滕淑 蔣茂瑩 祁正紅 趙仕勇 陳海哨 林先耀

1杭州市兒童醫(yī)院感染肝病科 310014；2杭州市兒童醫(yī)院兒童保健科 310014

腸道病毒71型（EV71）是引起兒童手足口病的常見病毒之一，其臨床表現(xiàn)輕重不一，重癥病例進展迅速，病死率高[1-2]。早期識別重癥患兒具有重要的臨床意義，但目前手足口病輕重癥病例的鑒別主要依賴于臨床特征，尚缺乏有效可靠的早期生物學標志物。研究表明，機體在EV71感染后所出現(xiàn)的免疫紊亂以及炎癥反應過度激活可加重手足口病患兒病情[3-4]，趨化因子所介導的炎癥細胞向炎癥病灶的遷移和運動發(fā)揮重要作用[5]，故檢測趨化因子有可能成為預測手足口病患兒病情的潛在指標。本研究通過檢測EV71型手足口病患兒的血清趨化因子水平，探討其與病情輕重程度的關系及其臨床應用價值。

對象與方法

一、研究對象

收集2017年6月至2019年10月杭州市兒童醫(yī)院收治的EV71感染手足口病患兒102例為研究對象。男72例，女30例；發(fā)病年齡0.50～6.67歲，其中發(fā)病年齡＜2歲35例 （34.3%），2～5歲65例（63.7%），＞5歲2例（2.0%）。 參考《手足口病診療指南（2018年版）》中的臨床分型標準[6]，將患兒分為普通組（42例）、重癥組（60例）。同時采用隨機數(shù)字表法隨機選取同期在外科病房住院的非感染、擇期手術的腹股溝疝患兒79例作為對照組，均在其手術前完成靜脈血樣本的采集。EV71手足口病普通組、重癥組及對照組患兒在年齡、性別上的差異均無統(tǒng)計學意義（H=3.107，χ2=3.178，P＞0.05）。 本研究已通過杭州市兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準［倫理審批號：（2019）年倫理（臨研）第（5）號］。 所有研究對象的監(jiān)護人均充分知情，并簽署知情同意書。

研究對象納入標準：（1）手足口病診斷標準符合國家衛(wèi)健委頒布的 《手足口病診療指南 （2018年版）》[6]；（2）實驗室檢測咽拭子EV71核酸陽性；（3）入院時病程≤3 d。排除標準：（1）同時存在其他腸道病毒感染者；（2）合并有結核、腫瘤等引起免疫異常疾病的患者；（3）應用免疫增強劑或免疫抑制劑者。

二、樣本采集

102例手足口病患兒在入院24 h內(nèi)采集咽拭子樣本，置于-20℃冰箱保存。所有咽拭子樣本均在24 h內(nèi)完成EV71核酸檢測。

所有EV71型手足口病患兒及對照組患兒均于入院24 h內(nèi)采集靜脈血樣本2 mL。42例普通組患兒中，18例在其疾病恢復期（即病程第7天）采集第2次靜脈血樣本2 mL；而60例重癥組手足口病患兒中，有24例患兒在其疾病恢復期（即病程第10天）采集第2次靜脈血樣本2 mL。將靜脈血樣本離心，取其上清液，將血清樣本置于-80℃冰箱中保存待檢。

三、病毒核酸檢測

實時熒光定量RT-PCR測定：使用手足口腸道病毒RNA檢測試劑盒 （中山大學達安基因股份有限公司，廣州），在ABI 7500熒光定量PCR儀（AppliedBiology公司，美國）上進行EV71核酸、柯薩奇病毒A組16型（CA16）核酸、腸道病毒通用型核酸載量測定。以107、106、105、104、103拷貝/mL等5個滴度作一條標準曲線，分別以107和103拷貝/mL兩個滴度作為質(zhì)控。檢測結果≥103拷貝/mL為陽性，＜103拷貝/mL為陰性。操作按說明書進行。PCR擴增條件為：42℃25 min，1個循環(huán)；94℃3 min，1個循環(huán)；93℃30 s，55℃45 s，40個循環(huán)。當EV71核酸及腸道病毒通用型核酸檢測陽性，CA16核酸檢測陰性；且腸道病毒通用型病毒載量值和EV71載量值相等時，則可確定為單純EV71感染。

四、趨化因子檢測

采用高通量多因子液相懸浮芯片技術（Luminex xMAP） 及Human Cytokine/Chemokine Panel（Merck Cat No.HCYTMAG-60K-PX41）檢測試劑盒檢測血清樣本中趨化因子水平：Fractalkine、單核細胞趨化蛋白（MCP）-1、巨噬細胞炎性蛋白（MIP）-1α、MIP-1β、MCP-3、巨噬細胞衍生趨化因子（MDC）、IL-8和IFN誘導蛋白10（IP-10）。操作按照說明書進行。

五、統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（QR）］表示。計數(shù)資料用構成比及率表示。多組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；多組間計量資料比較采用非參數(shù)檢驗（非正態(tài)分布），兩組間計量資料的比較采用秩和檢驗（非正態(tài)分布）；使用受試者工作特征（ROC）曲線分析趨化因子指標的診斷效能，選擇預警重癥EV71手足口病的截斷值，比較AUC（ROC曲線下的面積）、靈敏度、特異性和約登指數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、EV71型手足口病普通組、重癥組咽拭子病毒載量的比較

