李霽偉，謝余澄，武紅芳，阿智祥，高燕，周軍

（昆明市兒童醫(yī)院病理學(xué)科，昆明 650228）

先天性巨結(jié)腸癥（Hirschsprung’s disease,HD）是小兒常見的腸道疾病，新生兒中發(fā)病率約為1/4000～1/5000，居先天性消化道畸形第二位。HD主要病理改變是遠(yuǎn)端的狹窄腸管內(nèi)肌間神經(jīng)叢（Auerbach叢）和粘膜下神經(jīng)叢（Meissner叢）內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，神經(jīng)纖維增粗[1]。HD的發(fā)病機制尚不十分清楚，一般認(rèn)為是胚胎發(fā)育過程中腸神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移障礙或遷移后不能正常生長分化所致[2]。為了發(fā)現(xiàn)更特異的診斷HD的方法，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法比較了同源異型盒蛋白2B（pairedlike homebox 2B，PHOX2B）、calretinin和S-100在HD腸壁的表達特征。

材料與方法

1 動物

40只SPF級SD大鼠，2月齡，體重（220±10）g，雌雄各半，購自于昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗室，并委托飼養(yǎng)至性成熟后繁殖幼鼠。取4至5日齡80只，雌雄不限，隨機分為模型組和空白對照組2組，每組40只：模型組采用0.5% BAC處理乙狀結(jié)腸；空白對照組采用5ml 0.9%生理鹽水處理乙狀結(jié)腸。

2 試劑

實驗中的主要試劑見表1。

表1 實驗試劑Tab. 1 Experimental reagents

3 HD乳鼠動物模型建立

于1978年有學(xué)者利用BAC成功建立大鼠無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥模型[3]，之后該動物模型和實驗方法也廣泛用于去神經(jīng)方面的研究。本研究在經(jīng)典的HD動物模型基礎(chǔ)上[4-6]，根據(jù)兒童生理特點，利用乳鼠模擬建立HD動物模型，從而更貼合兒童HD病理生理狀態(tài)。

新生4～5d齡SD乳鼠40只，在無菌條件下腹部正中1%利多卡因局部麻醉，麻醉處切口提出乙狀結(jié)腸（距離肛門1～1.5cm處），將0.5%BAC溶液浸泡過濾紙條（1.5cm×0.5cm）緊貼腸壁環(huán)形包繞乙狀結(jié)腸，每10min滴加50μl的0.5% BAC溶液于濾紙上，保持濾紙濕潤，60min后移去濾紙條，清潔腹腔，還納腸管，關(guān)閉腹腔，注射用青霉素鈉粉劑涂切口，每天1次。空白對照組40只乳鼠的手術(shù)方式同模型組，用0.9%生理鹽水代替0.5% BAC溶液，作用時間及計量同實驗組。恒溫下人工飼養(yǎng)，術(shù)后第1周模型組開始出現(xiàn)腹脹，至術(shù)后第2周模型組均出現(xiàn)不同程度的排便減少，腹脹，精神萎靡，消瘦，糞便顆粒比對照組和空白組干燥且明顯變小，隨機處死后大體解剖可見 BAC 處理結(jié)腸段腸管狹窄痙攣，無蠕動，病變近端腸管擴張，腸腔內(nèi)容物潴留，癥狀與臨床先天性巨結(jié)腸一致。截取處死后模型組狹窄段腸道標(biāo)本用4%福爾馬林溶液固定保存，常規(guī)脫水透明石蠟包埋，切片厚為4μm，常規(guī)HE染色。鏡下腸道粘膜內(nèi)和肌層內(nèi)神經(jīng)叢增生、增大（＞40μm），缺乏明確神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，符合HD病理診斷。

處死空白對照組和模型組乳鼠，分別截取空白組乙狀結(jié)腸正常腸道標(biāo)本40例，模型組狹窄段標(biāo)本40例和移行段標(biāo)本40例，均用4%福爾馬林溶液固定后石蠟包埋切片備用。

4 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色操作步驟：石蠟切片高壓鍋100℃修復(fù)3min，自然冷卻，PBS洗5min×3次；3%H202室溫孵育10min，PBS洗2min×3次；滴加抗PHOX2B（1:4000）、抗calretinin（1:50）和抗S-100（1:100）單克隆抗體，室溫孵育2～3h，PBS洗2min×3次；滴加反應(yīng)增強劑，25℃孵育20min，PBS洗2min×3次；滴加二抗（1:100）；25℃30min，PBS洗2min×3次；含0.05% DAB和0.01% H2O2的0.05mol/L Tris-HCl顯色液顯色10min，蘇木精復(fù)染1min，分化、返藍(lán)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

5 結(jié)果判定

定性分析：選擇黏膜下神經(jīng)叢，分別記錄3種神經(jīng)標(biāo)志物的表達特點，免疫組織化學(xué)染色后顯微鏡下觀察腸道組織著色情況， PHOX2B胞核棕色判為陽性，calretinin及S-100胞質(zhì)棕色判為陽性。

