包君麗，高欣元，張可，韓宇博，彭坤明，劉莉

1.青海大學，青海 西寧 810016；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150036； 3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150036；4.中國科學院大學深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518106

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是由于睡眠時反復上氣道塌陷，造成上氣道阻塞，引起呼吸暫停和通氣不足，伴有打鼾、睡眠結構紊亂、睡眠缺陷、低氧血癥、日間嗜睡、晨起頭痛等癥狀的綜合征。OSAS可導致高血壓、胰島素抵抗、心肌梗死、中風、心房顫動、心腦肺血管并發(fā)癥甚至多臟器損害，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和壽命[1]。持續(xù)氣道正壓通氣治療是OSAS最常用和最有效的治療方法，但不良反應較多、依從性差，使其臨床應用受限[2-3]。根據(jù)OSAS臨床癥狀，可將其歸屬于中醫(yī)學“鼾癥”范疇，中醫(yī)治療該病有豐富經(jīng)驗，相關研究取得了一定進展[4]。臨床研究表明，黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS療效顯著[5-7]。黃連溫膽湯出自陸廷珍《六因條辨》，用于治療病機為濕熱或痰熱的病癥，其寒溫并用，苦寒清熱降濁，辛溫燥濕通陽，苦降辛通，和陰陽而暢氣機，達濕熱、痰熱分消之勢[8-10]。然而，黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS的作用機制尚未明確。

網(wǎng)絡藥理學基于系統(tǒng)生物學，對藥物治療疾病的多成分、多靶點、多途徑網(wǎng)絡關系進行分析，闡釋藥物作用機制，可為中醫(yī)藥研究及應用提供方向[11]。分子對接是通過研究分子間（如配體和受體）相互作用，預測其結合模式和親合力的一種理論模擬方法[12]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法篩選黃連溫膽湯的有效活性成分，預測其治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS的相關靶點和通路，構建疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡，探討黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS的可能作用機制，并利用分子對接技術對黃連溫膽湯活性成分與痰熱內(nèi)蘊型OSAS關鍵靶點蛋白進行模擬結合研究。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分收集

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/TCMSP.php）[13]，以黃連溫膽湯組方藥物“黃連”“枳實”“茯苓”“竹茹”“半夏”“橘紅”“甘草”“生姜”為關鍵詞，在“Herb name”條目中檢索其化學成分，設定藥物篩選閾值為口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，獲得黃連溫膽湯的有效化合物成分信息。利用中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID，http://183.129.215.33/TCMID/ search/）[14]檢索TCMSP未收錄的化合物成分。

1.2 活性成分候選靶點對應基因收集

對TCMSP收集的化合物，通過TCMSP獲取靶點蛋白名稱；對TCMID收集的化合物，通過STITCH數(shù)據(jù)庫（http://Stitch.embl.de/）[15]尋找相應靶點蛋白。利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）[16]獲取靶點對應基因名稱及UniProtKB。

1.3 疾病相關靶點基因收集

通過PubMed數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/）查詢“阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征”的主題詞，分別為“obstructive sleep apnea”“obstructive sleep apnea syndrome”“obstructive sleep apnea hypopnea syndrome”，檢索GeneCards（https://www. genecards.org/）[17]、OMIM（https://omim.org/）[18]數(shù)據(jù)庫，將得到的基因進行整合，作為OSAS疾病基因。 參照《鼾癥中醫(yī)診療專家共識意見》[19]擬定痰熱內(nèi)蘊型OSAS辨證標準：①呼吸急促、鼻息灼熱；②口干、口渴、口臭；③小便短赤、大便秘結；④舌紅、苔黃膩、脈滑數(shù)。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，分別以“shortness of breath”“burning nose”“dry”“thirst”“halitosis”“short redurine”“stool constipate”“red tongue”“yellow and greasy tongue coating”“pulse slip number”為關鍵詞檢索對應基因，并將其按辨證標準分為4組，分別進行組內(nèi)基因去重，再組間合并，最后與OSAS疾病基因進行整合，即為痰熱內(nèi)蘊型OSAS疾病基因。利用R語言的VennDiagram函數(shù)將痰熱內(nèi)蘊型OSAS疾病基因與黃連溫膽湯主要活性成分對應的靶點基因取交集，獲取共有基因，作為黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS的潛在作用靶點。

