陽(yáng)莉，丘秀生，胡元，陳曉燕，陳偉材，盧建溪*

（1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物治療中心，廣州510000； 2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院疫苗研究所，廣州510000；3東莞長(zhǎng)安港灣醫(yī)院內(nèi)科，東莞 523000）

自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell, NK細(xì)胞）是機(jī)體內(nèi)的固有免疫細(xì)胞，負(fù)責(zé)殺傷老化、受病毒感染、腫瘤等異常細(xì)胞，并且無(wú)MHC限制性，它能自己識(shí)別和攻擊外來(lái)病毒、癌細(xì)胞和異常細(xì)胞[1～3]。目前，NK細(xì)胞不僅廣泛用于腫瘤病人的免疫治療，還可應(yīng)用于預(yù)防腫瘤發(fā)生及提高亞健康人群生活質(zhì)量[4]。

檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性是評(píng)估體外培養(yǎng)的NK細(xì)胞生物學(xué)功能的主要方法。目前檢測(cè)細(xì)胞毒性的方法有同位素釋放法、MTT法、CCK-8法、LDH釋放法、Calcein-AM釋放法和流式細(xì)胞術(shù)等方法。同位素的方法對(duì)設(shè)備要求較高，費(fèi)用較高，操作繁瑣，又存在放射性污染的問(wèn)題，使其推廣使用受到限制；而酶反應(yīng)比色法容易受各種因素影響致結(jié)果出現(xiàn)較大差異，重復(fù)性不佳；流式細(xì)胞技術(shù)可在單細(xì)胞水平分析細(xì)胞的自然凋亡和靶細(xì)胞的死亡，是近幾年發(fā)展的一種方法[5～7]。本研究選取流式細(xì)胞術(shù)和LDH的方法檢測(cè)體外培養(yǎng)的NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，優(yōu)化了細(xì)胞濃度和效靶細(xì)胞比，為NK細(xì)胞功能評(píng)估提供穩(wěn)定可靠的檢測(cè)方案。

材料與方法

1 樣本來(lái)源

白血病細(xì)胞株K562為本實(shí)驗(yàn)室保存。14例腫瘤患者外周血均來(lái)自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院，其中男7例，女7例，年齡40～85歲，平均年齡（59.57 ± 3.38）歲，所有患者均簽署知情同意書。

2 主要儀器與試劑

ALYS505NK-AC培養(yǎng)液和ALYS505NK-EX培養(yǎng)液（日本CSTI公司），RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），重組人白細(xì)胞介素2（山東泉港藥業(yè)），人淋巴細(xì)胞分離液（挪威Axis-shield公司），赫賽汀（美國(guó)Roche公司），淋巴細(xì)胞檢測(cè)試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3（美國(guó)Beckman Coulter公司），PI溶液（美國(guó)Sigma公司），羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidy ester，CFSE）（美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司），LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），流式細(xì)胞分析儀為 CytoFLEX（美國(guó)Beckman Coulter公司），酶標(biāo)儀為 Spark 10M（瑞士TECAN公司），離心機(jī)為Centrifuge 5810R（德國(guó)Eppendorf公司），二氧化碳培養(yǎng)箱240i（美國(guó)Thermo Scientific公司）。

3 細(xì)胞培養(yǎng)

3.1 K562細(xì)胞株培養(yǎng)

白血病細(xì)胞株K562培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3d換液。

3.2 NK細(xì)胞培養(yǎng)

用肝素鈉抗凝管采集14份靜脈血，密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用 ALYS505NK-AC培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為（1～3）×106個(gè)/ml，加入預(yù)先用赫賽汀包被好的培養(yǎng)瓶中，37. 5℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔3d用ALYS505NK-EX培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)液。培養(yǎng)14d后，收獲細(xì)胞，使用淋巴細(xì)胞檢測(cè)試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3在流式細(xì)胞儀上測(cè)定NK細(xì)胞（CD3－CD56+）含量。

4 NK細(xì)胞的殺傷功能檢測(cè)

4.1 LDH釋放法

培養(yǎng)14d后，對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行殺傷功能檢測(cè)。以K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，濃度調(diào)整為1.0×105個(gè)/ml，按100μl/孔接種于96孔板；以NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，濃度調(diào)整為4×106個(gè)/ml，然后進(jìn)行倍比稀釋，每組效應(yīng)細(xì)胞濃度分別為4×106個(gè)/ml、2×106個(gè) /ml、1×106個(gè) /ml和 5×105個(gè) /ml，按 100μl/孔接種于96孔板，最終效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例（效靶比）（effective target ratio, E/T ratio）分別為40:1、20:1、10:1和5:1，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞自然釋放對(duì)照組和最大釋放對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；250×g，離心5min后，將該96孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4h。取出 96 孔板，400×g，離心 5min，取 120μl上清液，加入到一新96孔板相應(yīng)孔中，按LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

計(jì)算公式為：靶細(xì)胞殺傷率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-靶細(xì)胞自然釋放孔OD值）/（靶細(xì)胞最大釋放孔OD值-靶細(xì)胞自然釋放孔OD值）×100%。