定量分析：對不同組標(biāo)本均進行高倍顯微鏡下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計。再采用半定量方法記錄不同組的各種標(biāo)志物在細(xì)胞體的表達強度，++為強陽性；+為陽性；—為陰性。

6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。單因素方差分析考察PHOX2B、calretinin與S-100對照組腸壁內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的差異；PHOX2B、calretinin與S-100在HD的移行段內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的差異。在進行方差分析之前，要求數(shù)據(jù)方差齊性。不滿足方差齊性的情況時，使用Welch’s Anova分析，并使用Games-Howell test來進行方差不齊情況下的兩兩比較。所有統(tǒng)計均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

正常對照組腸壁中，PHOX2B特異性表達于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞核，calretinin表達于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)、施旺細(xì)胞和周圍細(xì)胞，S-100表達于神經(jīng)纖維、施旺細(xì)胞和周圍細(xì)胞，呈現(xiàn)特異的“空泡狀”（圖1；表2）。在HD移行段腸壁， PHOX2B、calretinin和 S-100的免疫組織化學(xué)表達與正常對照基本一致，但強度和密度較低（圖1中）。HD狹窄段腸壁 ，PHOX2B無免疫組織化學(xué)表達，但calretinin和S-100仍呈免疫反應(yīng)陽性，尤其S-100呈較強表達（圖1）。

表2 PHOX2B、calretinin和S-100在正常腸壁神經(jīng)組織中的免疫組織化學(xué)表達特點Tab. 2 Immunohistochemical expression features of PHOX2B, calretinin and S-100 in nerve tissues of the normal colonic walls

計數(shù)含有細(xì)胞核切面的完整節(jié)細(xì)胞，40例對照組粘膜下神經(jīng)節(jié)

細(xì)胞中， PHOX2B免疫反應(yīng)陽性節(jié)細(xì)胞數(shù)5.7±1.244，calretinin免疫反應(yīng)陽性節(jié)細(xì)胞數(shù)3.0±0.816，S-100免疫反應(yīng)陽性節(jié)細(xì)胞數(shù)3.525±0.96。3種標(biāo)記物陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量不滿足方差齊性（F=7.535，P=0.001），使用Welch’s Anova分析顯示，各組之間節(jié)細(xì)胞數(shù)量差異顯著（P=0.001）；通過Games-Howell test進行兩兩比較顯示，calretinin免疫反應(yīng)陽性節(jié)細(xì)胞數(shù)與S-100免疫反應(yīng)陽性節(jié)細(xì)胞數(shù)差異也具有顯著性（0.01＜P＜0.05）（表3）。40例移行段粘膜下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，PHOX2B免疫反應(yīng)陽性節(jié)細(xì)胞數(shù)2.9±0.672，calretinin免疫反應(yīng)陽性節(jié)細(xì)胞數(shù)1.925±0.656，S-100免疫反應(yīng)陽性節(jié)細(xì)胞數(shù)2.075±0.655。3種標(biāo)記物陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量滿足方差齊性（F=0.068，P=0.934），通過方差分析顯示，PHOX2B免疫反應(yīng)陽性節(jié)細(xì)胞數(shù)與calretinin組和S-100組均有明顯差異（P＜0.001），calretinin免疫反應(yīng)陽性節(jié)細(xì)胞數(shù)與S-100免疫反應(yīng)陽性節(jié)細(xì)胞數(shù)之間無差異（P＞0.05）（表4）。

討 論

不同成熟狀態(tài)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有著形態(tài)和數(shù)量上的明顯區(qū)別。顯微鏡下，正常成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈簇狀或單個分布，多邊形，細(xì)胞核居中，核仁明顯，大而圓，嗜酸，細(xì)胞質(zhì)較寬，嗜酸淡染。相比較下，未成熟神經(jīng)節(jié)細(xì)胞較小，胞質(zhì)窄，核仁存在但不明顯。 而HD狹窄段腸壁間可見顯著增生、增粗的神經(jīng)纖維（＞40μm），束索狀排列，但缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。此外，在日常病理診斷工作中我們還發(fā)現(xiàn)，未成熟神經(jīng)節(jié)細(xì)胞往往與血管內(nèi)皮細(xì)胞、周圍的組織細(xì)胞及神經(jīng)叢內(nèi)的施旺細(xì)胞等難以區(qū)別。因此，我們引入免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測一些標(biāo)志物，如calretinin和S-100等經(jīng)典標(biāo)志物，來區(qū)分難以辨別的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。calretinin的主要優(yōu)點是表達于正常腸管黏膜下層、黏膜肌層及肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，定位在細(xì)胞胞質(zhì)，強陽性表達，特異性相對較強。同樣作為經(jīng)典標(biāo)志物之一的S-100，其優(yōu)勢是表達于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)纖維，增生粗大的神經(jīng)纖維表達水平更高，而神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈陰性，呈現(xiàn)一種特異的“空泡狀”表達。然而這一類經(jīng)典標(biāo)志物診斷針對HD移行段和狹窄段腸壁中的神經(jīng)纖維、施旺細(xì)胞和周圍細(xì)胞也呈陽性表達，容易造成假陽性結(jié)果，對觀察不同成熟狀態(tài)的節(jié)細(xì)胞和診斷HD帶來極大的干擾。

