趙莎 馬澤剛

[摘要]目的 探討L型Ca2+通道阻斷劑伊拉地平對硫酸亞鐵誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞毒性的作用。方法 以MES23.5多巴胺能細(xì)胞系為觀察對象，利用流式細(xì)胞儀篩選Fe2+最適濃度，伊拉地平則選用實(shí)驗(yàn)室前期篩選濃度5 μmol/L。應(yīng)用免疫印跡法（Western blot）檢測與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)，初步評估伊拉地平對Fe2+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。結(jié)果 與對照組相比，40 μmol/L Fe2+組線粒體膜電位（ΔΨm）明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68.190，q=8.898，P<0.001）。與對照組相比，單獨(dú)加Fe2+組細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值明顯降低（F=6.856，q=6.055，P<0.01），而伊拉地平預(yù)處理可改善由Fe2+造成的Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值降低的現(xiàn)象，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=4.103，P<0.05）。結(jié)論 伊拉地平預(yù)處理可以抑制Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值降低，對Fe2+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷可能具有保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]伊拉地平;鈣通道阻滯藥;鐵;帕金森病;神經(jīng)保護(hù)

[中圖分類號]R338.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]2096-5532（2021）02-0190-04

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of isradipine， a blocker of L-type Ca2+ channels， on cytotoxicity induced by ferrous sulfate heptahydrate in MES23.5 cells.?Methods The MES23.5 dopaminergic cell line was selected for observation. Flow cytometry was used to screen out the optimal concentration of Fe2+， and a concentration of 5 μmol/L was determined for isradipine in previous laboratory analysis. Western blot was used to measure the expression of the apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax， and the protective effect of isradipine against Fe2+-induced cytotoxicity was evaluated.?Results Compared with the control group， the 40 μmol/L Fe2+ group had a significant reduction in mitochondrial membrane potential （ΔΨm） （F=68.190，q=8.898，P<0.001）. Compared with the control group， the Fe2+ alone group had a significant reduction in Bcl-2/Bax ratio （F=6.856，q=6.055，P<0.01）， while pretreatment with isradipine significantly improved the reduction in Bcl-2/Bax ratio caused by Fe2+ （q=4.103，P<0.05）.?Conclusion Pretreatment with isradipine can inhibit the reduction in Bcl-2/Bax ratio and thus exert a protective effect against cell injury induced by Fe2+.

[KEY WORDS]isradipine; calcium channel blockers; iron; Parkinson disease; neuroprotection

帕金森?。≒D）是一種常見的神經(jīng)退行性老年疾病，其病理特征是黑質(zhì)（SN）多巴胺（DA）能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失以及由此引起的紋狀體DA含量的耗竭[1]。病人表現(xiàn)出靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動遲緩、姿勢平衡障礙等運(yùn)動癥狀[2]，以及嗅覺障礙、抑郁、睡眠質(zhì)量差和認(rèn)知功能障礙等非運(yùn)動癥狀[3]。雖然PD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但越來越多的證據(jù)表明SN區(qū)過量的鐵沉積是PD發(fā)病的關(guān)鍵因素之一[4-5]。在高鐵作用下，大腦中過量的Fe2+會通過Fenton和Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧，從而引起蛋白質(zhì)的異常聚集，損傷神經(jīng)元，導(dǎo)致PD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[6]。正常情況下，鐵主要是通過轉(zhuǎn)鐵蛋白和二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（DMT1）等途徑進(jìn)入細(xì)胞[7]，但在PD等病理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)鐵蛋白在腦脊液中處于飽和狀態(tài)，表明非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵發(fā)揮主要作用[8]，即L型Ca2+通道（LTCC）可能參與了鐵的異常聚集[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)探究了LTCC阻斷劑伊拉地平（ISR）對硫酸亞鐵誘導(dǎo)的MES23.5多巴胺能細(xì)胞毒性的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為MES23.5多巴胺能細(xì)胞系（是由大鼠胚胎中腦神經(jīng)元與小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤膠質(zhì)瘤細(xì)胞融合而成的雜交瘤細(xì)胞），由大連醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院樂衛(wèi)東教授惠贈。胎牛血清（FBS），BI公司;DMEM/F12（1∶1）粉末，Gibco公司;多聚賴氨酸（poly-L），Sigma公司;青霉素/鏈霉素，索萊寶公司;二甲基亞砜（DMSO），Biosharp公司;硫酸亞鐵，Sigma公司;ISR，上海楊帆公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MES23.5多巴胺能細(xì)胞系用DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，該培養(yǎng)液中添加了10 mL的FBS、2 mL的青霉素/鏈霉素和4.4 mL的佐藤成分（含0.5 g/L胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白）。實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞以1×108/L的密度接種在涂有poly-L的培養(yǎng)瓶或者6孔培養(yǎng)皿中。

