劉 暉 趙春英 鄭 潔 王 鳳 楊華鋒 王建東

三陰性乳腺癌是一種具有高度侵襲性的乳腺癌，患者常表現(xiàn)出耐藥性，靶向治療效果不佳[1]。冬凌草甲素是香茶菜屬植物中含量較高雙萜類生物堿，具有明確的抗腫瘤功效[2]，但對(duì)于其抑制乳腺癌細(xì)胞的作用和機(jī)制尚未有深入研究。本研究著重考察冬凌草甲素對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468的抗癌活性，并從細(xì)胞增殖和凋亡角度，探索冬凌草甲素抑制乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制，為其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與抗體

DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher，lot No.2024699)；FBS(GIBCO，No.10091148)；冬凌草甲素(曼斯特，No.MUST-17041120)；DMSO(Life science，No.0236C042)；青霉素(Life science，No.1842944)，鏈霉素(GIBCO，No.1846496)。MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自浙江如耀生物科技有限公司。抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 MTT法

采用MTT比色法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞增殖活性。將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度冬凌草甲素(1.25、2.5、5、10、20、40 μM，以加等量不含藥培養(yǎng)基為對(duì)照組)，孵育48 h后，每孔加入15 μl MTT溶液(5 mg/ml)，孵育4 h后棄上清，加入150 μl DMSO，振蕩10 min。以560 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630 nm為參比波長(zhǎng)，測(cè)定吸光值，并以不加藥的培養(yǎng)基孵育48 h作為空白對(duì)照，計(jì)算冬凌草甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制率。

1.3 DAPI染色

MDA-MB-468細(xì)胞爬片，冬凌草甲素干預(yù)24 h，預(yù)冷70%乙醇固定，加入DAPI染液(1 μg/ml)染色2～3 min，去掉染料后PBS漂洗一次，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)特征。

1.4 細(xì)胞凋亡

采用Annexin-FITC流式檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。將MDA-MB-468細(xì)胞加冬凌草甲素處理24 h后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106/ml。吸取100 μl的細(xì)胞懸液，加入400 μl結(jié)合緩沖液，加5 μl Annexin V/FITC和10 μl 20 μg/ml的碘化丙啶溶液，混勻后室溫避光孵育15 min，進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.5 Western-blot分析

收集陰性對(duì)照組及冬凌草甲素處理24 h后的MDA-MB-468細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解5 min，12 000 rpm/min離心10 min后取上清，加入5×上樣緩沖液，于100 ℃變性5 min。蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，使用ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯影。以GAPDH為內(nèi)參，Image J分析條帶灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

冬凌草甲素分別作用24 h和48 h后，進(jìn)行MTT測(cè)試。結(jié)果顯示，冬凌草甲素對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞有明顯抑制，冬凌草甲素10 μM作用48 h后抑制率可達(dá)到(97.24±6.21)%，隨后提高濃度其抑制率不再增加(圖1)。因此，后續(xù)選擇10 μM為冬凌草甲素作用濃度用于研究。

圖1 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制趨勢(shì)

2.2 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞形態(tài)的影響

冬凌草甲素處理后的MDA-MB-468細(xì)胞數(shù)量隨著作用濃度增加而明顯減少，在10 μM時(shí)，大量細(xì)胞變圓，從培養(yǎng)皿中脫離。隨后，根據(jù)DAPI染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)未加冬凌草甲素的空白對(duì)照組細(xì)胞核較完整，未見明顯凋亡形態(tài)。冬凌草甲素處理后，高倍鏡下可見部分細(xì)胞呈典型凋亡形態(tài)，表明冬凌草甲素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且隨著濃度的增加，凋亡的細(xì)胞增多。

2.3 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響

冬凌草甲素干預(yù)后，MDA-MB-468細(xì)胞周期結(jié)果如圖2所示，G2/M期細(xì)胞比例均有明顯增加，且與冬凌草甲素濃度成正相關(guān)，對(duì)照組中G2/M期比例為(14.07±4.01)%，而冬凌草甲素作用濃度達(dá)到10 μM時(shí)，MDA-MB-468的G2/M比例增加至(26.26±2.61)%；同時(shí)S期和G0/G1期的細(xì)胞比例降低，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表明冬凌草甲素可將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

2.4 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

將冬凌草甲素處理24 h后的MDA-MB-468細(xì)胞進(jìn)行Annexin V/PI雙染色，結(jié)果顯示，早期凋亡(Q1-LR區(qū)域)和晚期凋亡(Q1-UR區(qū)域)細(xì)胞比例均隨冬凌草甲素作用的濃度增加而逐漸提高，體現(xiàn)在UR和LR區(qū)域細(xì)胞比例的逐漸提高，說明冬凌草甲素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴性。見圖3。

