吳燁飛,陸建衛(wèi),沈 波,俞海燕,俞東方,祝金山

(浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司,浙江 嘉興 314400)

核黃素(Riboflavin)又名維生素B2,化學(xué)名稱7,8-二甲基-10-(D-1-核糖基)異咯嗪,分子式C17H20N4O6,是一種人和動植物必需的水溶性維生素[1],在醫(yī)藥行業(yè)[2]、養(yǎng)殖業(yè)[3]和種植業(yè)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[4]。目前,微生物發(fā)酵法是唯一被采用的核黃素工業(yè)化生產(chǎn)方法,常用的生產(chǎn)菌有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、棉囊阿舒霉(Ashbyagossypii)、無名假絲酵母(Candidafamata)及阿舒假囊酵母(Eremotheciumashbya),均采用對氧氣需求量極高的高密度發(fā)酵工藝[5]。高密度發(fā)酵應(yīng)用廣泛,對溶氧要求高[6-7],工業(yè)上通常采用更改發(fā)酵罐徑高比、增大通氣量、改變攪拌方式等方法增加溶氧,但這些方法不利于企業(yè)控制生產(chǎn)成本,且未從根本上解決核黃素高密度發(fā)酵供氧不足的問題[8]。目前,國內(nèi)外對發(fā)酵生產(chǎn)核黃素的研究主要集中在菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化等方面,對如何改善核黃素發(fā)酵過程中的高需氧量問題鮮有報道[9]。

氧載體是一類對細胞沒有毒性,比水具有更高溶氧量,且與水不互溶的有機化合物。在液態(tài)發(fā)酵體系中加入氧載體,可以降低氧氣的傳質(zhì)阻力,改善溶氧環(huán)境,有利于發(fā)酵水平的提高[10]。任東雪等[11]在γ-聚谷氨酸發(fā)酵體系中添加體積分數(shù)10%的聚二甲氧基硅烷(PDMS),使菌體OD600提高了3～5倍,產(chǎn)量提高了39%。王爽等[12]研究發(fā)現(xiàn):在納他霉素發(fā)酵體系中加入體積分數(shù)6%的吐溫80可促進菌體生長,同時提高納他霉素產(chǎn)量82.6%。通過添加氧載體改善核黃素發(fā)酵體系溶氧環(huán)境以提高核黃素發(fā)酵水平的研究尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌 種

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)QJVB-1,浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司保藏菌種。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,玉米漿干粉6 g/L,尿素2 g/L,pH 6.5～6.7。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基/5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖40 g/L,黃豆粉10 g/L,玉米漿干粉10 g/L,NaCl 2.5 g/L,pH 6.5～6.7。

5 L罐補料培養(yǎng)基:50%(質(zhì)量分數(shù))葡萄糖。

1.1.3 儀 器

5 L發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備工程有限公司;SGD-4全自動還原糖測定儀,山東生物傳感器重點實驗室;紫外分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 發(fā)酵實驗

種子培養(yǎng):將甘油管保存的B.subtilisQJVB-1自然解凍,吸取0.5 mL接至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶,于培養(yǎng)箱中200 r/min,37 ℃培養(yǎng)20 h。

搖瓶發(fā)酵:按體積分數(shù)5%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶,于恒溫培養(yǎng)箱中200 r/min,37 ℃培養(yǎng)72 h,定時取樣測定發(fā)酵液中的生物量、葡萄糖質(zhì)量濃度及核黃素質(zhì)量濃度。

5 L罐發(fā)酵:接種量5%(體積分數(shù)),起始裝液量50%,控制通氣量1 L/min,溶氧20%～40%,pH 6.4～6.6,37 ℃培養(yǎng)72 h,發(fā)酵過程中通過補料控制還原糖質(zhì)量分數(shù)為0.8%～1.0%。定時取樣測定葡萄糖質(zhì)量濃度、核黃素質(zhì)量濃度和生物量等數(shù)據(jù)。

1.2.2 氧載體添加實驗

1)氧載體種類對核黃素發(fā)酵的影響

按體積分數(shù)5%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基。在發(fā)酵4 h時往發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加體積分數(shù)1%的豆油、正十六烷、油酸乙酯和吐溫80,對照組不添加氧載體(體積用蒸餾水補足),繼續(xù)搖瓶發(fā)酵至72 h,發(fā)酵結(jié)束后,以各組發(fā)酵液中核黃素質(zhì)量濃度及生物量為指標(biāo),挑選出優(yōu)選氧載體。

2)氧載體添加量對核黃素發(fā)酵的影響

按體積分數(shù)5%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基,在發(fā)酵4 h時分別添加體積分數(shù)0%,1%,2%,3%,4%,5%,6%的優(yōu)選氧載體,繼續(xù)搖瓶發(fā)酵至72 h,發(fā)酵結(jié)束后,測定各組發(fā)酵液中的核黃素質(zhì)量濃度及生物量。