1.3 Fe2+最適濃度篩選

應(yīng)用不同濃度的硫酸亞鐵（0、20、40、60、80、100 μmol/L Fe2+）處理MES23.5細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測MES23.5多巴胺能細(xì)胞線粒體膜電位（ΔΨm）的變化。將細(xì)胞置于涂有poly-L的6孔板中培養(yǎng)2 d。以PBS洗滌3次后，使用1 mL羅丹明123（5 mg/L）在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，然后通過300目的細(xì)胞濾網(wǎng)收集并制成單細(xì)胞懸液。上流式細(xì)胞儀檢測，設(shè)置門控區(qū)域M1和M2作為標(biāo)記，使用Cell Quest軟件（BD Biosciences，美國）評估熒光強(qiáng)度的變化。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

在確定Fe2+最適濃度的基礎(chǔ)上，后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為4組：對照組、Fe2+組、Fe2++ISR組、ISR組。將細(xì)胞以1×108/L的密度種在6孔板中。第3天行分組處理細(xì)胞：對照組用酸性培養(yǎng)液孵育5 h;Fe2+組先用酸性培養(yǎng)液孵育1 h，再使用Fe2+孵育4 h;Fe2++ISR組用ISR預(yù)孵育1 h，再使用Fe2+孵育4 h;ISR組用酸性培養(yǎng)液孵育5 h。ISR選用實(shí)驗(yàn)室前期篩選濃度5 μmol/L。各組細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 免疫印跡法檢測Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)

細(xì)胞處理結(jié)束后，以PBS洗滌3次，每孔加入100 μL裂解液冰上裂解30 min。用刮板將細(xì)胞刮下，4 ℃下以12 000 r/min離心20 min。采用二辛可寧酸（BCA）法測定蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣量。用SDS-PAGE（8 mL）分離每泳道包含40 μg蛋白樣品的細(xì)胞裂解液，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用50 g/L的脫脂奶粉封閉2 h后，再加入Bcl-2、Bax（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗于4 ℃搖床過夜。次日，使用TBST洗滌3次，加入與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h。采用ECL法，通過化學(xué)發(fā)光的方式對抗原-抗體復(fù)合物進(jìn)行可視化，然后使用Image J系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Prism Graphpad 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果以x2±s形式表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Fe2+對MES23.5細(xì)胞ΔΨm的影響

用不同濃度的Fe2+處理MES23.5細(xì)胞24 h后，0、20、40、60、80、100 μmol/L Fe2+處理組細(xì)胞的ΔΨm分別為0.01±1.66、-4.67±3.77、-10.17±3.34、-17.67±1.92、-21.50±2.29和-29.78±2.17（n=6）。與對照組細(xì)胞相比較，20、40、60、80、100 μmol/L Fe2+處理組ΔΨm均有不同程度的降低（F=68.190，P<0.01），且ΔΨm降低呈濃度依賴性。若Fe2+對細(xì)胞毒性太小則損傷不夠，F(xiàn)e2+對細(xì)胞毒性太大則造成細(xì)胞不可逆死亡，因此選取濃度40 μmol/L的Fe2+用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值的比較

對照組、Fe2+組、Fe2++ISR組和ISR組細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值分別為1.04±0.12、0.82±0.03、0.97±0.12和0.99±0.08（n=4）。與對照組相比較，F(xiàn)e2+組Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值明顯降低（F=6.856，q=6.055，P<0.01）;ISR預(yù)處理可以明顯緩解由Fe2+誘導(dǎo)的Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=4.103，P<0.05）;ISR組與對照組Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值比較差異無顯著性（P>0.05）。