4.2 CFSE/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)

標(biāo)記靶細(xì)胞：K562細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×106個(gè)/ml，加入熒光染料CFSE對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，37℃避光，染色20min；加5倍體積預(yù)冷的含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，冰浴5min，終止染色；調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×105個(gè)/ml。共培養(yǎng)：加入NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，每組效應(yīng)細(xì)胞數(shù)目分別為4×106個(gè)/ml、2×106個(gè) /ml、1×106個(gè) /ml和 5×105個(gè) /ml，最終效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例分別為40:1、20:1、10:1和5:1，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞對(duì)照孔，250×g，離心5min后，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4h；熒光染料PI標(biāo)記死亡細(xì)胞，4℃避光，染色30min；用CytoFLEX流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析。

計(jì)算公式： 靶細(xì)胞殺傷率=（靶細(xì)胞死亡率－靶細(xì)胞自發(fā)死亡率）/（100-靶細(xì)胞自發(fā)死亡率）×100%。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組靶細(xì)胞殺傷率用表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)均數(shù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05代表差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CFSE對(duì)靶細(xì)胞高效標(biāo)記

從培養(yǎng)第5d開始，細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定NK細(xì)胞含量顯示，CD3-/CD56+細(xì)胞第0d時(shí)比例為16.14%±2.07%，培養(yǎng)至第14d時(shí)，CD3-/CD56+細(xì)胞的比例為72.56 %± 4.14%，人外周血NK細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)增殖后，純度較高（圖1）。

靶細(xì)胞經(jīng)過(guò)預(yù)先標(biāo)記，可明顯與效應(yīng)細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。靶細(xì)胞未標(biāo)記時(shí)有少量的自發(fā)熒光（8.07%）；靶細(xì)胞經(jīng)CFSE染色后，37℃、5% CO2培養(yǎng)4h，部分細(xì)胞發(fā)生增殖，熒光分子隨細(xì)胞分裂分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中，故出現(xiàn)兩個(gè)峰，可見(jiàn)靶細(xì)胞的標(biāo)記率達(dá)99.35%。與效應(yīng)細(xì)胞共孵育后，能夠顯著地與未標(biāo)記的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分（圖2）。

圖1 PBMCs培養(yǎng)前后NK細(xì)胞純度比較。A，培養(yǎng)前；B，培養(yǎng)至14d時(shí)Fig.1 Comparison of the purity of NK cells before and after PBMCs culture. A, before culture; B, after cultured for 14d

圖2 CFSE對(duì)靶細(xì)胞標(biāo)記率。A，未標(biāo)記；B，CFSE標(biāo)記Fig. 2 CFSE labeling rate of target cells. A, unlabeled cells; B, CFSE labeled cells

2 10:1效靶比時(shí)LDH法替代流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞體外殺傷效能

靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞混合孵育后，于倒置顯微鏡下觀察，效靶細(xì)胞比為5:1時(shí)，細(xì)胞之間不能有效接觸；效靶細(xì)胞比為10:1時(shí)，細(xì)胞接觸良好且細(xì)胞團(tuán)很少；效靶比為20:1時(shí)，細(xì)胞雖接觸良好但細(xì)胞團(tuán)較多；效靶細(xì)胞比為40:1時(shí)，大量細(xì)胞聚集成團(tuán),細(xì)胞團(tuán)太多太大，效靶細(xì)胞反而不能有效接觸。因此靶細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，效靶比為10:1的細(xì)胞密度比較合適（圖3）。

流式細(xì)胞術(shù)CFSE/PI雙色熒光標(biāo)記法以CFSE+細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門（圖4中P1門），分析該群細(xì)胞PI+的細(xì)胞，CFSE+PI－為正常靶細(xì)胞，CFSE+PI+為死亡的靶細(xì)胞（圖4中P3門）。LDH法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)白血病K562細(xì)胞株的殺傷活性顯示，效靶比越大，其殺傷活性越強(qiáng)；其中在5:1低效靶比時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)出的細(xì)胞殺傷活性明顯高于LDH釋放法，在10:1、20:1和40:1高效靶比時(shí)，兩種方法檢出的靶細(xì)胞死亡率無(wú)顯著差異（表1）。

圖3 不同效靶比下的細(xì)胞形態(tài)。A，5:1；B，10:1；C，20:1；D，40:1；箭頭，細(xì)胞團(tuán)；比例尺，100μmFig.3 Cellular morphology at different E/T ratios. A, 5:1; B, 10:1; C, 20:1; D, 40:1; arrow, cell mass; scale bar, 100μm

討 論

過(guò)繼免疫療法是取患者自體淋巴細(xì)胞或免疫力強(qiáng)的供者淋巴細(xì)胞，經(jīng)體外活化、擴(kuò)增后，再回輸入患者體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用。NK細(xì)胞由于獨(dú)特的抗腫瘤特點(diǎn)，在腫瘤免疫中的作用越來(lái)越受到重視[8-11]。鑒于NK細(xì)胞治療的廣闊應(yīng)用前景，亟需建立一種高效的NK細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)量評(píng)估的方法，以滿足臨床應(yīng)用的需要。由于腫瘤患者普遍年齡偏大且免疫功能低下，外周血NK細(xì)胞比例更低、含量更少且活性較差，體外培養(yǎng)CD3－CD56+細(xì)胞比例也較低。

