李婧 ，崔自明 ，陳雅卓 ，張燕*

（1西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心，西安710061；2解放軍總醫(yī)院光明橋門診部，北京100061)）

卵巢癌是女性生殖系統最常見的腫瘤之一，也是惡性程度和致死率最高的婦科腫瘤[1]。卵巢癌患者發(fā)病早期因缺乏特異性癥狀和體征，導致卵巢早期診斷非常困難，70%的卵巢癌患者確診時已屬晚期[2]。盡管目前臨床上針對卵巢癌的外科手術和藥物治療已相對成熟，但卵巢癌患者的五年生存率僅為30%，治療和預后效果極差，嚴重影響女性的健康和生命[3,4]。

目前臨床上卵巢癌的獨立預后指標主要包括FIGO分期、病理類型、腫瘤分化程度、是否有腹腔轉移/淋巴結轉移等臨床特征，除此之外，卵巢癌相關基因，即卵巢癌腫瘤標志物的表達在卵巢癌預后判斷中的價值也日益受到人們重視[5,6]。血清CA125是卵巢癌的經典腫瘤標志物，由于CA125在其他多種良性疾病患者血清中往往也呈現高表達狀態(tài)，作為卵巢癌腫瘤標志物的特異性不足，因此目前臨床上CA125主要用于評價治療效果和檢測復發(fā)。目前，對卵巢癌的腫瘤標志物進行了大量研究，但仍缺乏有效且特異性的腫瘤標志物候選分子[7]。

神經纖毛蛋白1（neuropilin 1, NRP1）是一種單次跨膜糖蛋白，起初在非洲爪蟾神經系統中被發(fā)現[8]。NRP1蛋白通過識別其配體神經軸突蛋白3（semaphorins 3, Sema 3）家族和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）家族[9]，在神經調節(jié)、免疫調節(jié)、腫瘤發(fā)生等生理病理過程中發(fā)揮重要功能[10-12]。本研究分析了NRP1表達與卵巢癌患者病理分型、臨床分期等病理特征的相關性，以期通過檢測NRP1表達為臨床上卵巢癌的治療和干預方案提供指導。

材料與方法

1 材料

卵巢癌細胞系SKOV3為本實驗室保存。收集我院2013年至2019年120例卵巢癌組織標本，均經病理切片證實為卵巢癌，其中64例漿液性腺癌，15例粘液性腺癌，10例子宮內膜樣腺癌，10例透明細胞癌，21例生殖細胞腫瘤/間質細胞腫瘤等其他類型卵巢癌。納入標準為：①術后經病理科確診為卵巢癌；②術前未接受化放療；③無其他癌癥、盆腔炎癥及卵巢相關疾病病史。收集患者的年齡、組織學類型、分化程度、分期、腫瘤轉移等臨床資料。大部分卵巢癌患者行手術時已屬晚期，僅收取到配對的癌旁組織23例。病理分化程度按WHO 病理分化標準，臨床分期按2014年FIGO指南。上述標本均為常規(guī)石蠟包埋的存檔蠟塊。另收集4例手術切除的新鮮卵巢癌組織及配對癌旁組織標本。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibico公司；兔抗人NRP1單克隆抗體購自美國Abcam公司；生物素標記山羊抗兔IgG二抗、生物素-鏈霉卵白素免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司；Fast 200 RNA提取試劑盒購自上海飛捷公司；反轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒均購自日本TAKARA公司。

2 細胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出SKOV3卵巢癌細胞凍存管，迅速置于37℃水浴中，輕柔搖晃使其盡快融化，轉移細胞懸液至離心管中，加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，輕柔混勻后1000r/min低速離心5min，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，混合均勻后轉移至培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后更換新鮮培養(yǎng)基，隨后每隔2d傳代1次。

3 免疫熒光

SKOV3卵巢癌細胞用4%多聚甲醛固定，加入0.1% Triton X-100透化5min；加入10%山羊血清室溫封閉20min，PBS漂洗后加入一抗4°C孵育過夜，加入TRITC標記的抗兔二抗，室溫孵育1h；加入細胞核染料 (4’, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)，室溫孵育5min，熒光顯微鏡下觀察。

4 mRNA實時定量PCR分析

組織充分研磨后，利用RNA提取試劑盒提取組織總RNA，定量后取2μg RNA進行反轉錄。cDNA樣本稀釋后用實時熒光定量試劑盒檢測NRP1 mRNA水平。目的基因NRP1引物序列：5’-AGGACCATACAGGAGATGGC-3’，5’-AATAGACCACAGGGCTCACC-3’；內參基因GAPDH引物序列：5’-TTCGACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’，5’-CAGGCGCCCAATACGACCAAATC-3’。使用Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀、TAKARA SYBR Premix Ex Taq II（DRR820A）試劑進行熒光定量PCR擴增。PCR反應體系為25μl，含12.5μl SYBR PCR緩沖液，上下游引物各1μl（引物濃度10μmol/L)。PCR反應條件為：95℃ 30s，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共40 個循環(huán)。擴增完成后采用2-△△CT法進行實驗數據分析。

