李真真，王九菊，馬鈺*

（1陜西省人民醫(yī)院病理科，西安 710068；2陜西省人民醫(yī)院血研室，西安，710068）

EB 病毒 ( Epstein-Barr virus，EBV) 越來(lái)越受到人們的關(guān)注，這不僅因?yàn)樗詽摲腥镜男问綇V泛存在于健康人群，更重要的是它與越來(lái)越多的惡性腫瘤關(guān)系密切[1]。EB病毒編碼的小RNA(Epstein–Barr virus-encoded small RNAs，EBER)在被感染的細(xì)胞核中以高拷貝數(shù)存在[2]。因此，EBER的相關(guān)檢測(cè)已經(jīng)成為EB病毒最重要的檢測(cè)手段。EBER 顯色原位雜交技術(shù)（chromogenicin situhybridization，CISH）具有定位作用，能夠確定病毒與組織和細(xì)胞關(guān)系，EBER 原位雜交已成為公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法[3]。目前在各大中型醫(yī)院中，EBER原位雜交主要采用的是手工染色的方法。隨著全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)的廣泛應(yīng)用，EBER原位雜交也逐漸應(yīng)用全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)進(jìn)行。我們通過(guò)對(duì)兩種不同染色方法的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)的方法用時(shí)短，定位準(zhǔn)確，對(duì)比鮮明，明顯優(yōu)于手工染色。

材料與方法

1 標(biāo)本來(lái)源

選取陜西省人民醫(yī)院病理科EBER原位雜交陽(yáng)性病例35例，其中胃髓樣癌1例，鼻咽癌16例，NK/T細(xì)胞淋巴瘤5例，Burkitt淋巴瘤2例，胃腺癌2例，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤2例，血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤2例，經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤2例，淋巴組織不典型增生2例，急性重癥EBV感染1例。每例切片兩張，厚度4μm，分為儀器組和手工組。儀器組用全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)進(jìn)行染色，手工組用手工染色的方法進(jìn)行染色。

2 儀器設(shè)備

全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色儀購(gòu)自羅氏診斷公司，儀器型號(hào)為BenchMark XT。孵育盒、恒溫箱、雜交儀。

3 試劑

儀器組試劑為羅氏診斷公司生產(chǎn)的ISH Protease 3、INFORM EBER Probe、iVIEW Blue Detection、ISH Red Counterstain。手工組試劑為福州邁新公司生產(chǎn)的EBER檢測(cè)試劑盒。

4 EBER原位雜交全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)操作方法

①將切片經(jīng)65℃烤片20min；②在電腦上選定染色項(xiàng)目為EBER，并輸入相應(yīng)的病理號(hào)，打印標(biāo)簽；③將標(biāo)簽貼于對(duì)應(yīng)的切片上，將貼好標(biāo)簽的玻片放置于全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)的染色板上；④將染色過(guò)程所需要的試劑放置于染色架上，并檢查試劑瓶口是否有空氣柱和試劑結(jié)晶，檢查后將染色架放于染色機(jī)相應(yīng)位置上；⑤開(kāi)始運(yùn)行程序，染色機(jī)全程自動(dòng)染色，時(shí)長(zhǎng)約5h；⑥染色結(jié)束后將切片從染色機(jī)中取出，充分洗滌，晾干后封片。

5 EBER原位雜交全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)染色程序

①脫蠟；②羅氏CC1緩沖液環(huán)境下細(xì)胞修復(fù)60min；③加入ISH Protease 3，消化20min；④加入EBER探針；⑤加入iVIEW blue試劑盒：Ivew Anti-fluorescein 孵育 20min，iview blue biotinylated lg孵育8min，iview blue SA-AP, 孵育16min；Ivew blue enhancer 孵育8min；Ivew blue NBT和BCIP孵育32min；⑥加入紅染試劑 Red Stain，孵育4min；⑦常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。

6 EBER原位雜交手工染色方法

①將切片經(jīng)65℃烤片20min；②切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟至水；③組織滴加適量的消化酶，室溫下在濕盒中孵育3～7min（具體消化時(shí)間根據(jù)組織而定）；④蒸餾水漂洗，梯度乙醇脫水（75%、90%、100%各2min）;⑤組織干燥后，在切片樣本區(qū)域滴加適量的EBER探針，加蓋蓋玻片，并密封蓋玻片；⑥置于雜交儀或恒溫箱孵育盒中，37℃孵育14～18h；⑦移去蓋玻片，PBS緩沖液漂洗后滴加適量的鼠抗地高辛抗體，37℃濕盒中孵育30min；⑧PBS沖洗，滴加適量DAB顯色液，室溫下濕盒中孵育5min，自來(lái)水洗去顯色液；⑨蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。

