岳萬遠 張 莉 劉 華 張莉萍

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是最常見的涎腺惡性腫瘤，約占所有涎腺惡性腫瘤的22%。它具有某些獨特的生理特征，如生長緩慢，但無包膜，侵襲性較強，極易侵襲神經和血管，發(fā)生嗜神經生長和遠處轉移，其中肺是最常見的遠處轉移部位，患者的長期生存率極低[1-3]。對于涎腺腫瘤的治療，目前仍以手術為主，但術后常出現(xiàn)復發(fā)、轉移[4]。近年來，隨著人們對表觀遺傳學認識和研究的深入，腫瘤發(fā)生、發(fā)展的表觀遺傳學機制成為腫瘤研究的熱點[4]。據報道，表觀遺傳機制，如啟動子甲基化，在腫瘤抑制基因轉錄失活中發(fā)揮重要作用。RAS關聯(lián)域家族蛋白1A(RASSF1A)是人類惡性腫瘤中最常見的表觀遺傳學滅活腫瘤抑制基因之一。啟動子甲基化是RASSF1A基因失活的主要機制，在許多人類實體瘤中已得到證實[2]。RASSF1A啟動子甲基化的頻率在腫瘤中可達99%，而在正常組織中則為0[5-6]。因此RASSF1A甲基化狀態(tài)作為一種有吸引力的癌癥風險和預后的生物標志物，具有強大的臨床應用潛力。目前為止，鮮少有關于SACC患者中RASSF1A啟動子甲基化的報道。因此，本研究通過對60例SACC患者進行研究，旨在檢測RASSF1A啟動子甲基化和蛋白表達水平，并探討其作為預后和生存指標的可能性，為臨床精準治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床組織樣本

60例SACC組織和60例正常涎腺組織樣本均來自我院2014年2月至2018年12月收治的經病理診斷確認為涎腺癌的患者。所有組織樣本手術后暫存于液氮中，24 h后存于-80℃冰箱備用?；颊咴谑中g前，沒有其他治療史，本研究所有參與對象均已簽署知情同意書，且經過我院倫理委員會的審核同意。所有組織樣品均用福爾馬林固定，石蠟包埋；組織切片(4 mm)用蘇木精和伊紅染色。所有患者的病理染色結果由3名病理醫(yī)師復查確診。

1.2 主要試劑與材料

電泳轉模裝置(美國Bio-Rad公司)；PVDF膜、凝膠成像系統(tǒng)(IS 1000)(美國Pharmacia Biotech公司)；MSP分析儀(德國Roche Applied Science公司)；RNA PCR試劑盒(中國寶生物工程有限公司)；羊抗RASSF1A抗體(美國R&D Systems公司)；辣根過氧化物酶標記二抗(中國聯(lián)科生物技術有限公司)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(中國碧云天生物技術研究所)；亞硫酸氫鈉修飾試劑盒(德國QIAGEN公司)。本研究用到的甲基化和非甲基化序列由日本TaKara公司合成。

1.3 甲基化特異性PCR(MSP)分析RASSF1A啟動子甲基化

從石蠟切片中提取DNA，使用亞硫酸氫鈉對DNA進行修飾。RASSF1A引物序列如下：F：GTGTTAACGCGTTGCGTATC；R：AACCCCGCGAACTAAAAACGA。根據制造商的說明，PCR擴增與HotStar Taq DNA聚合酶(Qiagen)的反應量為12.5 ml，陰性對照組用水替代DNA。以正常淋巴細胞提取的DNA作為陽性對照。用SssI酶(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)處理。擴增反應程序如下：95℃ 2 min，1 個循環(huán)；95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 30 s，2個循環(huán)；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃，10 min。最后PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外燈照射下直接觀察。

1.4 Western Blot檢測RASSF1A蛋白表達

從石蠟組織切片中提取蛋白，并用BCA蛋白檢測試劑盒對蛋白濃度進行定量。蛋白質樣品用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離，轉移到PVDF膜上，加入封閉液室溫搖床封閉 2 h，加入一抗RASSF1A (1：3000)孵育1 h，轉置4 ℃ 搖床孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育1 h。洗膜后，將PVDF膜滴加適量的 ECL 發(fā)光液并迅速放入凝膠成像儀中成像分析，β-actin被用作內參。

