康 麟 曹 磊 趙秋鶴 劉雪婷
(新疆烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院1 骨科,2 軟傷科,烏魯木齊市 830001,電子郵箱:k56234899@163.com;3 新疆烏魯木齊市友誼醫(yī)院疼痛科,烏魯木齊市 830001;4 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,烏魯木齊市 830011)
骨折是肌肉骨骼系統(tǒng)最常見的損傷之一[1-2]。有5%~10%的患者因骨折修復(fù)受損而愈合延遲或無法愈合[3],長時(shí)間的康復(fù)和持續(xù)治療會給患者帶來不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),并降低其生活質(zhì)量。骨折愈合是骨組織細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)和一系列復(fù)雜過程(包括體內(nèi)免疫調(diào)節(jié))的綜合結(jié)果,目前骨折愈合的機(jī)理仍不確定。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β的超家族,在骨骼發(fā)育、骨骼生長和骨折修復(fù)過程中起著至關(guān)重要的作用[4]。BMP-2位于20p12的基因組上,作為BMP家族的重要成員,其不僅參與骨骼系統(tǒng)的早期發(fā)育和組織構(gòu)建[5],也參與誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化和成骨細(xì)胞增強(qiáng)骨基質(zhì)的產(chǎn)生[6]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)級聯(lián)是BMP-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一種非典型途徑。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的表達(dá)是成骨細(xì)胞開始分化的標(biāo)志,因此它是骨形成過程中最早和最具特異性的標(biāo)志基因[7]。BMP-2通過激活p38 MAPK信號傳導(dǎo)以促進(jìn)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的表達(dá)和激活[8]。研究顯示,鞘磷脂磷酸二酯酶(sphingomyelin phosphodiesterase,Smpd)3在生長板發(fā)育和骨礦化中具有重要作用,此外Smpd3也是發(fā)育中的生長板中肥大軟骨細(xì)胞凋亡的必需物質(zhì)[9]。已有研究表明,動物骨折模型中BMP-2表達(dá)下調(diào)[10-11]。因此,本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠骨折模型,探討B(tài)MP-2過表達(dá)對骨折大鼠的骨愈合和成骨能力的影響及其可能機(jī)制,為臨床治療骨折提供新的思路。
1.1 實(shí)驗(yàn)動物 60只成年雄性SD大鼠(無特定病原體級,200~220 g)購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(新)2019-002。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房中,正常飲食飲水。大鼠適應(yīng)環(huán)境兩周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2 主要試劑 BMP-2過表達(dá)的陰性質(zhì)粒和BMP-2過表達(dá)的質(zhì)粒購自中國上?;蜥t(yī)藥生物技術(shù)有限公司。蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)試劑盒購自購自北京索萊寶生物科技有限公司(貨號:AG1120)。大鼠血清白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6試劑盒、大鼠血清腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和大鼠血清IL-10試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司(貨號:ZN2280-GPK、ZN2367-GPK、ZN2154-GPK)。ALP檢測試劑盒購自長春匯力生技術(shù)有限公司(貨號:ARB12667)。RIPA裂解液和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒購自美國Promega公司(貨號:AR0105、AR1257)。BMP-2抗體購自武漢博士德工程有限公司(貨號:KG22178-1)。p38 MAPK抗體、Smad1抗體、Runx2抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體和IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司(貨號:8690T、6944T、12556S、5174T、7074S)。Smpd3抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司(貨號:A10197)。
1.3 大鼠分組及骨折模型制備 將60只SD大鼠采用完全隨機(jī)分組方法分為模型組、BMP-2過表達(dá)的陰性質(zhì)粒組(pcDNA/NC組)和BMP-2過表達(dá)質(zhì)粒組(pcDNA/BMP-2組),每組20只。經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠。待成功麻醉后,在大鼠皮膚外側(cè)做一個10 mm的切口,用鈍器解剖暴露肌肉后暴露右股骨干,于股骨中段用線鋸將股骨橫行切斷,并將髓內(nèi)固定針逆行插入骨折近端,從股骨大轉(zhuǎn)子穿出,生理鹽水洗凈傷口后逐層縫合。術(shù)后給予大鼠經(jīng)腹腔注射青霉素(100 000 IU/mL)1 mL/kg,1次/d,連用3d,清潔級環(huán)境下單籠飼養(yǎng)。