1.4 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡構建與分析

剔除重復及與疾病無相關性的靶點，將剩余的藥物活性成分與治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS的潛在作用靶點及相關通路構建數(shù)據(jù)表，導入Cytoscape3.7.2軟件，構建活性成分-靶點網(wǎng)絡，展示藥物活性成分與治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS靶點間的關系。

1.5 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡構建

將黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS的潛在作用靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）[20]，獲取蛋白相互作用關系，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.2軟件進行可視化處理，通過cytoNCA插件計算度中心度（DC）、中介中心度（BC），用于衡量拓撲網(wǎng)絡的重要性。

1.6 GO分析及KEGG通路富集分析

將黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS的潛在作用靶點基因利用R語言的Clusterprofiler程序包進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，設定P≤0.05，得到相應的生物過程（BP）及KEGG通路。將所得KEGG數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.2軟件，進行可視化圖形繪制。

1.7 分子對接

從PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.pdb.org/）下載黃連溫膽湯重要化合物結合的候選蛋白質(zhì)的晶體結構，并用MOE軟件進行修飾，以去除配體、添加氫、去除水、優(yōu)化和修補氨基酸，并使所有候選靶點的能量最小化。使用MOE測試黃連溫膽湯化合物與候選靶蛋白之間的對接精度，因其具有較高的準確性和一致性。最佳對接姿態(tài)為預測構象與觀測X射線晶體構象的均方根偏差（RMSD）最小。RMSD≤4?的模型被認為是可靠的，RMSD≤2?的模型被認為是準確的。整體評估的綜合得分越小，表示分子之間的結合能越小，兩者之間有較好的結合性（一般小于-5）。同時，用不同顏色標記小分子結構，若兩者之間的結構空間有較大的重復區(qū)域，則表明小分子構象與配體之間的相似性較大。

2 結果

2.1 黃連溫膽湯候選活性成分

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到活性成分分別為黃連14個、枳實22個、茯苓15個、半夏13個、橘紅9個、生姜5個、甘草92個，檢索得到相應靶點。通過TCMID數(shù)據(jù)庫檢索到竹茹3個活性成分organic acids、glucides、aminoacids，通過STITCH數(shù)據(jù)庫檢索得到相應靶點。剔除重復和無靶基因的活性成分，共計134個。

2.2 黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征候選靶點

通過UniProt數(shù)據(jù)庫獲得黃連溫膽湯244個候選靶點的相應基因。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫得到OSAS相關基因1 929個，OMIM數(shù)據(jù)庫得到OSAS相關基因623個，去重后得到OSAS相關基因2 551個。再將痰熱內(nèi)蘊型基因與OSAS相關基因取交集，獲得痰熱內(nèi)蘊型OSAS靶點基因1 869個。將黃連溫膽湯候選靶點與痰熱內(nèi)蘊型OSAS候選靶點比對篩選，得到可能與痰熱內(nèi)蘊型OSAS有關的作用靶點118個。

2.3 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡

將黃連溫膽湯藥物活性成分和痰熱內(nèi)蘊型OSAS相關靶點通過Cytoscape3.7.2軟件構建疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡，見圖1。該網(wǎng)絡包括290個節(jié)點（134個活性成分，118個作用靶點）和2 186條邊?？梢钥闯?，黃連溫膽湯通過多成分對應多靶點發(fā)揮對痰熱內(nèi)蘊型OSAS的治療作用。