1.5 qRT-PCR檢測RASSF1A甲基化mRNA表達

使用Trizol試劑從SACC腫瘤組織切片中提取總RNA，根據cDNA合成試劑盒說明書將mRNA逆轉錄為cDNA。用SYBR-PrimeScript-RT-qPCR試劑盒進行實時定量PCR(qRT-PCR)檢測RASSF1A啟動子甲基化后的mRNA表達量，以GAPDH作為內參對照。RASSF1A甲基化引物序列為：F：GCTCGTCTGCCTGGACTGTT；R：GGGCATTGTACTCCT TGATCTT。擴增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；57 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；30個循環(huán)后，72 ℃ 10 min。相對表達水平用2-△△Ct法計算。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗結果用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。RASSF1A基因甲基化、蛋白表達水平與患者臨床病理特征之間的相關性分析采用χ2檢驗。GraphPad Prism 7繪制數據結果圖。P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RASSF1A啟動子甲基化水平在組織中的表達情況

我們對60例SACC腫瘤組織和60例正常涎腺組織進行了MSP檢測，結果如圖1所示：在60例SACC腫瘤組織切片中，12例組織的RASSF1A啟動子未被檢測到甲基化；48例組織中檢測到RASSF1A啟動子甲基化的表達，其中13例組織啟動子部分甲基化，35例組織啟動子呈高甲基化狀態(tài)。但在60例正常涎腺組織中，未檢測到RASSF1A啟動子甲基化的表達。

M為甲基化引物擴增結果；U為非甲基化引物擴增結果。

2.2 RASSF1A mRNA的表達水平

基于MSP的檢測結果，我們對60例SACC腫瘤組織樣本和60例癌旁正常涎腺組織樣本中RASSF1A mRNA的表達進行檢測，結果顯示，與正常涎腺組織相比，RASSF1A 基因的mRNA在涎腺癌組織中的表達顯著降低(圖2A、B，P<0.01)。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，在RASSF1A mRNA的表達降低與涎腺癌組織中RASSF1A基因啟動子的甲基化相關。具體來講，在60例涎腺癌組織中，RASSF1A基因啟動子無甲基化的涎腺癌組織(12例)、RASSF1A基因啟動子部分甲基化的涎腺癌組織(13例)、RASSF1A基因啟動子高甲基化的涎腺癌組織(35例)中RASSF1A mRNA的相對表達依次降低(圖3A、B，P<0.01)。這些結果提示RASSF1A基因高甲基化可能是該基因表達下調的原因之一。

A為RASSF1mRNA在涎腺腺樣囊性癌(SACC)患者癌組織和癌旁組織的表達；B為癌組織中不同啟動子甲基化程度樣本中RASSF1mRNA的相對水平。

2.3 RASSF1A蛋白在組織中的表達情況

Western blot分析結果顯示，RASSF1A蛋白在SACC腫瘤組織中的表達明顯低于癌旁正常涎腺組織(圖4，P<0.01)。該結果與RASSF1A mRNA在涎腺癌組織中的表達趨勢相一致。這提示RASSF1A基因啟動子的甲基化不僅導致RASSF1A mRNA在涎腺癌組織中的表達降低，并且也導致RASSF1A蛋白在涎腺癌中的表達下調。

圖4 Western blot檢測RASSF1A蛋白在SACC腫瘤患者癌旁組織和癌組織中的表達

2.4 RASSF1A基因甲基化、蛋白表達與SACC患者臨床病理指標之間的相關性

根據RASSF1A蛋白在患者癌組織中的相對表達水平的平均值，我們將60例SACC患者分為高表達組(23例)和低表達組(37例)。如表1所示，RASSF1A蛋白在SACC患者癌組織中的相對表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小等無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而與患者TNM分期、淋巴結轉移明顯相關，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。根據RASSF1A基因啟動子有無甲基化，我們將60例SACC患者分為甲基化組(48例)和無甲基化組(12例)；如表1所示，RASSF1A蛋白在SACC患者癌組織中的甲基化與患者的年齡、性別、腫瘤大小等無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而與患者TNM分期、淋巴結轉移明顯相關，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 RASSF1A基因甲基化、蛋白表達與患者臨床病理指標之間的關系/例

2.5 RASSF1A蛋白表達、基因啟動子甲基化水平與患者生存的關系

我們采用Westernblot的檢測結果，以RASSF1A相對表達水平(相對于正常組織)的中位數為界限將患者分為RASSF1A高表達和低表達2組；對60例患者進行定期隨訪。根據隨訪結果，用log-rank檢驗進行結果分析，繪制Kaplan-meier's生存分析圖(圖5)。其中RASSF1A蛋白高表達的SACC患者在相同時間內的生存率顯著高于低表達患者(圖5A，P<0.01)。以RASSF1A啟動子有無甲基化將將患者分為甲基化和無甲基化2組；與12例無甲基化的患者相比，48例RASSF1A啟動子甲基化的SACC患者生存率顯著降低(圖5B，P<0.01)。這些結果表明，RASSF1A蛋白表達降低和基因啟動子甲基化與SACC患者的生存率降低密切相關，是導致患者預后不良的一個重要因素。