結(jié) 果

對(duì)兩組切片的染色效果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，儀器組（圖A1、B1、C1、D1）35例染色均為陽(yáng)性，陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞核，為藍(lán)色，背景色為淡紅色，位于細(xì)胞質(zhì)，顏色對(duì)比鮮明，較易判讀。手工組（圖A2、B2、C2、D2）35例染色均為陽(yáng)性，陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞核，呈棕黃色，背景色為淡藍(lán)色，同樣位于細(xì)胞核，背景色與陽(yáng)性信號(hào)位于同一部位，對(duì)于陽(yáng)性信號(hào)較弱的病例不易判讀。比較同一病例的儀器組和手工組的染色結(jié)果，可以看出，信號(hào)較強(qiáng)時(shí)，兩種方法都可以比較容易的判斷出陽(yáng)性的結(jié)果，并計(jì)算出拷貝數(shù)。但在信號(hào)較弱時(shí)，手工組由于背景的影響，判讀和計(jì)數(shù)都較儀器組困難（圖C2）。

對(duì)兩種染色方法用時(shí)比較顯示，儀器組全程染色時(shí)間約5h，整個(gè)流程均由儀器獨(dú)立完成，無(wú)需技術(shù)人員操作，耗時(shí)短，且節(jié)約人力。手工組全程染色時(shí)間約為16h，每隔20～30min需要技術(shù)人員滴加各種試劑，且需要37℃過(guò)夜孵育最少14h，當(dāng)天無(wú)法完成染色，與儀器組比較更加耗時(shí)耗力。

討 論

圖1 兩組切片的染色效果進(jìn)行比較。A，Burkitt淋巴瘤標(biāo)本EBER原位雜交陽(yáng)性；B，胃髓樣癌標(biāo)本EBER原位雜交陽(yáng)性；C，鼻咽癌標(biāo)本EBER原位雜交陽(yáng)性；D，NK/T細(xì)胞淋巴瘤標(biāo)本EBER原位雜交陽(yáng)性（A1，B1，C1，D1為儀器組，A2，B2，C2，D2為手工組）；比例尺，100μmFig.1 Comparison of two methods in EBER staining. A, EBER is positive for in situ hybridization in Burkitt lymphoma specimens; B, EBER is positive for in situ hybridization in medullary carcinoma; C, EBER is positive for in situ hybridization in NPC specimens; D, EBER is positive for in situ hybridization in NK/T cell lymphoma specimens (A1-D1 is the instrument aided group, A2-D2 is the manual group); scale bar, 100μm

愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒( Epstein-Barr virus，EBV)是一種廣泛存在的γ-皰疹病毒[4]，主要感染人類口咽部的上皮細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。它不僅以潛伏感染的形式廣泛存在于健康人群，更重要的是它與越來(lái)越多的惡性腫瘤關(guān)系密切[1]。有研究顯示，在扁桃體炎患者的扁桃體組織內(nèi)可以檢測(cè)到EBV的基因[5]。另一些研究顯示，在鼻竇內(nèi)翻性乳頭狀瘤患者中，有30%的病變組織中檢測(cè)到EBV病毒[6]。 更多的研究表明，EBV與某些類型的淋巴瘤有密切的關(guān)系。幾乎所有的結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤為EBV陽(yáng)性，在血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤中也是如此。地方性Burkitt淋巴瘤幾乎在所有病人的惡性細(xì)胞中均可發(fā)現(xiàn)EBV的復(fù)制，霍奇金淋巴瘤的惡性細(xì)胞—R-S細(xì)胞中的EBV陽(yáng)性率為40%[7]。最近的研究顯示，EBV陽(yáng)性的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤，未特指型（DLBCL,NOS）是一種與EBV感染相關(guān)的淋巴瘤，標(biāo)準(zhǔn)化療方案預(yù)后不良[8]。除了淋巴瘤外，有研究顯示EBV感染是胃癌的另一個(gè)危險(xiǎn)致病因素，病毒蛋白、EBER非編碼RNA和EBV miRNAs可以通過(guò)調(diào)節(jié)宿主基因組甲基化和基因表達(dá)而參與腫瘤的發(fā)生[9]。另外，有研究顯示，一種少見(jiàn)的肺腫瘤-原發(fā)性肺淋巴上皮瘤樣癌與EBV感染密切相關(guān)，與鱗癌相比，預(yù)后較好[10]。綜上所述，EBV的檢測(cè)不僅越來(lái)越多的應(yīng)用于部分疾病的診斷，同時(shí)也能起到提示預(yù)后、指導(dǎo)治療的作用，因此，日益受到重視。目前，EBV病毒的檢測(cè)已經(jīng)成為病理科用于某些疾病的輔助診斷，以及淋巴結(jié)反應(yīng)性增生、淋巴瘤診斷分型的重要手段之一。

