黃紅浪,李衛(wèi)華,張維,冉靜,張姍姍,付莉
(1廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 廈門市心血管病研究所;2廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)務(wù)部;3廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,廈門 361003)
病理診斷是臨床診療過程中的金標(biāo)準(zhǔn)[1],為疾病診治及預(yù)后判斷提供了有力幫助,但承擔(dān)巨大的責(zé)任與風(fēng)險。目前,大多數(shù)病理實驗室采用4%中性甲醛和二甲苯進(jìn)行組織和切片處理,配置通風(fēng)設(shè)備來降低空氣污染對人體的危害,但是,甲醛、二甲苯及噪聲的污染仍嚴(yán)重威脅著病理工作人員的健康,尤其是病理技術(shù)室工作人員[2-5]。另外,不同的研究課題實驗對標(biāo)本固定液的要求是嚴(yán)格的、迥異的,傳統(tǒng)的方法脫水機(jī)內(nèi)統(tǒng)一配置4%甲醛已無法同時滿足各種實驗的要求。因此,作者采用低甲醛固定組織,采用VAN-Clear替代二甲苯對組織進(jìn)行透明,采用VAN-Clear對切片進(jìn)行脫蠟,旨在探索一種環(huán)保、可替代傳統(tǒng)病理組織脫水、可替代傳統(tǒng)病理切片脫蠟的優(yōu)化方案。
選取廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管病研究所10只SD大鼠,分別解剖腦組織、延髓、心臟、肺、胸主動脈、胃、脾臟、肝臟、腹主動脈、結(jié)腸、腸系膜上動脈、腎臟、精囊腺、睪丸等14種組織,共計140例標(biāo)本,按規(guī)范[4]取材,大小為1cm×1cm×0.30cm,每例均切取3份,隨機(jī)分改良中性甲醛組、改良多聚甲醛組和傳統(tǒng)中性甲醛組,均加入10倍體積不同固定液,固定時間為20~24h[4];3組各制140張進(jìn)行HE染色,挑選3組的腸系膜上動脈每組各10例做免疫組織化學(xué)染色。大鼠腸系膜上動脈平滑肌細(xì)胞炎癥模型標(biāo)本120例,神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤小鼠模型標(biāo)本20例,大鼠心梗模型心肌標(biāo)本60例,大鼠哮喘模型肺組織標(biāo)本32例。
TP1020組織脫水機(jī)(徠卡生物系統(tǒng)上海有限公司,德國),Histo Core Arcadia組織包埋機(jī)(徠卡生物系統(tǒng)上海有限公司,德國),RM2245半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(徠卡生物系統(tǒng)上海有限公司,德國),分貝噪音測試儀(北京布克世紀(jì)科技),博朗通126s甲醛檢測儀家用TVOC苯空氣質(zhì)量自監(jiān)測試儀量盒—室內(nèi)測甲醛儀器PM2.5檢測儀(博朗通醫(yī)療科技);VAN-Clear(武漢宏茲生物技術(shù)有限公司),HE染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司),Masson三色染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司),PAS染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司),濃縮型兔多抗ETA(ab117521)、濃縮型兔多抗ET-B(ab117529)、濃縮型大鼠單抗PD-L1(ab80276)、濃縮型小鼠單抗Integrin avb3(ab7166)及HRP標(biāo)記的羊抗兔、大鼠或小鼠二抗均采購自Abcam China,4%中性甲醛和4%多聚甲醛均購自廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑科。
改良中性甲醛組采用4%中性甲醛固定,改良多聚甲醛組采用4%多聚甲醛固定,改良組取材后均先采用流水及75%酒精祛除組織的固定液,然后進(jìn)入梯度酒精及VAN-Clear進(jìn)行組織處理;傳統(tǒng)中性甲醛組按傳統(tǒng)方法采用4%中性甲醛固定,取材后不祛除組織的固定液,直接進(jìn)入4%中性甲醛、梯度酒精及二甲苯進(jìn)行組織處理;組織處理分別在兩臺Leica TP1020組織脫水機(jī)內(nèi)完成。所有模型標(biāo)本均用改良中性甲醛固定。
將3組的組織進(jìn)行包埋、切片,切片厚度均3.50μm,65℃烤箱內(nèi)烤片30min,VAN-Clear脫蠟,降梯度酒精各3 min,自來水沖洗后行HE染色、免疫組織化學(xué)染色和Masson、PAS染色。