圖5 RASSF1A蛋白表達水平和啟動子甲基化與患者的生存分析

3 討論

SACC是頜面外科最常見的高度惡性腫瘤，浸潤性極強，易侵入血管，隨血運轉移，除此之外，還易沿神經擴散[7]，轉移和復發(fā)是導致患者死亡的主要原因[8-9]。然而目前對該腫瘤的轉移和復發(fā)的具體機制仍缺乏了解[4]。

研究表明，SACC的發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多步驟的過程，而其分子學基礎是癌基因的激活和/或抑癌基因的失活。RASSF1A已被證實是一個抑癌基因，在細胞周期控制、微管穩(wěn)定、細胞粘附、運動和凋亡等方面發(fā)揮作用[2,10]。同時研究表明，DNA甲基化在基因表達調控、細胞增殖和分化等方面扮演重要的角色，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切[11-14]。啟動子甲基化是一種表觀遺傳變化，是RASSF1A基因失活的主要機制，已在包括人類非小細胞肺癌[15-17]、乳腺癌和結直腸癌的實體腫瘤中得到證實[18-19]。因此，RASSF1A啟動子甲基化可能是此類腫瘤的預后指標。

在本研究中，我們用MSP方法檢測了60名SACC患者的組織樣本和正常涎腺組織樣本的RASSF1A啟動子甲基化表達水平，結果顯示，在60例SACC腫瘤組織切片中，有48例檢測到RASSF1A啟動子甲基化，但在正常涎腺組織中未檢測到，這與先前的報道結果一致[5-6]。正常涎腺組織中未檢測到RASSF1A啟動子甲基化，而SACC腫瘤組織中檢測出高頻率的RASSF1A啟動子甲基化水平，這表明RASSF1A的不同表達狀態(tài)與SACC腫瘤發(fā)生有關。同時，我們用Western blot檢測了SACC腫瘤組織和正常涎腺組織中RASSF1A蛋白的表達情況。結果顯示，與正常涎腺組織相比，SACC患者組織中RASSF1A蛋白表達顯著降低。該結果提示RASSF1A基因甲基化是導致RASSF1A蛋白表達下調的原因之一。這與先前研究報道的RASSF1A在小腸類癌中的甲基化，并在初步研究中觀察到RASSF1A表達的缺失與甲基化之間有較高的一致性的結果一致[20]。

由于SACC生長比較緩慢，容易侵襲周圍的神經及血管，向周圍擴散，部分患者能夠帶瘤生存，但預后欠佳[21]。本研究結果顯示，SACC患者的臨床分期、淋巴結轉移被認為是預后較差的預測因素。這與文獻報道的Ⅲ、Ⅳ期患者比Ⅰ、Ⅱ期患者預后效果差，提示分期越高則預后越差結果一致[22]。除此之外，RASSF1A基因啟動子甲基化也被報道在手術治療的非小細胞肺癌[2,15]、乳腺癌[23-24]、Ⅰ期和Ⅱ期肺癌[25]和Wilms腫瘤[2,26]中導致較差的生存率。因此，我們對48例RASSF1A啟動子甲基化的SACC腫瘤組織進行qRT-PCR檢測。結果顯示，有35例SACC腫瘤組織中RASSF1A的mRNA表達水平較高，13例SACC腫瘤組織中RASSF1A的mRNA表達水平較低。同時對其進行Western blot檢測，結果與qRT-PCR結果一致，35例SACC腫瘤組織中RASSF1A蛋白表達水平較高，13例SACC腫瘤組織中RASSF1A蛋白表達水平較低。這一結果表明，基因甲基化與實體腫瘤模式相關；RASSF1A基因可能在SACC的發(fā)生進展中尤為重要。在膀胱癌[2,27]和Wilms腫瘤[2，26]中也有類似的結論。我們的研究結果為RASSF1A啟動子甲基化作為在SACC患者預后和生存生物標志物的潛在有效性提供了證據。

綜上所述，本研究表明，RASSF1A基因啟動子甲基化在SACC癌變過程中發(fā)揮了重要作用，可能是患者生存和預后的生物標志物。同時研究顯示，RASSF1A的蛋白表達缺失與甲基化之間普遍存在一致性。我們可以通過抑制RASSF1A啟動子甲基化，來抑制SACC癌變，從而為SACC患者治療的新靶點提供理論依據。