5 蛋白免疫印跡分析

組織充分研磨后加入RIPA細胞裂解液（1%Triton X-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS，0.15mol/L NaCl，50mmol/L Tris pH7.4，2mmol/L焦磷酸鈉，25mmol/L β-甘油磷酸脂，1mmol/L EDTA，1mmol/L Na3VO4，0.5μg/ml亮抑酶肽），RIPA裂解液在使用前，按1:100的稀釋比例加入100×蛋白酶抑制劑Cocktail與100×磷酸酶抑制劑Cocktail混勻。冰上裂解30min，期間渦旋振蕩3～5次。4℃條件下12000r/min離心20 min，吸取上清液，測定蛋白濃度后，按照相應比例加入5×上樣緩沖液，充分混勻并100℃ 10min。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，電轉移到PVDF膜上。轉膜后，用5%脫脂奶緩沖液封閉PVDF膜1h，分別加入稀釋的NRP1抗體、actin內參抗體，4℃過夜。TBST洗膜液洗膜5次，辣根過氧化酶標記的兔二抗室溫孵育1h，TBST洗膜液洗膜5次。ECL發(fā)光，顯色后顯影、定影。曝光后 X光片用Quantity One軟件進行分析。

6 免疫組織化學染色

卵巢癌組織標本切片65℃烤片1h，分別置于二甲苯溶液 I、II 中15min脫蠟。取出切片，置于梯度乙醇中水化。微波法枸櫞酸鈉抗原修復15min后加入內源性過氧化物酶阻斷劑孵育10min。自然冷卻至室溫，加入山羊血清工作液室溫封閉30min。加入一抗4℃孵育過夜。次日加入生物素化二抗室溫孵育30min。加入辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。顯微鏡下DAB顯色30s，自來水充分沖洗。蘇木精復染后進行透明，脫水，封片。免疫組織化學染色圖像分析由兩位獨立研究者評估。

7 統計學處理

所有研究數據使用 SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結 果

1 卵巢癌細胞系表達NRP1

處于生長對數期的SKOV3卵巢癌細胞經4%多聚甲醛固定后，進行免疫熒光檢測顯示： NRP1在SKOV3卵巢癌細胞中呈強陽性表達，主要定位于細胞質和細胞膜（圖1）。由此提示，NRP1可能在卵巢癌組織中高表達。

圖1 NRP1蛋白在SKOV3卵巢癌細胞中的表達情況。比例尺，10μmFig.1 Expression of NRP1 protein in SKOV3 ovarian cancer cells. Scale bar, 10μm

2 卵巢癌組織高水平表達NRP1

對4例新鮮卵巢癌組織和配對癌旁組織進行實時定量PCR和Western blot檢測顯示：在癌旁組織中幾乎不表達或低水平表達NRP1 mRNA和蛋白，而卵巢癌組織中NRP1 mRNA和蛋白水平顯著高于癌旁組織（圖2、3）。

3 卵巢癌組織中NRP1水平與其低分化程度、淋巴結轉移和血清CA125水平呈正相關

對120例卵巢癌組織標本和23例配對癌旁組織標本進行NRP1免疫組織化學染色顯示：NRP1在癌旁組織中不表達或僅呈弱陽性表達，但在卵巢癌組織中其免疫反應性明顯增強，包括漿液性腺癌、粘液性腺癌和子宮內膜樣腺癌。NRP1陽性反應產物主要位于卵巢癌細胞胞質和細胞膜 (圖4)。

圖2 卵巢癌組織中NRP1 mRNA 的表達。PC：癌旁組織；T：卵巢癌組織；1#、2#、3#、4#：1 號、2 號、3 號、4 號卵巢癌患者Fig.2 Expression of NRP1 mRNA in ovarian cancer tissues. PC: paracancerous tissue; T: tumor tissue; 1#, 2#, 3#, 4#: number 1, 2, 3, 4 ovarian cancer patient

圖3 卵巢癌組織中NRP1蛋白水平檢測。A，代表性免疫印跡分析結果；B，免疫印跡分析結果的定量分析；PC，癌旁組織；T，卵巢癌組織；1#、2#、3#、4#，1號、2號、3號、4號卵巢癌患者。**，P＜0. 01Fig.3 Expression of NRP1 protein in SKOV3 ovarian cancer tissues. A, representative Western blotting images; B, quantification and statistical analysis of Western blotting results. PC: paracancerous tissue; T: tumor tissue; 1#, 2#, 3#, 4#: number 1, 2, 3, 4 ovarian cancer patient. **, P＜0. 01