蘇木精染液染12min,流水沖洗,0.8%鹽酸酒精分化1s,流水洗凈、返藍(lán)15min,濕片鏡下觀察核染色,伊紅染液染1s,流水洗,梯度酒精各3s,風(fēng)干后環(huán)保封片膠及蓋玻片封固[1,4]。
石蠟切片脫蠟、入水后,采用檸檬酸高壓加熱進(jìn)行抗原修復(fù),二步法進(jìn)行ET-B、ET-A、PD-L1和Integrin avb3免疫組織化學(xué)染色[6]。ET-B、ET-A、PD-L1和Integrin avb3一抗稀釋度分別為1:250、1:2000、1:100和1:100,冰箱保鮮4度孵育過夜,HRP標(biāo)記的二抗1:2000,室溫孵育1h,室溫下DAB顯色3~10min,脫水、透明后環(huán)保封片膠及蓋玻片封固。
切片常規(guī)脫水至水洗,Weigert鐵蘇木素染5~10min,鹽酸酒精分化,麗春紅酸性品紅染5~10min,磷鉬酸處理5min,甲苯胺藍(lán)復(fù)染3~5min,1%冰醋酸沖洗致無藍(lán)色脫出,常規(guī)脫水封片。
切片常規(guī)脫水至水洗,高碘酸氧化10min,Schiff試劑染10~15min,蘇木素染核2~5min,鹽酸酒精分化,返藍(lán),常規(guī)脫水封片。
根據(jù)規(guī)范的質(zhì)控評分標(biāo)準(zhǔn),由實驗員、中級技師、高級醫(yī)師共同評分,取中間值。重點評價組織切面完整性,厚薄均一性,松散性,透明度,細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色對比,其中細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色對比不合格則認(rèn)定為不合格。分甲級片(≥90分)、乙級片(75~89分)、丙級片(60~74分)、丁級片(≤59分),優(yōu)良率(甲、乙級切片所占的比例)≥90%,優(yōu)級率(甲級切片所占的比例)≥35%[4,7]。免疫組織化學(xué)重點評價抗體表達(dá)、陽性定位,背景[6]。Masson染色結(jié)果為膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色,肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。PAS染色結(jié)果為糖原、中性粘液物質(zhì)呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)色。
分為LPS(Sigma)注射兩次及LPS注射一次2個實驗組,以注射NS為對照,LPS注射兩次組按大鼠體重腹腔注射LPS兩次,間隔6h,劑量為5mg/kg; LPS注射一次組按大鼠體重腹腔注射LPS一次,劑量為5mg/kg;注射生理鹽水(NS)對照組,按大鼠體重腹腔注射NS一次,劑量同上。3組大鼠均第一次注射后再飼養(yǎng)12h。
培養(yǎng)結(jié)腸癌腫瘤MC38細(xì)胞株,分別在第1和第4d,同等數(shù)量注射在C57BL/C小鼠的左、右后肢皮下,建立小鼠結(jié)腸腫瘤皮下移植瘤模型(分別為第1、2位腫瘤),第11d將其隨機(jī)分為放療聯(lián)合PDL1單抗組和 空白對照組2組。放療聯(lián)合PD-L1單抗組:從第12d 開始每天給予放療(8Gy/次),連續(xù)3d;從第15d開始每3d給予腹腔注射PD-L1單抗1次(200μg/次),共4次??瞻讓φ战M:不做放療和單抗注射治療。第35d處死小鼠取第2位腫瘤組織做病理檢查,二步法免疫組織化學(xué)檢測PDL1和integrin avb3表達(dá)水平差異。
10%水合氯醛麻醉,開胸,結(jié)扎大鼠心臟冠狀動脈左前降支,術(shù)后4周取心臟病理檢查。
采用卵蛋白腹腔注射致敏大鼠后再霧化吸入同一致敏原從而誘發(fā)大鼠哮喘發(fā)作,誘導(dǎo)氣道變應(yīng)性炎癥后處死取肺做病理檢查。
采用博朗通室內(nèi)空氣質(zhì)量檢測儀(BRSmart126S,一鍵式)檢測實驗室空氣的甲醛及二甲苯含量。
采用一鍵式分貝噪音測試儀(北京布克世紀(jì)科技)檢測環(huán)境噪聲。
采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗;A、B兩組與C組的HE染色評分的組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
改良組與傳統(tǒng)組腦、延髓、心臟、肺、胸主動脈、胃、脾臟、肝臟、腹主動脈、結(jié)腸、腸系膜上動脈、腎臟、精囊腺、睪丸等14種組織切面完整性、厚薄均一性、透明度、細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色對比度等均取得很好的評價,細(xì)胞核漿紅藍(lán)鮮艷、對比鮮明,透明度佳,一致性良好,無明顯差異。改良中性甲醛組、改良多聚甲醛組和傳統(tǒng)中性甲醛組3組切片的HE評分結(jié)果分別是:甲級片分別125例、122例和121例, 乙級片分別15例、18例和19例,丙級及丁級切片均為0例。3組優(yōu)良率均為100%,優(yōu)級率分別為89.29%、、87.14%、86.43%,各組優(yōu)級率之間無顯著差異,證實改良方法HE染色質(zhì)量穩(wěn)定、可靠(圖1、2)。