圖1 黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡

2.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡

通過STRING數(shù)據(jù)庫獲取黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS潛在作用靶點基因的蛋白相互作用關系，并通過Cytoscape3.7.2進行可視化，結果見圖2。該網(wǎng)絡共有118個節(jié)點、2 104條邊，DC值介于1～65，DC平均值為35.66，BC值介于0～691（圖2A）。選擇DC＞45的節(jié)點，共39個（圖2B綠色節(jié)點），生成子網(wǎng)絡（圖2C）。進一步選擇DC＞16的節(jié)點，共計10個（圖2C綠色節(jié)點），可認為這些靶點與黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS相關性較大。

圖2 黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS靶蛋白相互作用網(wǎng)絡

2.5 GO生物過程及KEGG通路

GO富集分析結果顯示，生物過程（BP）主要有對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、對細菌來源分子的反應（response to molecule of bacterial origin）、對營養(yǎng)水平的反應（response to nutrient levels）、氧化應激反應（response to oxidative stress）、對養(yǎng)分的反應（response to nutrient）等，見圖3。

圖3 黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS關鍵靶點GO富集分析（BP）

KEGG通路富集分析得到153條通絡，為準確了解黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS的作用機制，設置富集到相應通路的基因比例≥13.16%，將所得數(shù)據(jù)P值取對數(shù)后導入Cytoscape3.7.2進行可視化，結果見圖4。結合文獻找出可能與治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS相關的通路，并將其與痰熱內(nèi)蘊型OSAS靶點結合，得到關鍵靶點KEGG通路（見表1）。

表1 黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS關鍵靶點KEGG通路

圖4 黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS關鍵靶點KEGG通路富集分析

2.6 分子對接結果

通過分子對接驗證黃連溫膽湯候選化合物木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、黃芩素（baicalein）與潛在靶蛋白IL6（PDB ID：6NCO）、AKT1（PDB ID：5KCV）、CASP3（PDB ID：1RHM）和MMP9（PDB ID：6ESM）之間的對接精度，見圖5～圖8。結果表明，靶蛋白與對應化合物分子的得分＜-5，表明靶蛋白與化合物分子之間有較好的結合性，見表2。

圖5 黃連溫膽湯候選化合物與IL6分子對接示意圖

圖6 黃連溫膽湯候選化合物與AKT1分子對接示意圖

圖7 黃連溫膽湯候選化合物與CASP3分子對接示意圖

圖8 黃連溫膽湯候選化合物與MMP9分子對接示意圖

表2 黃連溫膽湯候選化合物與靶蛋白分子對接數(shù)據(jù)

3 討論

本研究結果顯示，黃連溫膽湯作用于痰熱內(nèi)蘊型OSAS的有效活性成分共134個，對應潛在作用靶點118個。通過分析這些靶點的生物過程及信號通路，探究黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS的作用機制，可為其臨床應用提供證據(jù)支持，并為進一步實驗研究提供思路。

根據(jù)靶蛋白相互作用網(wǎng)絡分析可知，黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS可能通過作用于IL（白細胞介素）-6、CASP3（半胱氨酸蛋白酶-3）、AKT1（蛋白激酶B1）、MMP9（基質(zhì)金屬蛋白酶9）等靶點發(fā)揮療效。IL-6是炎癥細胞因子網(wǎng)絡的關鍵成分，而OSAS是一個炎癥過程，這一過程可能促使上氣道狹窄，使患者缺氧加重[21-23]。OSAS通過間歇性缺氧導致IL-6細胞因子釋放，而IL-6介導的氣道局部炎癥又導致OSAS發(fā)生或加重[24]。Caspase-3活化后使細胞蛋白酶級聯(lián)切割放大導致細胞凋亡，亦可直接酶解抑凋亡基因Bcl-2觸發(fā)細胞凋亡。史艷紅等[25]研究表明，OSAS模型組大鼠海馬Caspase-3 mRNA表達過高。楊嶷芳等[26]發(fā)現(xiàn)，OSAS患者腭帆張肌中Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平明顯高于正常人，且與呼吸紊亂指數(shù)呈正相關。周彤等[27]研究發(fā)現(xiàn)，OSAS模型大鼠Caspase-3蛋白表達顯著升高，β-胡蘿卜素可降低Caspase-3蛋白表達，提示抑制Caspase-3蛋白表達可改善OSAS臨床癥狀。AKT1是AKT的一種亞型。杜娟等[28]利用慢性間歇低氧模擬OSAS，結果顯示間歇低氧小鼠肝細胞p-AKT蛋白表達減少。莊向華等[29]利用慢性間歇低氧模擬OSAS，發(fā)現(xiàn)OSAS大鼠脂肪組織p-Akt蛋白水平較對照組降低。MMP-9是一種蛋白水解酶，其主要參與細胞外基質(zhì)的分解。研究發(fā)現(xiàn)，OSAS患者血漿和血清中MMP-9表達增加，且與病情的嚴重程度有關[30-33]。宋愛玲[34]研究表明，慢性間斷性缺氧可引起小鼠腎小管上皮細胞MMP-9表達升高，提示MMP-9可能參與了OSAS腎損害的發(fā)生發(fā)展過程。Fang等[35]Meta分析結果顯示，OSAS患者MMP-9水平升高，且與OSAS嚴重程度有關。

