溫正旺陳益平任迪索胡玲瓏石海礬陳潔

1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童感染科，浙江溫州325000；2溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院，浙江溫州325000

人巨細(xì)胞病毒（HCMV）是引起嬰幼兒肝炎常見(jiàn)的病原體[1]。HCMV肝炎占嬰幼兒肝炎綜合征的30%～40%，臨床表現(xiàn)多樣（無(wú)癥狀感染、膽汁淤積肝炎甚至膽道閉鎖），尤其是亞臨床型肝炎最為常見(jiàn)，嚴(yán)重危害嬰幼兒的健康及生長(zhǎng)發(fā)育。人群普遍感染HCMV，其特異性IgG抗體陽(yáng)性率可高達(dá)90%。國(guó)內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒HCMV-IgG抗體陽(yáng)性率高達(dá)70%～90%[2]。HCMV感染臨床表現(xiàn)差異巨大，考慮與基因相關(guān)，HCMV中含有數(shù)百個(gè)基因型，其中UL144基因型與HCMV的毒力密切相關(guān)，在部分HCMV感染肝功能正?；純后w內(nèi)表達(dá)陰性，是導(dǎo)致嬰幼兒HCMV肝炎的潛在重要因素，但其具體的病理、生理機(jī)制尚不明確。近期本課題組臨床研究證實(shí)嬰幼兒HCMV肝炎與caspase系列蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)凋亡通路密切相關(guān)[3]。本文通過(guò)建立動(dòng)物模型，并檢測(cè)各組中UL144 RNA，caspase-8、caspase-12及Toll樣受體4（TLR4）的蛋白和肝臟細(xì)胞的凋亡情況，探索UL144在HCMV感染肝臟損傷中的內(nèi)在分子機(jī)制。

材料與方法

一、動(dòng)物及分組

取體重為80～100 g健康雄性SD幼鼠 （3～4周齡）24只，均由溫州醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為[SYXK（浙）2016-0061]。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、空載組和實(shí)驗(yàn)組3組，每組各8只?？瞻捉M不作特別處理；空載組尾靜脈注入100μL的空載腺病毒；將344μL病毒原液用0.9%生理鹽水稀釋成1.2 mL，然后每只尾靜脈注入100 mL UL144，滴度為2.0×1012，建立UL144動(dòng)物模型，建立后飼養(yǎng)1周，使藥物效果穩(wěn)定。

二、主要試劑

原位缺口末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（羅氏公司）；鼠濃縮型免疫組化試劑盒 （北京中杉金橋公司）；RT-PCR試劑盒 （Fermentas公司）；Trizol抽提試劑（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），幼鼠UL144基因AAV9型號(hào)：200μL*5（唯真生物科技有限公司）。

三、研究方法

1.取材

實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日，SD幼鼠迅速斷頭處死，取出肝臟右葉，生理鹽水將血液沖洗干凈，每組共得8個(gè)肝臟右葉樣本，每組1～4號(hào)用4%多聚甲醛固定12 h后，石蠟包埋，分別連續(xù)切片，待測(cè)HE、TUNEL；其余均置液氮保存，每組5～8號(hào)用于RT-PCR法檢測(cè)UL144 RNA，ELISA檢 測(cè)caspase-8、caspase-12和TLR4的蛋白表達(dá)。

2.肝臟右葉細(xì)胞HE染色和凋亡檢測(cè)

采用HE染色觀察肝臟右葉細(xì)胞病理改變；采用TUNEL法，按試劑盒提供方法操作。鏡檢細(xì)胞核中綠色熒光者為凋亡細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)算5個(gè)高倍視野（×400）下的凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)（AI）以凋亡細(xì)胞/100個(gè)細(xì)胞（%）表示。

3.RT-PCR法測(cè)定SD幼鼠UL144 RNA的表達(dá)

按照Trizol提取試劑說(shuō)明書(shū)抽提RNA，并測(cè)定RNA濃度，按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作要求在96孔中加入引物 （由上海基康生物工程有限公司合成）、SYBR GreenⅠ、模板、水總體積為20μL，混勻后在羅氏LightCycler480進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，用Lightcycler480 15.0軟件處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.ELISA方法檢測(cè)肝臟組織中caspase-8、caspase-12及TLR4的表達(dá)水平

ELISA試劑盒為美國(guó)PeproTech公司制造；抗caspase-8、caspase-12及TLR4抗體由Abcom公司生產(chǎn)。caspase-8、caspase-12及TLR4的酶聯(lián)免疫試劑盒室溫下放置30 min，每孔加50μL勻漿或標(biāo)準(zhǔn)樣品，留兩孔空白對(duì)照；薄膜蓋住微孔板，孵育2 h；洗板4次，將酶標(biāo)板反轉(zhuǎn)，將洗滌液輕甩干；每孔加50μL抗caspase-8、caspase-12及TLR4抗體并封板，孵育2 h；洗板4次，酶標(biāo)板反轉(zhuǎn)，洗滌液徹底甩干；每孔先后滴入顯色劑A及B，遮光下常溫靜置30 min；滴終止液100μL，在450 nm處檢測(cè)吸光度值（OD）；以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OD值計(jì)算其濃度。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。各組呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HE染色

光鏡下形態(tài)學(xué)變化：實(shí)驗(yàn)組肝臟細(xì)胞出現(xiàn)變性，細(xì)胞核濃縮，深染增加，空白組和空載組基本正常（詳見(jiàn)圖1）。

圖1 三組幼鼠肝臟的HE染色(HE染色，×100)