1.4 給藥方法 骨折造模24 h后,給予模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注射磷酸緩沖鹽溶液100 μL,pcDNA/NC組經(jīng)尾靜脈注射BMP-2過表達(dá)的陰性質(zhì)粒溶液100 μL,pcDNA/BMP-2組經(jīng)尾靜脈注射BMP-2過表達(dá)質(zhì)粒溶液100 μL。49 d后,經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠,取材,進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測。
1.5 觀察指標(biāo)檢測
1.5.1 X線片:分別于術(shù)后第 1周、第4周、第7周周末對各組大鼠進(jìn)行X線(多功能X線機(jī)診斷計(jì)量儀,德國QUART公司,型號:32)檢查,觀察各組大鼠骨折線的變化及達(dá)到骨性愈合的時(shí)間,骨性愈合的判斷標(biāo)準(zhǔn)為骨折間隙中可見新的骨形態(tài)形成。
1.5.2 mirco-CT參數(shù):實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取出各組大鼠股骨并在4%多聚甲醛中固定24 h后,使用micro-CT系統(tǒng)[布魯克(北京)科技有限公司,型號:Bruker SkyScan 1174]以50 kV和200 μA的9 μm分辨率分析骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume density,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)和骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)。
1.5.3 蕃紅O染色:各組大鼠的股骨組織經(jīng)固定、包埋、切片后,將切片在二甲苯中脫蠟,于梯度濃度的乙醇(100%,5min;95%,2 min;85%,2 min;75%,2 min)中脫水。然后將切片用蘇木精染色5 min,在流動的自來水下清洗10 min,用1%乙酸溶液快速沖洗15 s,然后在0.1%番紅O溶液中染色5 min。將切片脫水并用95%乙醇,無水乙醇和二甲苯透明,之后使用中性樹膠封片,于光學(xué)顯微鏡下觀察切片并拍照。
1.5.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,心尖取血,置于離心管中,3 000 r/min 離心15 min,吸取上層血清100 μL。按照酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,于酶標(biāo)儀450 nm波長處依序測定各孔的光密度(OD值),根據(jù)OD值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清IL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。同時(shí)按照上述方法,使用ALP酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測血清中ALP的表達(dá)水平。
1.5.5 蛋白免疫印跡法檢測:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取各組大鼠骨折部位周圍骨組織,用RIPA裂解液提取蛋白,用BCA法測定總蛋白含量。行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h后,將聚偏二氟乙烯膜與BMP-2抗體(1 ∶1 000)、p38 MAPK抗體(1 ∶1 000)、Smpd3抗體(1 ∶1 000)、Smad1抗體(1 ∶1 000)、Runx2抗體(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶2 000)在4℃孵育過夜。隨后,將聚偏二氟乙烯膜用TBST洗滌3次,5 min/次,并與IgG-HRP(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,用TBST洗滌3次,5 min/次。最后顯影曝光,用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。以GAPDH為內(nèi)參蛋白,利用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析,計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 3組大鼠股骨創(chuàng)傷處X線檢查結(jié)果 X線片結(jié)果顯示,模型組和pcDNA/NC組大鼠在第7周時(shí)骨折未能完全愈合,而pcDNA/BMP-2組大鼠在第7周時(shí)骨折完全愈合,見圖1。
圖1 3組大鼠股骨創(chuàng)傷處X線片
2.2 3組大鼠股骨創(chuàng)傷處micro-CT圖像及參數(shù) 模型組和pcDNA/NC組觀察到明顯的骨折間隙,而在pcDNA/BMP-2組大鼠的骨折間隙中可見新的骨形態(tài)形成,見圖2。與模型組和pcDNA/NC組相比,pcDNA/BMP-2組大鼠的骨密度、BV/TV、Tb.Th和Tb.N均升高(均P<0.05),見表1。
圖2 3組大鼠股骨創(chuàng)傷處micro-CT圖像
表1 3組大鼠骨折愈合相關(guān)指標(biāo)的變化(x±s)
2.3 3組大鼠股骨創(chuàng)傷處病理變化 蕃紅O染色結(jié)果顯示,在模型組和pcDNA/NC組中,股骨的骨折部位有大量的軟骨組織和滑膜形成,而在pcDNA/BMP-2組中股骨骨折部位觀察到編織骨,見圖3。與模型組和pcDNA/NC組相比,pcDNA/BMP-2組大鼠股骨的骨折愈合有明顯改善。