3 討 論

許多研究已經(jīng)證實(shí)，鐵的積累是PD的一個(gè)標(biāo)志[6]。有研究顯示，PD病人以及PD動物模型SN區(qū)DA能神經(jīng)元內(nèi)鐵水平較正常人或動物異常增高[10-11]。但是，尚不清楚SN中鐵蓄積的確切機(jī)制。眾所周知，鐵通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合進(jìn)入大腦[12]。但在鐵過載的情況下，轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和，非轉(zhuǎn)鐵蛋白途徑顯得尤為重要[13]。因此，包括DMT1和鈣通道介導(dǎo)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)在內(nèi)的非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵（NTBI）途徑已引起更多關(guān)注[14]。有研究結(jié)果表明，鐵可以通過LTCC進(jìn)入心肌細(xì)胞[15-16]，LTCC還介導(dǎo)鐵流入其他可興奮細(xì)胞，如胰腺β細(xì)胞[17]、腺垂體細(xì)胞[18]和神經(jīng)元[19]。因此我們推測，在鐵負(fù)載情況下，在DA能神經(jīng)元上廣泛表達(dá)的LTCC可能是鐵過量進(jìn)入DA能神經(jīng)元的重要替代路徑，而鐵的過量積累可能導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的損傷甚至死亡[20]。因此，LTCC阻滯劑可能通過阻斷鈣通道來緩解神經(jīng)元中的鐵超負(fù)荷，成為PD的新治療方法。目前，LTCC參與PD的確切機(jī)制仍不清楚，LTCC是否直接參與SN區(qū)鐵的聚集也不清楚，因此深入探討PD發(fā)病過程中LTCC與Fe2+聚集的相關(guān)性，對了解DA能神經(jīng)元的損傷機(jī)制十分重要。

LTCC主要以Cav1.2和Cav1.3亞型的形式存在于神經(jīng)元中[21-22]，其相應(yīng)的成孔亞基α1C以及α1D[23]在SN區(qū)DA能神經(jīng)元中功能性表達(dá)[24]。研究表明，DA能神經(jīng)元對Cav1.3鈣通道的異常依賴導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平升高，Ca2+進(jìn)入細(xì)胞會持續(xù)刺激線粒體氧化磷酸化，這可能是PD中SN區(qū)DA能神經(jīng)元更易受損的原因之一[25]。而Cav1.2鈣通道在平滑肌細(xì)胞[26]、神經(jīng)元[27]、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞[28]和感覺細(xì)胞等不同細(xì)胞中普遍表達(dá)[29-30]。有研究證實(shí)，在6-羥基多巴胺（6-OHDA）損傷的大鼠和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）處理的PD模型小鼠SN中，Cav1.2 α1亞基的表達(dá)顯著增加[23]。然而，迄今為止尚不清楚Cav1.2鈣通道對PD發(fā)病機(jī)制中鐵誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的影響。而之前的研究報(bào)道，在鐵負(fù)載條件下，LTCC可能是鐵進(jìn)入心肌細(xì)胞的主要途徑[31-32]。

本次研究首先利用不同濃度的Fe2+作用于MES23.5細(xì)胞[33]，通過流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞ΔΨm的變化，結(jié)果顯示，F(xiàn)e2+處理MES23.5細(xì)胞后，細(xì)胞△Ψm下降，提示線粒體功能受損。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)e2+組Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值較對照組明顯降低，而5 μmol/L的ISR預(yù)處理部分逆轉(zhuǎn)了Fe2+誘導(dǎo)的Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值的下降，表明LTCC可能參與了鐵積累引起的PD的發(fā)生?？傊陨辖Y(jié)果表明，ISR可能會抑制Fe2+誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞毒性，LTCC阻滯劑可能通過阻斷鈣通道來緩解神經(jīng)元中的鐵超負(fù)荷。

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（本文編輯 馬偉平）