二、肝細(xì)胞凋亡情況

圖2可見(jiàn)，各組間幼鼠離體肝組織細(xì)胞凋亡差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=158.427，P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞的凋亡指數(shù)為7.68±0.37，明顯高于空載組的2.26±0.24及空白組的2.38±0.16（P<0.05），空白組和空載組兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖2 三組幼鼠肝臟的TUNEL檢測(cè)結(jié)果(TUNEL法和DAPI核染檢測(cè)，×400)

三、 肝 臟 組 織 UL144、caspase-8、TLR4 和caspase-12的表達(dá)量

表1可見(jiàn)，三組間幼鼠肝臟內(nèi)的UL144 RNA、caspase-8和TLR4蛋白表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=156.166、97.287和67.624，P均<0.05），其中實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量分別為1.823±0.080、0.305±0.004和0.880±0.068，高于空載組及對(duì)照組（P均<0.05）；空載組的表達(dá)量分別為1.000±0.040、0.104±0.003和0.308±0.004，均高于空白組（P均<0.05）。 三組間幼鼠肝臟組織中caspase-12蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.156，P>0.05）。

表1 各組幼鼠肝臟組織UL144 RNA、caspase-8、TLR4、caspase-12表達(dá)量的比較

討 論

HCMV是一種廣泛分布的機(jī)會(huì)致病性病毒，具有潛伏性感染特點(diǎn)。HCMV含有免疫逃避基因，可干擾宿主自身的細(xì)胞因子系統(tǒng)，影響APC的抗原提呈功能。HCMV感染易引起機(jī)體宿主細(xì)胞凋亡，而HCMV具有許多抗凋亡的機(jī)制和CTL殺傷機(jī)制，使感染細(xì)胞長(zhǎng)期存活[4]。上述方式相互作用使病毒感染后處于靜息平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，病毒大量復(fù)制發(fā)生顯性感染。臨床發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HCMV感染時(shí)，一部分表現(xiàn)為亞臨床型肝炎、黃疸型肝炎、無(wú)黃疸型肝炎、膽汁淤積性肝炎和膽汁淤積癥，大部分僅提示存在HCMV感染[5]；HCMV感染臨床癥狀差異巨大，原因是HCMV中存在與病毒毒力相關(guān)的親嗜性基因，而親嗜性基因如何誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷目前尚未完全明確。

早期研究發(fā)現(xiàn)，巨細(xì)胞病毒ULβ區(qū)基因與巨細(xì)胞病毒的毒力和感染力相關(guān)，但UL144和UL146作用最明顯，如何相關(guān)目前尚未明確[6]。本研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予幼鼠腹腔注射，HCMV UL144蛋白時(shí)，SD幼鼠肝臟細(xì)胞HE染色提示出現(xiàn)不同程度的變性，TUNEL法檢測(cè)出現(xiàn)不同程度的凋亡，提示HCMV UL144基因片段可以導(dǎo)致幼鼠肝細(xì)胞損傷乃至凋亡。先前的研究提示，HCMV感染導(dǎo)致肝功能損傷與caspase系列蛋白密切相關(guān)，caspase系列蛋白成分復(fù)雜，介導(dǎo)的信號(hào)通路很多，例如caspase-9參與介導(dǎo)的線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，caspase-8參與傳遞的細(xì)胞外信號(hào)凋亡通路，caspase-12參與誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[7]。研究提示，HCMV感染可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的激活參與了HCMV感染肝功能的損傷[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UL144蛋白進(jìn)入SD幼鼠體內(nèi)導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷乃至凋亡，但是caspase系列蛋白中介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路激活的caspase-12的表達(dá)與空白組的比較無(wú)明顯差異，提示它與HCMV UL144的感染力與毒力之間不存在相關(guān)性，但不能認(rèn)定UL144與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間無(wú)相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的caspase-8明顯高于另外兩組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且caspase-8是caspase系類蛋白中直接參與細(xì)胞凋亡的，UL144可能通過(guò)激活caspase-8效應(yīng)分子誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。有研究揭示，HCMV感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的整個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)TLR家族蛋白作為炎癥啟動(dòng)器起到重要作用，尤其是TLR4，研究發(fā)現(xiàn)TLR4主要通過(guò)caspase系列蛋白酶的激活起作用[9]。本研究中顯示，相較于其他兩組，實(shí)驗(yàn)組的TLR4表達(dá)明顯升高，提示在病毒感染后，TLR4被激活，介導(dǎo)的caspase-8效應(yīng)分子參與了HCMV感染導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷乃至凋亡的病理生理過(guò)程。

綜上所述，關(guān)于HCMV感染導(dǎo)致肝臟損傷，傳統(tǒng)的一些靶點(diǎn)已經(jīng)滿足不了臨床的需要，亟需尋找確實(shí)可行的研究方向及靶點(diǎn)。本研究從基因片段入手，將炎癥啟動(dòng)因子TLR4以及凋亡效應(yīng)分子caspase-8引入HCMV感染導(dǎo)致肝功能損傷的研究中，并確實(shí)發(fā)現(xiàn)HCMV UL144感染后幼鼠體內(nèi)TLR4和caspase-8表達(dá)出現(xiàn)明顯上升，提示UL144可能通過(guò)激活TLR4并介導(dǎo)caspase-8參與了HCMV感染肝細(xì)胞損傷的病理生理過(guò)程，將為HCMV感染肝損傷提供一個(gè)全新的靶點(diǎn)及理論依據(jù)。但是本文在小鼠體內(nèi)注入U(xiǎn)L144后雖然發(fā)現(xiàn)體內(nèi)一些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，但未通過(guò)抑制劑對(duì)TLR4與caspase-8之間的相關(guān)性進(jìn)行深入研究，將在今后予以觀察。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突