圖3 3組大鼠股骨創(chuàng)傷處病理變化(蕃紅O染色,×200)
2.4 3組大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-10和ALP水平的比較 與模型組和pcDNA/NC組相比,pcDNA/BMP-2組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平均下降(P<0.05),IL-10、ALP水平升高(均P<0.05),見表2。
表2 3組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-10和ALP水平比較(x±s)
2.5 3組大鼠骨組織中BMP-2、Smad1和Runx2蛋白的表達(dá) 與模型組和pcDNA/NC組相比,pcDNA/BMP-2組中BMP2、Smad1和Runx2的蛋白相對表達(dá)水平升高(均P<0.05),見圖4及表3。
圖4 3組大鼠骨組織中BMP-2、Smad1和Runx2蛋白的表達(dá)
表3 3組大鼠骨組織中BMP-2、Smad1和Runx2蛋白的相對表達(dá)水平(x±s)
圖5 3組大鼠骨組織中p38 MAPK和Smpd3蛋白的表達(dá)
表4 3組大鼠骨組織中BMP-2、p38MAPK和Smpd3蛋白的相對表達(dá)水平(x±s)
骨折愈合是一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)的結(jié)果,通常與年齡、性別和健康狀況有關(guān)[12]。在細(xì)胞水平上,骨折愈合指的是骨細(xì)胞的再生,骨折部位周圍組織和細(xì)胞分泌的相關(guān)細(xì)胞因子和營養(yǎng)均可促進(jìn)骨細(xì)胞的再生。近年來,在探索骨折愈合的分子機(jī)制方面取得了某些進(jìn)展,然而在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中其特定的信號通路和相關(guān)的基因功能仍未清楚[13]。BMP-2是一種重要的分化因子,能夠通過間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化性、遷移、增殖和分化促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化,從而誘導(dǎo)骨再生,使其具有潛在的成骨活性,在骨折和骨缺損治療中刺激新骨生長[14]。本研究探討B(tài)MP-2過表達(dá)對骨折大鼠的骨愈合和成骨能力的影響,并分析其可能機(jī)制。
骨創(chuàng)傷修復(fù)時(shí),骨母細(xì)胞、軟骨母細(xì)胞、血管骨內(nèi)皮等均合成ALP[15]。成骨細(xì)胞分泌的ALP可以滲入血液,使血液中ALP水平增加。因此,血清ALP可作為骨重建活躍情況的標(biāo)志物[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)BMP-2的大鼠在第7周時(shí)骨折完全愈合,骨密度、BV/TV、Tb.Th和Tb.N均升高,且血清中ALP活性升高,這提示BMP-2的過表達(dá)可促進(jìn)骨折愈合的進(jìn)程。
骨折后局部形成血腫機(jī)化組織,先天免疫細(xì)胞浸潤骨折部位并分泌炎性細(xì)胞因子,以刺激修復(fù)細(xì)胞進(jìn)一步募集到骨折部位[17]。參與骨折愈合的細(xì)胞因子主要包括促炎性因子(TNF-α、IL-1和IL-6)和抗炎性因子(IL-10),它們在炎癥早期和創(chuàng)傷愈合組織重塑階段都具有獨(dú)特的激增模式[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,BMP-2過表達(dá)可使骨折大鼠血清IL-6、TNF-α水平下降,IL-10水平升高,這提示BMP-2過表達(dá)可降低炎癥因子的水平,從而促進(jìn)骨愈合。
BMP2/Smad1/Runx2途徑參與了骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化,Runx2是骨形成的關(guān)鍵因素[19]。Smad蛋白與Runx2相互作用,參與成骨細(xì)胞表型基因的表達(dá)和分化,兩者共同調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中膠原蛋白的表達(dá)[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,過表達(dá)BMP-2可使骨折大鼠骨組織中Smad1和Runx2的表達(dá)水平明顯增加。這表明,BMP-2過表達(dá)可通過上調(diào)Smad1和Runx2的表達(dá)以促進(jìn)骨細(xì)胞中膠原蛋白的形成,從而促進(jìn)骨愈合。
研究表明,BMP-2可激活p38 MAPK途徑;相反,p38 MAPK也需要通過BMP-2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表型,從而導(dǎo)致體外礦物質(zhì)沉積[21]。Smpd3是一種脂質(zhì)代謝酶,也是骨骼發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過表達(dá)BMP-2使骨組織中p38 MAPK和Smpd3的表達(dá)水平明顯增加。因此,過表達(dá)BMP-2可進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成,從而加快骨折愈合。
綜上所述,過表達(dá)BMP-2可促進(jìn)大鼠骨折愈合,這可能與BMP-2可下調(diào)炎癥因子的表達(dá),上調(diào)Smad1和Runx2的表達(dá)以促進(jìn)骨細(xì)胞中膠原蛋白的形成,以及通過p38 MAPK積極上調(diào)Smpd3的表達(dá)有關(guān)。因此,BMP-2在骨折愈合中發(fā)揮著重要作用,可為臨床治療骨折提供新的思路。