3)氧載體添加時間對核黃素發(fā)酵的影響

按體積分數(shù)5%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基,分別于發(fā)酵0,4,8,16,20 h時添加適量優(yōu)選的氧載體,繼續(xù)搖瓶發(fā)酵至72 h,發(fā)酵結(jié)束后,測定各組發(fā)酵液中的核黃素質(zhì)量濃度及生物量。

1.2.3 相關(guān)測定方法

1)生物量測定

采用平板菌落計數(shù)法測定發(fā)酵液中活菌數(shù)作為生物量的指標(biāo)。

2)還原糖測定[13]

取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL EP管,10 000 r/min離心3 min,取上清液,使用SGD-4全自動還原糖測定儀測定還原糖。

3)核黃素測定[14]

取發(fā)酵液1 mL于100 mL燒杯,加入2 mL冰醋酸和20 mL水,加熱煮沸5 min,加適量水,冷卻至室溫后移入250 mL容量瓶并定容。搖勻后過濾,取濾液用分光光度計于444 nm條件下比色測定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算核黃素質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

準(zhǔn)確稱取100 mg核黃素標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL燒杯,加入5 mL冰醋酸和20 mL水,緩慢加熱使之完全溶解,用水稀釋至5,10,15,20,25 mg/L,在波長444 nm下測定吸光值。以核黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),得到的線性回歸方程為y=0.03x+0.008,相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6,說明在5～25 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 核黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同氧載體對核黃素搖瓶發(fā)酵的影響

氧載體種類不同,不僅對發(fā)酵體系溶氧環(huán)境的改善能力不同,對微生物生長的影響也不同[15]。按1.2.2方法進行實驗,考察了不同氧載體對核黃素搖瓶發(fā)酵的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 不同氧載體對B.subtilis QJVB-1 生長及核黃素合成的影響

由圖2可知:與對照組(未添加氧載體)相比,添加體積分數(shù)1%的豆油實驗組和乙酸乙酯實驗組顯示出較高的菌體生物量和較強的核黃素生產(chǎn)能力。其中,豆油組生物量為1.14 Gcfu/L,較對照組提高18.8%,核黃素質(zhì)量濃度11.3 g/L,較對照組提高17.7%;油酸乙酯組生物量為1.1×109cfu/L,較對照組提高14.6%,核黃素質(zhì)量濃度10.9 g/L,較對照組提高17.7%。說明豆油和油酸乙酯在核黃素發(fā)酵體系中,可以降低氧氣的傳質(zhì)阻力,有利于菌體生長以及核黃素的合成。吐溫80實驗組及正十六烷實驗組的菌體生物量及核黃素質(zhì)量濃度較對照組均有不同程度的降低,說明在實驗條件下添加1%體積分數(shù)的吐溫80和正十六烷不利于核黃素生產(chǎn)菌QJVB-1的生長和代謝。

2.3 氧載體添加量對核黃素搖瓶發(fā)酵的影響

李娜娜等[16]研究發(fā)現(xiàn)過量的液態(tài)烷烴不利于粘紅酵母發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素,說明液體發(fā)酵體系中,氧載體濃度對菌體生長及目標(biāo)產(chǎn)物的合成至關(guān)重要。綜合2.2的研究結(jié)果,比較了在發(fā)酵4 h添加不同濃度豆油和乙酸乙酯對菌體生長及核黃素合成的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 氧載體添加量對B.subtilis QJVB-1 生長及核黃素合成的影響

豆油實驗組結(jié)果表明:添加量為0%～5%時,菌體生物量及核黃素質(zhì)量濃度均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢,體積分數(shù)1%的添加量最有利于菌體生長及核黃素的合成,此時生物量為1.28×109cfu/L,核黃素質(zhì)量濃度為11.4 g/L,分別較未添加豆油的對照組提高17.9%和18.0%。油酸乙酯實驗組表明:體積分數(shù)2%的添加量最適合菌體生長及核黃素的合成,其中菌體生物量較對照組提高18.5%,核黃素質(zhì)量濃度較對照組提高20.2%,當(dāng)添加量超過2%時,菌體生物量及核黃素質(zhì)量濃度均呈下降趨勢。結(jié)果表明:過量添加豆油和油酸乙酯會抑制QJVB-1菌的生長,不利于核黃素的合成。造成這種現(xiàn)象的可能原因是:過量添加油狀的氧載體,會使發(fā)酵液表層形成過厚的“油膜”,造成表觀黏度增大,不利于發(fā)酵液和空氣之間的氧氣傳遞,進而對菌體生長及核黃素的合成造成不利影響。

2.4 氧載體添加時間對核黃素搖瓶發(fā)酵的影響

綜合2.3節(jié),考察不同時間添加豆油或油酸乙酯對菌體生長和核黃素合成的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 氧載體添加時間對B.subtilis QJVB-1 生長及核黃素合成的影響