圖1 改良方法與傳統(tǒng)方法HE染色效果比較。比例尺,100μmFig. 1 Comparison of HE staining results between modified methods and traditional method. Scale bar, 100μm
改良組與傳統(tǒng)組的腸系膜上動脈HE切片形態(tài)完整,厚薄均一,紅藍(lán)鮮艷,核質(zhì)對比鮮明,透明度好,一致性良好。3種固定方法固定的腸系膜上動脈的平滑肌細(xì)胞的ET-B與ET-A抗體在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)陽性表達(dá)及定位都很準(zhǔn)確,背景清晰。無LPS刺激的正常對照組的平滑肌細(xì)胞ET-B與ET-A均(-/±);注射一次LPS的平滑肌細(xì)胞的ET-B與ET-A均(++);注射兩次LPS的平滑肌細(xì)胞的ET-B與ET-A均(+++)。平滑肌細(xì)胞的ET-B和 ET-A抗體陽性表達(dá)隨著炎癥因子LPS刺激次數(shù)的增加呈增強(qiáng)狀態(tài),且同組間ET-A的陽性表達(dá)明顯強(qiáng)于ET-B(圖3)。
改良法固定的小鼠結(jié)腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤模型標(biāo)本HE切片染色效果佳; PD-L1和Integrin avb3在大鼠結(jié)腸癌惡性腫瘤MC38模型的腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)陽性高表達(dá),而在大鼠結(jié)腸癌惡性腫瘤MC38聯(lián)合治療模型的腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)的陽性表達(dá)明顯下降,大鼠結(jié)腸癌惡性腫瘤MC38聯(lián)合治療明顯有效(圖4)。3種固定方法固定的標(biāo)本的HE染色和PD-L1與Integrin avb3免疫組織化學(xué)染色效果無明顯差異。
圖2 改良方法與傳統(tǒng)方法HE染色評分比較(n=140)Fig. 2 Comparison of HE staining scores between the modified and traditional methods (n=140)
在改良法固定的大鼠心梗模型心肌標(biāo)本中,HE和Masson染色效果好。在Masson染色與HE對比下,Masson染色大鼠模型心肌梗死區(qū),心肌細(xì)胞周圍膠原纖維明顯增生,呈藍(lán)色(甲苯胺藍(lán)),心肌細(xì)胞呈紅色,細(xì)胞核呈深藍(lán)色(圖5)。3種固定方法固定的心機(jī)標(biāo)本的HE和Masson染色效果無顯著差異。
圖3 改良法固定大鼠腸系膜上動脈的HE及ET-B和ET-A免疫組織化學(xué)染色效果。比例尺,100μmFig. 3 Representative images of HE staining and immunohistochemical staining for ET-B and ET-A of the rat superior mesenteric artery fixed by modified method. Scale bar, 100μm
圖4 改良法固定小鼠結(jié)腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤模型的HE及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。比例尺,100μmFig. 4 Representative images of HE staining and immunohistochemical staining for PD-L1 and Integrin avb3 of the mouse colon neuroendocrine tumor model fixed by modified method. Scale bar, 100μm
在改良法固定的大鼠哮喘模型肺組織標(biāo)本中,HE染色效果佳;支氣管杯狀細(xì)胞及黏液在PAS染色中呈深紅色,強(qiáng)陽性,細(xì)胞核呈深藍(lán)色,與HE染色形成鮮明的對比(圖6)3種固定方法對肺組織及支氣管杯狀細(xì)胞的HE和PAS染色無不同影響。
圖5 改良法固定的大鼠心梗模型心肌標(biāo)本HE及Masson染色結(jié)果。比例尺,100μmFig. 5 Representative images of HE and PAS staining of the modified method fixed myocardial specimens from the rat myocardial infarction model.Scale,100μm
