7.5×10-4，質(zhì)量控制需要開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確的分析方法，通常使用到HPLC-MS 或LC-MS 等檢測(cè)手段。

6 結(jié)束語(yǔ)

隨著對(duì)原料藥合成過(guò)程中基因毒性雜質(zhì)的引入認(rèn)知的加深，我國(guó)原料藥行業(yè)改變了過(guò)往對(duì)基因毒性雜質(zhì)控制的“檢出”模式，逐步轉(zhuǎn)型為“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”模式。通過(guò)潛在基因毒性雜質(zhì)危害性評(píng)估確定雜質(zhì)分類及控制策略，進(jìn)而優(yōu)化原料藥的合成路線及生產(chǎn)工藝，建立更加合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量控制體系，從源頭降低原料藥中基因毒性雜質(zhì)的引入，并通過(guò)合適的清除手段降低雜質(zhì)含量，最終保障用藥安全。然而基因毒性雜質(zhì)控制仍存在諸多難點(diǎn)，首先要求企業(yè)對(duì)原料藥合成路徑及反應(yīng)機(jī)理有深刻理解，其次需要建立痕量水平分析方法，最后痕量雜質(zhì)清除要求采用更先進(jìn)的純化手法，無(wú)疑對(duì)我國(guó)藥品研發(fā)企業(yè)提出了新的挑戰(zhàn)。