豆油實驗組結(jié)果表明:發(fā)酵4 h時添加體積分數(shù)1%的豆油表現(xiàn)出最強的核黃素合成能力。油酸乙酯實驗組結(jié)果表明:發(fā)酵0 h時添加體積分數(shù)2%的油酸乙酯對菌體生長的促進能力最強,且核黃素質(zhì)量濃度最高,達到13.0 g/L。氧載體添加時間在發(fā)酵8 h及更遲時,豆油實驗組及油酸乙酯實驗組的生物量及核黃素質(zhì)量濃度下降趨勢明顯,造成這種現(xiàn)象的可能原因是:在高密度發(fā)酵生產(chǎn)核黃素過程中,菌體生長迅速,在發(fā)酵初期就需要大量氧氣,較早加入氧載體可以更好地滿足發(fā)酵前期菌體生長所需氧氣,從而有利于菌體生長及核黃素的合成。發(fā)酵8 h及更遲的氧載體添加時間,添加時間過晚,不能滿足前期菌體生長對溶氧的需求。

綜合考慮豆油、油酸乙酯的添加量和添加時間對菌體生物量及核黃素合成能力的不同影響,確定在生產(chǎn)菌QJVB-1發(fā)酵生產(chǎn)核黃素的液體發(fā)酵體系中,0 h時添加體積分數(shù)2%的油酸乙酯為優(yōu)選的氧載體添加方案。

2.5 優(yōu)選氧載體添加方案下的核黃素搖瓶發(fā)酵曲線

比較添加優(yōu)選氧載體和未添加氧載體條件下的QJVB-1搖瓶發(fā)酵曲線,結(jié)果見圖5。

圖5 油酸乙酯添加對B.subtilis QJVB-1核黃素搖瓶發(fā)酵的影響

由圖5可知:在發(fā)酵周期內(nèi),添加油酸乙酯實驗組的耗糖能力更強,生物量和核黃素質(zhì)量濃度較對照組均有大幅度提高,其中最高生物量提高17.9%,核黃素終質(zhì)量濃度提高26.7%,達到12.1 g/L。原因可能是:核黃素作為一種代謝產(chǎn)物,與生長具有相關(guān)性,菌體的生長速度、生物量和代謝強度均直接影響核黃素的生成。油酸乙酯改善了發(fā)酵環(huán)境中的溶氧,有利于核黃素生產(chǎn)菌QJVB-1的生長,提高了核黃素的生產(chǎn)能力。

2.6 優(yōu)選氧載體添加方案下的5 L罐核黃素發(fā)酵曲線

發(fā)酵罐最常用的溶氧控制手段為調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度。在恒定通氣量條件下,考察核黃素發(fā)酵過程中氧載體對攪拌速度和溶氧關(guān)系的影響,結(jié)果見圖6,對照組(不添加氧載體)為保證高密度發(fā)酵過程中的高溶氧環(huán)境,發(fā)酵罐攪拌速度調(diào)至800 r/min(設(shè)備的最高轉(zhuǎn)速),但在發(fā)酵24 h時溶氧仍降至10%以下,發(fā)酵中后期溶氧也只能維持在20%。添加氧載體油酸乙酯后,以速度500 r/min攪拌就可在發(fā)酵24 h時溶氧達到20%,在發(fā)酵中后期將攪拌速度降至400 r/min也能維持溶氧為30%,滿足菌體生長的需求,說明添加氧載體可以改善發(fā)酵體系的溶氧量。較低的攪拌速度不僅可以降低攪拌剪切力對菌體的影響,也可降低能耗。

圖6 油酸乙酯添加對攪拌速度及溶氧的影響

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵曲線見圖7,添加油酸乙酯后,發(fā)酵30 h時達到最大菌體生物量2.51 Gcfu/L,較對照組提高13.5%。核黃素終質(zhì)量濃度達到24.3 g/L,較對照組提高12.6%。

圖7 油酸乙酯添加對5 L罐中B.subtilis QJVB-1核黃素發(fā)酵的影響

3 結(jié) 論

通過搖瓶實驗比較了氧載體不同種類、添加量及添加時間對核黃素發(fā)酵的影響,確定發(fā)酵0 h時添加體積分數(shù)2%的油酸乙酯為優(yōu)選氧載體添加方案。在優(yōu)選氧載體添加條件下,搖瓶發(fā)酵核黃素質(zhì)量濃度為12.1 g/L,較對照提高26.7%;5 L罐發(fā)酵核黃素質(zhì)量濃度為24.3 g/L,較對照提高12.6%。同時,油酸乙酯對溶氧環(huán)境的改善降低了發(fā)酵過程中的攪拌速度,有利于降低攪拌剪切力對菌體的不良影響,并能為核黃素生產(chǎn)企業(yè)節(jié)能降耗。研究對核黃素生產(chǎn)成本的降低和產(chǎn)能的提高具有一定的意義。