通常根據(jù)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用來(lái)評(píng)估NK細(xì)胞的生物學(xué)功能，目前的檢測(cè)方法有很多種，各有優(yōu)缺點(diǎn)。通過(guò)檢測(cè)從細(xì)胞膜破裂的細(xì)胞釋放到培養(yǎng)液中的LDH活性，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞毒性的定量分析。LDH釋放法被認(rèn)為是傳統(tǒng)的51Cr釋放法進(jìn)行細(xì)胞膜完整性檢測(cè)的安全有效的替代方法。

CFSE是一種穿透細(xì)胞膜的熒光染料，進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFSE熒光可分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度大約是親代細(xì)胞的一半，利用流式細(xì)胞儀在488nm 激發(fā)光和FL1檢測(cè)通道可對(duì)其進(jìn)行分析，可用于細(xì)胞示蹤和細(xì)胞增殖研究，同時(shí)也用于細(xì)胞毒活性的測(cè)定[12]。用CFSE標(biāo)記活細(xì)胞，熒光在細(xì)胞中維持時(shí)間長(zhǎng)、不易衰減、穩(wěn)定，且對(duì)細(xì)胞生理活動(dòng)沒(méi)有影響，對(duì)靶細(xì)胞的標(biāo)記率高，熒光強(qiáng)度強(qiáng)，可在流式細(xì)胞儀的FL-1通道檢測(cè)。PI是一種核酸染料，它不能通過(guò)活細(xì)胞膜，卻能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色在合適波長(zhǎng)激發(fā)光的激發(fā)下發(fā)出明亮的紅色熒光，可在流式細(xì)胞儀的FL-2通道檢測(cè)。CFSE/PI雙色熒光染料標(biāo)記，能同時(shí)對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞染色，可有效區(qū)分靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞以及靶細(xì)胞的自發(fā)凋亡和死亡[13]。

圖4 CFSE/PI法流式細(xì)胞術(shù)檢不同效靶比時(shí)NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞毒作用Fig. 4 Flow cytometric analysis (CFSE/PI) for cytotoxicity of NK cells to K562 cells at different E/T ratios

表1 兩種方法檢測(cè)NK細(xì)胞在不同效靶比下對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用Tab.1 Cytotoxicity of NK cells against target cells at different E/T ratios detected by the two different detection methods

本文比較了LDH釋放法及流式細(xì)胞術(shù)CFSE/PI雙色熒光標(biāo)記法在不同效靶比的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并探討了LDH法和流式細(xì)胞術(shù)的最佳實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果表明，LDH法加入顯色試劑后隨反應(yīng)時(shí)間的增加其OD值逐漸增加，30min 以后OD值已不在檢測(cè)范圍內(nèi)，最佳檢測(cè)時(shí)間為加入反應(yīng)試劑后25～30min，時(shí)間要嚴(yán)格控制，否則結(jié)果誤差很大。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著效靶比的增加，其結(jié)果變異越大，當(dāng)效靶比為20:1和40:1時(shí)，開始出現(xiàn)OD值超出范圍的情況，分析認(rèn)為當(dāng)效靶比越高的時(shí)候，效應(yīng)細(xì)胞貢獻(xiàn)越多的LDH，使結(jié)果產(chǎn)生較大誤差[14]?？梢?jiàn)，LDH 法雖是常用測(cè)定細(xì)胞毒活性的簡(jiǎn)便方法，具有經(jīng)濟(jì)、快速且需要樣本量少等優(yōu)點(diǎn)，但該方法易受溫度、培養(yǎng)液和反應(yīng)時(shí)間等因素的影響而導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差。流式細(xì)胞術(shù)相對(duì)耗時(shí)較長(zhǎng)，操作較繁瑣，優(yōu)點(diǎn)是可以明確區(qū)分效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞及凋亡和死亡細(xì)胞，是一種靈敏、特異 、經(jīng)濟(jì)和穩(wěn)定的檢測(cè) NK 細(xì)胞毒性的方法。綜合比較這兩種方法體外檢測(cè)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)，在較高的效靶比和較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用下（10:1、20:1、40:1），兩種方法對(duì)靶細(xì)胞死亡率檢出的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但在效靶比弱細(xì)胞毒情況下（5:1），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)靶細(xì)胞死亡率要高于LDH法，具有重復(fù)性好、靈敏度高等特點(diǎn)。

綜上所述，在體外評(píng)估NK細(xì)胞的殺傷功能實(shí)驗(yàn)中，考慮到所需要的樣本細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞團(tuán)的聚集程度以及顯色反應(yīng)的準(zhǔn)確度，最優(yōu)的效靶細(xì)胞比為10:1。在效靶比為10:1時(shí)，LDH釋放法及CFSE/PI雙染色法均可用來(lái)檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性，在其他效靶比情況下，流式細(xì)胞術(shù)要優(yōu)于LDH釋放法。