圖6 改良法固定的大鼠哮喘模型肺組織標(biāo)本的HE及PAS染色結(jié)果,比例尺,150μm。Fig. 6 Representative images of HE and PAS staining of the modified method fixed lung tissue specimens from the rat asthmatic model. Scale,150μm
應(yīng)用改良法固定時,取材室工作時段甲醛濃度為0.15~0.28mg/m3,工作完成30min后檢測值為0 mg/m3;技術(shù)室工作時段(組織脫水、組織包埋、組織切片)及工作完成30min后甲醛濃度檢測值均為0 mg/m3(圖7)。技術(shù)室二甲苯檢測分為組織脫水、組織包埋、組織切片、組織脫蠟4個工作時段,檢測值均為0 mg/m3(圖8)。傳統(tǒng)法固定時,技術(shù)室的甲醛濃度為0.12~0.89mg/m3,二甲苯濃度為0~0.62mg/m3。改良法固定時的甲醛和二甲苯污染院低于傳統(tǒng)法。
對噪聲檢測顯示,工作時段,取材室測得數(shù)據(jù)為22~28dB(A),技術(shù)室測得數(shù)據(jù)為22~29dB(A),遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于通風(fēng)設(shè)備的噪聲標(biāo)準(zhǔn),達(dá)到中國環(huán)境噪聲容許的夜間噪聲標(biāo)準(zhǔn)(圖9)。
圖7 改良法固定時取材室和技術(shù)室甲醛濃度檢測結(jié)果(n=20)Fig. 7 Detection results of formaldehyde concentration in sampling room and operating room when fixation with improved method (n=20)
圖8 改良法固定時技術(shù)室二甲苯濃度檢測結(jié)果(n=20)Fig. 8 Detection results of xylene concentration in operating room when fixation with improved method (n=20)
圖9 改良法固定時取材室和技術(shù)室噪聲測試結(jié)果(n=20)Fig. 9 Noise test results in sampling room and operating room when fixation with improved method (n=20)
組織處理及制片是病理工作的基礎(chǔ),HE染色及免疫組織化學(xué)染色是病理診斷最重要環(huán)節(jié)之一。目前,在病理工作中仍大量的使用甲醛、二甲苯及通風(fēng)設(shè)備,對病理工作者及環(huán)境造成了極大的危害。
甲醛又稱蟻醛,是良好的組織固定劑。其固定原理是在蛋白質(zhì)末端基團(tuán)之間形成交聯(lián)鏈,組織固定均勻,穿透力強(qiáng),固有物質(zhì)保存好,組織收縮少,硬化組織有利于石蠟切片;缺點是形成交聯(lián)鏈,行免疫組織化學(xué)檢測時多數(shù)需要抗原修復(fù)等[9]。甲醛氣體相對密度10.67,無色,易揮發(fā)、對人眼及上呼吸道等有刺激作用[10,11],人體毒性包括致癌、致突變、致敏及刺激作用[12-15]。2017年世界衛(wèi)生組織國際癌研究機(jī)構(gòu)將其列為Ⅰ類致癌物。根據(jù)我國關(guān)于工作場所的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)甲醛的最高容許濃度(MAC)為 0.50mg/m3[3,16]。
二甲苯是良好的組織透明劑,使組織切片的透明度達(dá)到光鏡觀察的要求,同時能脫祛組織中的石蠟為染料與組織結(jié)合創(chuàng)造條件。二甲苯無色透明,易揮發(fā),對人眼及上呼吸道等有刺激作用,高濃度時,對中樞系統(tǒng)有麻醉作用[3,17]。2017年世界衛(wèi)生組織國際癌研究機(jī)構(gòu)將其列為Ⅲ類致癌物。中國居住區(qū)大氣中有害物質(zhì)的最高容許度為0.30mg/m3(一次值)。
VAN-Clear是一種從桔皮等植物中提取的綠色環(huán)保的生物透明脫蠟液,不含芳香族化合物且性質(zhì)穩(wěn)定,對人體沒有危害[18],是一種環(huán)保透明試劑。VAN-Clear的結(jié)構(gòu)與石蠟相似,與石蠟互溶性好,脫蠟效果好,有利于染料與組織著色[1]。
根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)的調(diào)查,長期較強(qiáng)的噪聲污染使人產(chǎn)生生理、心理、病理的不良影響,會造成耳鳴、耳聾、心血管疾病等疾病[19]。