EBER特異序列的單鏈DNA探針能特異性地與EBER靶序列互補(bǔ)雜交，從而檢測(cè)EBV是否存在，且此方法用于檢測(cè)石蠟組織切片中的EBV具有極高的特異性和靈敏性。因此EBER原位雜交已成為組織和細(xì)胞中EBV的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[1]。EBER原位雜交是一項(xiàng)要求較高的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，過(guò)程繁瑣，存在不穩(wěn)定因素和人為差異[11]。此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用的初期，大部分實(shí)驗(yàn)室采用手工的方法進(jìn)行染色，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各大中型醫(yī)院病理科的儀器設(shè)備自動(dòng)化程度越來(lái)越高，隨著病理工作量不斷增長(zhǎng)，傳統(tǒng)的手工操作已經(jīng)難以滿足工作需要，逐步被全自動(dòng)化儀器操作取代[12]。

自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)在EBER染色中的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化、規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，避免了手工染色的人為誤差，使染色結(jié)果更加穩(wěn)定。手工染色的靈活性更高一些，可以根據(jù)不同的組織類型在染色過(guò)程中進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，與機(jī)器染色相比較，更加的節(jié)省試劑。機(jī)器染色和手工染色各有其優(yōu)缺點(diǎn)。①染色信號(hào)：儀器組染色結(jié)果陽(yáng)性信號(hào)呈藍(lán)色，位于細(xì)胞核，背景呈紅色，位于細(xì)胞質(zhì)。顏色對(duì)比鮮明，色差明顯，不易誤判。手工組染色結(jié)果陽(yáng)性信號(hào)呈棕色，背景呈藍(lán)色。陽(yáng)性信號(hào)與背景色著色部位均在細(xì)胞核。如蘇木素復(fù)染過(guò)深則容易將弱陽(yáng)性信號(hào)覆蓋，導(dǎo)致誤判。②染色時(shí)間：儀器組染色全程約需要5h，手工組染色全程約需要16h。儀器染色不僅縮短了染色時(shí)間，而且可以在做EBER染色的同時(shí)進(jìn)行免疫組化染色，提高了工作效率，有利于診斷報(bào)告的及時(shí)發(fā)出。③染色流程：儀器組在設(shè)定好染色程序之后，所有切片的染色流程均按照染色程序嚴(yán)格執(zhí)行，每一張切片均有獨(dú)立控溫加熱板，能夠保證染色過(guò)程中溫度與時(shí)間的控制，且切片不易被污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性較高。手工組進(jìn)行染色時(shí)實(shí)驗(yàn)操作人員易受外界因素的干擾，標(biāo)本量較多時(shí)無(wú)法保證每一例標(biāo)本的消化時(shí)間完全相同，因此容易造成人為誤差；我們的實(shí)驗(yàn)中，就出現(xiàn)過(guò)因?yàn)椴僮魅藛T實(shí)驗(yàn)條件和過(guò)程的把控失誤造成手工染色失敗的情況。④試劑的使用量：羅氏全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)采用油膜封蓋技術(shù)，每張切片單種試劑的加樣量為100μl，此技術(shù)可保證試劑均勻覆蓋于整張切片上，無(wú)論組織大小與多少，均能保證切片的染色質(zhì)量。手工組染色試劑直接滴加于組織上，如組織取材過(guò)大，則試劑的消耗量也相應(yīng)的增加。⑤試劑成本：儀器組試劑成本比較昂貴，且需要借助于全自動(dòng)免疫組化染色儀進(jìn)行染色。手工組試劑相對(duì)價(jià)格比較低廉，更適合于基層醫(yī)院開(kāi)展。⑥粘附載玻片的要求：儀器組對(duì)載玻片要求較高，只有正離子濃度較高的粘附載玻片才能達(dá)到最理想的染色效果，一般的粘附載玻片在染色前需經(jīng)脫脂奶粉處理增加正離子濃度后才可進(jìn)行上機(jī)染色，否則容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。手工組則對(duì)粘附載玻片沒(méi)有太多的要求，只要在染色過(guò)程中有足夠的粘附性，不掉片即可。⑦陽(yáng)性及陰性對(duì)照的設(shè)置[13]，無(wú)論是儀器組還是手工組均需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，儀器組可以將對(duì)照組織與待測(cè)組織裱于同一張玻片上，相同的試劑量可以保證所有組織的染色，手工組則需要在對(duì)照組織和待測(cè)組織上分別滴加試劑，每一批次都會(huì)增加兩份試劑的使用量。

綜上所述，EBER檢測(cè)結(jié)果對(duì)一些疾病的診斷及治療有重要的指導(dǎo)意義，在病理科的日常工作中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛?？焖?、準(zhǔn)確的檢測(cè)是相關(guān)病理診斷的必要條件。儀器染色和手工染色各有其優(yōu)缺點(diǎn)，我們?cè)趯?shí)際工作中可以根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)室的具體條件合理選擇適合自己的染色方法。儀器染色適合標(biāo)本量大，技術(shù)人員少的醫(yī)院開(kāi)展，手工染色則比較適合基層醫(yī)院開(kāi)展。