圖1 PHOX2B，calretinin，S-100在實驗性先天性巨結(jié)腸癥大鼠腸壁及正常對照大鼠腸壁中表達特征的免疫組織化學(xué)檢測。正常對照和HD移行段比例尺，20μm；HD狹窄段比例尺，40μmFig.1 Immunohistochemical detection of PHOX2B, calretinin, S-100 in the colonic walls of experimental Hirschsprung’s disease rats and healthy control rats. Scale bar, 20μm in normal controls and transitional segments of HD colons and 40μm in narrow segments of HD colons

表3 正常結(jié)腸壁PHOX2B、calretinin 或S-100陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)Tab. 3 Number of ganglion cells positive for PHOX2B, calretinin or S-100 in the normal colonic walls

表4 實驗性先天性巨結(jié)腸癥移行段結(jié)腸壁PHOX2B、calretinin 或S-100免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)Tab. 4 Number of ganglion cells positive for PHOX2B, calretinin or S-100 in the transitional segments of Hirschsprung’s disease colons

PHOX2B是近年來針對先天性中樞性低通氣綜合征（congenital central hypoventilation syndrome，CCHS）和神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma, NB）診斷推出的一種新的標(biāo)記物。研究發(fā)現(xiàn)，PHOX2B是由位于第 4 對常染色體上的配對同源盒基因編碼的有314個氨基酸的同源域蛋白（homeodomain protein），與調(diào)節(jié)心肺活動及消化系統(tǒng)的多種非腎上腺素能神經(jīng)元的發(fā)育有密切相關(guān)[7-9]。此外，PHOX2B主要表達于副交感神經(jīng)和腸神經(jīng)的節(jié)前神經(jīng)元[10]。在正常胚胎早期神經(jīng)嵴發(fā)育過程中，一些轉(zhuǎn)錄因子如PHOX2B、Hand-2及鋅指蛋白 GATA2等[11-14]，具有誘導(dǎo)酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和多巴胺羥化酶（dopamine β-hydroxylase，DBH）表達[15-17]，并促進神經(jīng)嵴細(xì)胞分化成為成熟的交感神經(jīng)元的功能，其中PHOX2B在嗜鉻細(xì)胞及交感神經(jīng)元發(fā)育過程中最為重要[18]。小鼠胚胎學(xué)動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，一旦成腸細(xì)胞進入到前腸間葉，即有PHOX2B蛋白表達，并僅在神經(jīng)嵴細(xì)胞中最先移行到前腸的迷走神經(jīng)嵴細(xì)胞中表達，而且貫穿腸神經(jīng)元發(fā)育的始終。PHOX2B基因突變純合子小鼠全胃腸道缺乏神經(jīng)元，這也提示該基因表達調(diào)控過程可能與HD病變機制相似，且密切相關(guān)[19]。

本研究在HD動物模型中，發(fā)現(xiàn)PHOX2B僅表達于正常腸管黏膜下層、黏膜肌層及肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，定位在細(xì)胞胞核，棕黃色強陽性表達，具有獨特的“有或無”染色模式，并且著色背景非常干凈，沒有神經(jīng)纖維、施旺細(xì)胞和周圍細(xì)胞的假陽性表達，使免疫染色結(jié)果容易解讀，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞定性非常準(zhǔn)確。同時，對腸道正常段和HD移行段腸壁神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的判讀明顯優(yōu)于calretinin和S-100，即陽性染色神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核完全暴露，方便觀察腸道不同階段以及不同發(fā)育狀態(tài)下的節(jié)細(xì)胞具體形態(tài)和數(shù)量，這為我們利用動物模型研究HD腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育的演變以及HD發(fā)病機制，提供了優(yōu)良的前期實驗條件。識別PHOX2B的特異性較高的新抗體，將大幅度提高HD病理診斷的準(zhǔn)確率，也為冰凍切片快速免疫組織化學(xué)診斷HD奠定實驗基礎(chǔ)。此外，精準(zhǔn)的診斷勢必為臨床手術(shù)定位HD腸道近、遠(yuǎn)端提供更為明確的指征，將有效縮短手術(shù)時間，從而改善患兒治療及預(yù)后等情況。

綜上所述，通過PHOX2B免疫染色標(biāo)記HD腸壁，對其診斷的敏感性大大提高，PHOX2B免疫染色可以作為HD診斷的一個重要特異性輔助指標(biāo)。