根據(jù)文獻(xiàn)報道,病理實驗室甲醛濃度普遍偏高,取材室、技術(shù)室、診斷室均超過國家標(biāo)準(zhǔn)限值[3,20],二甲苯濃度也在技術(shù)室和診斷室嚴(yán)重超標(biāo)。通風(fēng)設(shè)備在一定程度上降低空氣污染水平,但也存在一些無法避免的問題:甲醛及二甲苯仍嚴(yán)重超標(biāo)[2,3];而且通風(fēng)設(shè)備噪音污染、對流時加劇,設(shè)備故障及老化、倒灌,設(shè)備占用大量空間,廢氣排放造成環(huán)境二次污染等。從根本上遏制實驗室甲醛、二甲苯及噪聲污染是保護(hù)人體健康及環(huán)境刻不容緩的工作。
本實驗方法減少甲醛環(huán)節(jié)以及采用VAN-Clear替代二甲苯,從源頭上降低實驗室的環(huán)境污染因素[5]。應(yīng)用改良法固定時,將取材室設(shè)置在實驗室最角落處,配置通風(fēng)設(shè)備;技術(shù)室集中配置組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、切片機(jī)、染色設(shè)備及試劑、顯微鏡、電腦等,未配置通風(fēng)設(shè)備。取材室的甲醛濃度工作時段為0.15~0.28mg/m3,非工作時段檢測值為零;通風(fēng)設(shè)備工作穩(wěn)定可靠,沒有對流形成渦旋,噪聲明顯下降,僅22~28dB(A),空氣及噪聲監(jiān)測均達(dá)標(biāo);病理技術(shù)室未監(jiān)測出甲醛及二甲苯,噪音監(jiān)測數(shù)據(jù)為22~29dB(A),遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于通風(fēng)設(shè)備的噪聲標(biāo)準(zhǔn)為≤65 dB(A),達(dá)到中國環(huán)境噪聲容許的夜間噪聲標(biāo)準(zhǔn)≤30dB(A)[8];技術(shù)室不配備通風(fēng)設(shè)備,減少了支出,并避免通風(fēng)設(shè)備尾氣倒灌污染,還節(jié)省大量的實驗室空間。
目前,病理常用的固定液有10余種,都各有不同的優(yōu)缺點,一般根據(jù)不同的實驗要求來選擇。4%中性甲醛仍然是使用最為廣泛的固定液,但會與蛋白質(zhì)形成交聯(lián)鏈,行免疫組織化學(xué)檢測時多數(shù)需要進(jìn)行抗原修復(fù)[16];4%多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)形成交聯(lián)鏈,因而不會影響抗體及探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),主要用于組織化學(xué)、原位雜交、免疫定位等[21,22]。傳統(tǒng)方法只能滿足4%甲醛固定的實驗,無法同時滿足多種實驗的需求。本實驗方法將固定液及固定步驟設(shè)置在脫水機(jī)外,脫水機(jī)內(nèi)使用75%酒精替代甲醛,不設(shè)置固定液及固定程序,提高組織脫水機(jī)的兼容性和機(jī)動性,可以同時滿足不同的實驗需求,降低組織脫水機(jī)運行的步驟和時間,提高工作效率。
本研究包含了豐富的組織類型,其中有脂肪較多的腦組織、延髓;血液較多的脾臟;組織致密實質(zhì)器官肝臟、腎臟;實質(zhì)與空腔交替的心臟、肺;空腔組織胸主動脈、腹主動脈、腸系膜上動脈、胃、結(jié)腸等;硬度較大的精囊腺以及質(zhì)地柔軟的睪丸,基本模擬了大部分人體不同質(zhì)地的標(biāo)本[1]。應(yīng)用改良法固定標(biāo)本,實驗結(jié)果取得優(yōu)秀的表現(xiàn),平均分均在90分以上,優(yōu)良率均為100%,優(yōu)級率均大于85%以上。此外,改良法固定應(yīng)用到4個科研課題在HE、免疫組織化學(xué)、Masson、PAS等病理常用染色技術(shù)中均取得了滿意的結(jié)果,其中的大鼠腸系膜上動脈平滑肌細(xì)胞炎癥模型標(biāo)本的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果經(jīng)PCR及免疫組織化學(xué)半定量分析也得到很好的證實。
綜上所述,本研究證實所采用的改良方法,即將固定液及固定步驟設(shè)置在組織脫水機(jī)外以及采用VAN-Clear取代二甲苯,確實能保證病理制片的質(zhì)量穩(wěn)定及診斷的安全可靠,還能有效的防止甲醛、二甲苯以及噪音對人體的危害,為病理實驗室有效控制空氣及噪音污染提供新的思路。還可以同時滿足不同實驗對固定液個性化要求,適用于多種臨床病理和科研工作;另外,降低設(shè)備的投入、節(jié)省大量的實驗室空間,提高實驗效率,完全可以替代傳統(tǒng)的方法。
中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志2021年1期