圖3 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 冬凌草甲素對(duì)增殖和凋亡有關(guān)蛋白的影響

MDA-MB-468細(xì)胞經(jīng)冬凌草甲素處理，免疫印跡分析表明，p53表達(dá)隨著冬凌草甲素作用濃度的增加而提高，PARP總蛋白水平在10 μM時(shí)下調(diào)，其活化形式隨濃度增加而上調(diào)。細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白包括cleaved Caspase-3(Caspase-3活化形式)、cleaved Caspase-9(Caspase-9活化形式)以及Cyt.C(細(xì)胞色素c)隨著作用濃度的增加而上升。隨著冬凌草甲素濃度增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的水平隨之下調(diào)，誘導(dǎo)凋亡蛋白Bax則有增加的趨勢(shì)。見圖4。以上結(jié)果進(jìn)一步提示，冬凌草甲素可通過啟動(dòng)內(nèi)源和外源性途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

圖4 免疫印跡結(jié)果

3 討論

冬凌草甲素已被證實(shí)具有廣泛的抗腫瘤效果[3]。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素對(duì)胃癌細(xì)胞[4]、結(jié)直腸癌細(xì)胞[5]，白血病細(xì)胞[6]等都有一定的抑制作用。在研究冬凌草甲素抗腫瘤機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，它還可以通過增加細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的磷酸化來激活細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)一步發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[7-8]。在非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素可促進(jìn)SPC-A-1細(xì)胞中Bax表達(dá)，而抑制Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[9]。在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，冬凌草甲素不僅改變Bax/Bcl-2的表達(dá)，而且可促進(jìn)細(xì)胞色素c從線粒體的釋放，從而觸發(fā)線粒體凋亡途徑[10]。

目前尚無針對(duì)三陰性乳腺癌的專用藥物，臨床上采用阿霉素等抗癌藥在一定程度上抑制乳腺癌的發(fā)展，但是存在較大副作用。而冬凌草甲素可能通過促凋亡和抗血管生成作用協(xié)同增強(qiáng)阿霉素對(duì)侵襲性乳腺癌的抗腫瘤作用，從而降低阿霉素帶來的副作用[11]。也有報(bào)道冬凌草甲素可以聯(lián)合卡培他濱顯著提高對(duì)MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞的抑制率[12]。本研究的MTT測(cè)試結(jié)果顯示，冬凌草甲素能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。DAPI染色直觀顯示了冬凌草甲素可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示冬凌草甲素可將細(xì)胞阻滯于G2/M期，這與先前在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中觀察到的結(jié)果一致[13]。

為進(jìn)一步探討冬凌草甲素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，本文還對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞凋亡途徑可初略分為內(nèi)源性和外源性途徑，最終都通過Caspase-3活化啟動(dòng)凋亡進(jìn)程，外源性途徑以Caspase-9的活化等為代表，而內(nèi)源性途徑則以線粒體膜上Cyt.c的釋放為代表。p53是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和凋亡的關(guān)鍵蛋白，已有研究證明p53可同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)源性和外源性凋亡的發(fā)生[14]。p53上調(diào)以后意味著細(xì)胞損傷后的監(jiān)控增強(qiáng)，有DNA損傷的細(xì)胞無法進(jìn)入復(fù)制周期，繼而走向凋亡。三陰性乳腺癌患者中約有80%以上存在p53突變，近年也有發(fā)現(xiàn)部分化合物可重新激活突變型p53，將其恢復(fù)為野生型構(gòu)象，且在乳腺癌臨床前模型中均表現(xiàn)出活性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素作用于MDA-MB-468細(xì)胞后，p53表達(dá)量上調(diào)，說明冬凌草甲素能增加抑癌蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)在冬凌草甲素的干預(yù)下，乳腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Caspase-9和PARP被活化，Cyt.c的表達(dá)增加。在本研究中顯示，冬凌草甲素可同時(shí)啟動(dòng)內(nèi)源性和外源性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。由此可以推斷，冬凌草甲素不僅抑制細(xì)胞增殖，而且可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，其主要機(jī)制可能在于上調(diào)p53的水平。總之，冬凌草甲素可能通過上調(diào)p53水平，導(dǎo)致細(xì)胞監(jiān)控加強(qiáng)，錯(cuò)誤細(xì)胞無法進(jìn)入復(fù)制周期，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上所述，冬凌草甲素能夠有效抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468的增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，且其作用效果在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出劑量依賴性。其初步作用機(jī)理為通過上調(diào)p53表達(dá)，活化細(xì)胞凋亡途徑關(guān)鍵蛋白Caspase 3、Caspase-9 和PARP。后期我們將考慮進(jìn)一步的體內(nèi)研究以明確其對(duì)三陰性乳腺癌的抑制效果。