圖4 卵巢癌組織中NRP1 水平的免疫組織化學檢測。比例尺，50μmFig. 4 Immunohistochemical examination of NRP1 level in ovarian cancer tissues. Scale bar, 50μm

120例卵巢癌組織中，NRP1陽性表達率為76.67%（92/120），顯著高于配對癌旁組織NRP1陽性表達率47.83%（11/23）（表1）。

表1 卵巢癌和癌旁組織中NRP1陽性率比較Tab. 1 Comparison of the positive rates of NRP1 in ovarian cancer and paracancerous tissues

120例卵巢癌組織標本中，有30例處于G1分化期， 29例處于G2分化期，61例處于G3分化期。根據FIGO分期又可將該120例卵巢癌組織標本分為41例I/II分期卵巢癌組織和79例III/IV分期卵巢癌組織。120例卵巢癌患者中，有73例存在淋巴結轉移，78例血清CA125水平在500IU/L以上。對NRP1表達與臨床病理特征之間關系分析發(fā)現（表2）：NRP1陽性率與患者年齡、癌腫大小及組織類型均無明顯相關性。處于G2、G3分化期的卵巢癌組織標本NRP1陽性率分別為75.86%和85.25%，處于G1分化期的卵巢癌組織NRP1陽性率為60%；處于III/IV FIGO分期的卵巢癌組織標本NRP1陽性率為83.54%，處于I/II FIGO分期的NRP1陽性率為63.41%，表明NRP1陽性表達率與卵巢癌的低分化程度呈正相關。發(fā)生淋巴結轉移的卵巢組織的NRP1陽性率為84.93%，明顯高于無淋巴結轉移的卵巢癌組織NRP1陽性率63.83%。高血清CA125水平分組的患者，其卵巢癌組織的NRP1陽性率為85.9%，低血清CA125水平的患者，其卵巢癌組織標本的NRP1陽性率為59.52%，即二NRP1陽性表達率與卵巢癌者血清CA125水平呈正相關。

表2 120例卵巢癌組織中NRP1免疫反應性與臨床病理特征的關系Tab. 2 NRP1 immunoreactivities in 120 cases of ovarian cancer tissues and its correlation with clinical pathological features

討 論

卵巢癌由于其確診難、轉移率高、化療耐藥等原因，成為死亡率最高的婦科惡性腫瘤[13]。近年來，隨著新型化療方案、支持治療、腫瘤細胞減滅術等新治療方式的不斷發(fā)展，卵巢癌患者的平均生存時間得到有效延長，但晚期卵巢癌患者的治療效果仍然不盡人意[14,15]。因此，探尋新的特異性卵巢癌標志物，能夠為早期診斷、手術切除癌灶、化療方案選擇、提高化療有效率提供幫助，進一步延長患者生存時間。

NRP1是由位于10p11.22的Nrp1基因編碼的一種大小為120～140kDa的Ⅰ型跨膜蛋白[16]。NRP1能夠結合許多配體和共同受體，廣泛參與人體的生理和病理過程，在免疫調節(jié)、心血管疾病發(fā)展、神經元引導、血管生成等方面發(fā)揮重要作用[11,17,18]。小鼠模型研究表明，NRP1是心臟、腎、眼和后肢發(fā)育中動脈生長的關鍵性調節(jié)因子，可促進動脈發(fā)生[19]。近年來，關于NRP1在腫瘤上的研究越來越多，其過表達與腫瘤侵襲性、病理分期和預后不良有關。許多研究表明NRP1在肝癌、肺癌、腎癌中呈現高表達狀態(tài)[20-23]。

本研究中，我們采用實時熒光定量PCR技術、蛋白免疫印跡分析技術、免疫組織化學染色技術研究了NRP1在卵巢癌組織標本及癌旁組織中的免疫反應性，比較了兩種組織中NRP1免疫反應性的差異，發(fā)現NRP1在卵巢癌組織標本中的陽性率明顯高于癌旁組織。分析NRP1免疫反應性與卵巢癌標本臨床病理特征關系發(fā)現，分化期越后、FIGO分期越晚、血清CA125水平越高的卵巢癌標本的NRP1免疫反應性越強，發(fā)生淋巴結轉移的卵巢癌標本中NRP1免疫反應性越強。NRP1蛋白表達可能影響卵巢癌的病理分級，使其向III/IV期發(fā)展，還能加劇癌細胞的分化程度，促進淋巴結轉移，從而綜合影響患者的預后情況。本研究提示檢測NRP1免疫反應性可為卵巢癌患者預后、指導卵巢癌的治療和干預提供指導。