EV71型手足口病普通組EV71載量7×103（5×103～50×103）拷貝/mL， 與重癥組患兒的咽拭子病毒載量35×103（5.5×103～90×103）拷貝/mL比較，差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.478，P＞0.05），提示EV71手足口病患兒的病情輕重程度與咽拭子病毒載量無關。

二、EV71型手足口病普通組、重癥組與對照組入組時血清趨化因子水平

血清MCP-1、MIP-1α、MDC、IL-8和IP-10水平在三組患兒之間的差異有統(tǒng)計學意義（H=130.635、68.018、66.712、126.166和79.337，P均＜0.05）；血清Fractalkine、MIP-1β、MCP-3水平在三組患兒之間的差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。EV71型手足口病普通組、 重癥組的血清MCP-1、MIP-1α、MDC、IL-8和IP-10水平均高于對照組 （普通組：Z=8.973，5.910，6.742，8.580和6.161； 重 癥 組 ：Z=9.981，7.464，7.799，9.624和8.428，P均＜0.05）。EV71型手足口病重癥組與普通組進行比較，EV71型手足口病重癥組的血清MIP-1α和IL-8水平高于普通組（Z=2.207和4.168，P均＜0.05）。EV71型手足口病重癥組與普通組間的血清MCP-1、MDC、IP-10水平差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。詳見表1。

表1 EV71手足口病普通組、重癥組和對照組入組時血清趨化因子水平比較

三、血清趨化因子IL-8、MIP-1α預警重癥EV71手足口病的ROC曲線分析

EV71型手足口病重癥組與普通組間的血清MIP-1α、IL-8水平有顯著差異，進一步繪制ROC曲線顯示：IL-8的AUC為0.743，MIP-1α的AUC為0.629，提示IL-8對重癥EV71手足口病的預警價值高于MIP-1α。IL-8的最佳截斷值（cut off）為1 740 pg/mL，此時約登指數(shù)最大 （0.614），其對應的靈敏度為90.0%，特異性為71.4%。詳見圖1和表2。

圖1 趨化因子IL-8、MIP-1α預警重癥EV71手足口病ROC曲線圖

表2 IL-8、MIP-1α預警重癥EV71手足口病的ROC曲線分析

四、EV71型手足口病患兒急性期與恢復期的血清趨化因子水平比較

24例重癥EV71型手足口病患兒恢復期血清MIP-1α、MDC、IL-8、IP-10水平低于急性期， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。18例普通型EV71型手足口病患兒恢復期血清MCP-1、MDC、IL-8、IP-10水平較急性期有顯著下降（P＜0.05）。詳見表3。

表3 重癥組EV71型手足口病患兒急性期與恢復期血清趨化因子水平的比較

討 論

迄今為止，EV71型手足口病患兒出現(xiàn)重癥并發(fā)癥的機制尚未完全闡明。近年來人們逐漸認識到炎癥反應在EV71感染患兒疾病發(fā)展過程中的重要作用[7]。Fractalkine是趨化因子CX3C亞家族的唯一成員，它可介導趨化，誘導細胞黏附，調(diào)節(jié)細胞生長，參與炎癥免疫應答[8]。MCP-1、MIP-1α、MIP-1β 和MCP-3均屬于趨化因子CC亞家族成員，主要趨化和激活單核細胞、巨噬細胞、T細胞、NK細胞等炎癥相關細胞至炎癥部位，促進炎癥反應進展[9]。MDC是CC亞家族的一種趨化因子，主要促使Th2細胞遷移至炎癥部位，從而引起Th2細胞介導的免疫應答[10]。IL-8和IP-10均屬于CXC亞族成員。IL-8生物學活性主要是趨化T細胞、嗜堿性粒細胞和中性粒細胞等，促進機體的免疫應答[11]。IP-10可促使Th1細胞定向遷移至特定的組織中從而調(diào)節(jié)免疫反應[12]。

本研究顯示，EV71型手足口病普通型組、重癥組的血清MCP-1、MIP-1α、MDC、IL-8和IP-10水平均高于對照組，且重癥組血清MIP-1α和IL-8水平顯著高于普通型組，進一步的ROC曲線分析表明，IL-8對重癥EV71型手足口病的預警價值優(yōu)于MIP-1α，且具有較高的靈敏度和特異性，建議血清IL-8可作為早期預警EV71型手足口病重癥化的一個較好指標。當EV71型手足口病患兒早期血清IL-8>1 740 pg/mL時，要高度警惕該患兒為重癥病例的可能，需密切觀察病情變化，予以積極的診治。諸多研究表明，IL-8與EV71型手足口病患兒病情嚴重程度密切相關[4，13]。本研究結果顯示，無論是重癥還是普通型EV71型手足口病患兒，隨著患兒病情的好轉，血清IL-8表達水平均明顯下降，提示IL-8參與了EV71型手足口病的疾病發(fā)生發(fā)展的過程。

綜上所述，血清IL-8水平與EV71型手足口病患兒病情嚴重程度密切相關，其可作為重癥EV71型手足口病的一個較好的預警指標。但本研究樣本量偏小，結果可能具有一定局限性，也未能連續(xù)動態(tài)觀察趨化因子變化趨勢，有待進一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突