通過KEGG通路富集分析可知，黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS主要涉及PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路等。研究發(fā)現(xiàn)，OSAS的間歇性低氧會抑制PI3K/Akt通路，從而加重氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡，造成神經(jīng)細胞損傷，導致認知功能障礙的發(fā)生[36]。Guan等[37]研究表明，白藜蘆醇可激活慢性間歇性低氧大鼠PI3K/AKT/mTOR通路，發(fā)揮其改善心肌肥厚、氧化應激和細胞凋亡的作用。MAPK信號轉(zhuǎn)導通路在炎癥反應、細胞凋亡中起重要作用，其可被缺氧、炎性因子等多種胞外信號激活，參與細胞分化、凋亡、炎癥反應等過程。張超等[38]研究結果顯示，間歇性低氧大鼠p38MAPK mRNA及蛋白表達顯著增高，其下游因子一氧化氮濃度顯著降低，內(nèi)皮素-1、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶水平顯著升高，提示間歇低氧可激活p38MAPK通路。葛麗蕎等[39]研究表明，p38MAPK抑制劑SB203580通過減輕軟腭組織中p-p38的表達，從而減輕慢性間歇性缺氧大鼠軟腭的損傷。NF-κB通路參與機體的炎癥反應、免疫應答，能調(diào)節(jié)細胞凋亡、應激反應，NF-κB過度激活與OSAS密切相關。姜秋芳[40]發(fā)現(xiàn)，慢性間歇低氧可以通過激活NF-κB通路導致大鼠肝臟炎性損傷。鄭慶等[41]發(fā)現(xiàn)，慢性間歇性缺氧兔主動脈內(nèi)皮細胞中NF-κB表達明顯升高，提示慢性間歇性缺氧可通過激活NF-κB導致兔早期動脈粥樣硬化改變，NF-κB通路激活是OSAS導致冠心病的機制之一。研究表明，OSAS患者由于反復缺氧，通過激活HIF-1信號通路使下游多種因子得以表達，從而引起OSAS的合并疾病[42]。Rosa等[43]研究顯示，慢性間歇低氧大鼠的HIF-1 mRNA水平顯著增加。

分子對接結果表明，本研究獲取的黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS的主要活性成分木犀草素、槲皮素、黃芩素與靶蛋白IL6、AKT1、CASP3、MMP9有較好的結合性。這些靶蛋白在PPI網(wǎng)絡中處于關鍵位置，并參與了關鍵通路，提示其在治療過程可能起關鍵作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法，從多方面闡釋了黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS的物質(zhì)基礎和分子機制（見圖9）?？梢钥闯觯S連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS具有多成分、多靶點、多通路的特點，可為其臨床應用及實驗研究提供思路與方向。

圖9 黃連溫膽湯治療痰熱內(nèi)蘊型OSAS作用機制示意