陳博威，鄭飄，易健，劉柏炎，3

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007； 3.益陽醫(yī)學高等?？茖W校，湖南 益陽 413000

新生兒缺血缺氧性腦?。╪eonatal hypoxic- ischemic encephalopathy，HIE）是圍產(chǎn)期常見疾病，可導致嬰兒腦癱、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病甚至死亡。目前西醫(yī)以亞低溫及神經(jīng)營養(yǎng)治療為主[1]。中醫(yī)在整體觀念和辨證論治原則指導下，其多環(huán)節(jié)、多靶點、整體調(diào)節(jié)方式在HIE療效與安全性方面具有一定優(yōu)勢。六味地黃湯為傳統(tǒng)補腎名方，具有調(diào)節(jié)細胞凋亡、代謝、增殖的作用[2]。本課題組前期通過對“腎通于腦”理論進行挖掘，認識到腎在腦的生長發(fā)育過程中占有重要地位，為六味地黃湯治療HIE提供了理論基礎(chǔ)[3-5]。臨床研究顯示，六味地黃湯可改善腦血流量、降低血黏度[6]。但既往研究均針對單一靶點與單一機制，無法系統(tǒng)闡明六味地黃湯治療HIE的分子機制。 目前，由長鏈非編碼RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）及mRNA組成的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)越來越受到重視。lncRNA不能直接編碼翻譯蛋白質(zhì)，但在轉(zhuǎn)錄后水平上，可作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA），通過特異性海綿吸附miRNA的方式，間接減少miRNA與下游靶基因的結(jié)合，從而實現(xiàn)對基因的調(diào)控[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達，并廣泛參與對大腦發(fā)育、神經(jīng)分化、突觸可塑性、認知與記憶功能的調(diào)控[8]。目前，lncRNA及miRNA的表達譜已在HIE疾病中被發(fā)現(xiàn)，提示其可能對HIE的疾病發(fā)展起重要作用[9-10]。基于前期研究認識，本研究通過生物信息學手段，輔以網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)，挖掘六味地黃湯治療HIE的活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，以期闡明該方多途徑、多靶點協(xié)同作用的分子機制，并為后續(xù)基礎(chǔ)和臨床研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 六味地黃湯活性成分篩選與作用靶點預測

運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）獲取六味地黃湯組方藥物熟地黃、山藥、茯苓、山茱萸、牡丹皮、澤瀉的活性成分。依據(jù)藥物的藥動學特性，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件[11]篩選活性成分。在該數(shù)據(jù)庫中輸入各活性成分，查詢其潛在作用靶點，并通過Perl軟件（https://www. perl.org）將靶點導入Uniprot數(shù)據(jù)庫（http://www. uniprot.org），獲取靶點官方基因名。

1.2 疾病差異表達lncRNA、miRNA、mRNA挖掘

從基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO，https://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo）下載編號為GSE121178的基因原始矩陣文件，該基因數(shù)據(jù)來自揚州大學，包含3個HIE新生兒的全血標本和3個正常新生兒的全血標本，基因芯片平臺為GPL22120（http://www.affymetrix.com）。通過Perl軟件和R語言（https://www.r-project.org），以Log2（FC）的絕對值＞1.5和P＜0.05為篩選條件進行基因數(shù)據(jù)挖掘，得出差異表達lncRNAs。借助Mircode數(shù)據(jù)庫（http://www.mircode.org）預測lncRNA結(jié)合的miRNA。將得到的miRNA結(jié)果映射到miRDB（http://mirdb.org）、miRTarBase（http://mirtarbase.mbc. nctu.edu.tw）、TargetScan（http://www.targetscan.org）數(shù)據(jù)庫，預測miRNA靶向調(diào)控的mRNA。

1.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Perl軟件將HIE疾病預測的mRNA與六味地黃湯預測靶點取交集，得到六味地黃湯治療HIE可能涉及的活性成分及關(guān)鍵lncRNAs、miRNAs、mRNAs，運用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。將上述關(guān)鍵mRNAs輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），并將物種設(shè)定為“homo sapiens”，最低互作得分設(shè)置為0.4，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 關(guān)鍵作用靶點GO功能及KEGG通路富集分析

運用R語言Biomanager、ClusterProfiler軟件包對得到的關(guān)鍵靶點進行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析可描述基因產(chǎn)物可能形式的分子功能、參與的生物過程和所處的細胞環(huán)境。KEGG通路富集分析通過將已知的基因組注釋信息進行分類，得出最顯著的生物學過程。

1.5 分子對接分析

先用ChemOffice16.0軟件將六味地黃湯主要活性化合物的3D結(jié)構(gòu)保存為.mol2格式并使其能量最小化。從PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載主要靶點3D結(jié)構(gòu).pdb格式，運用PyMOL軟件（https:// www.pymol.org）對蛋白進行去水、加氫等操作，利用Auto Dock 4.2軟件將化合物及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為.pdbqt格式，最后進行分子對接。一般認為，結(jié)合能＜-5 kcal/mol時，配體與受體可實現(xiàn)較好結(jié)合[12]。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃湯活性成分及作用靶點

通過TCMSP和Uniprot數(shù)據(jù)庫得到六味地黃湯活性成分，其中熟地黃2個、山茱萸13個、山藥12個、牡丹皮6個、澤瀉7個、茯苓6個，合并重復項后得到活性成分41個，潛在作用靶點194個，見表1。

表1 六味地黃湯活性成分

2.2 疾病差異lncRNA、miRNA、mRNA

基于GSE121178的基因芯片共得出217個差異基因（見圖1A），運用Perl軟件篩選出31個差異lncRNAs（見圖1B）。將差異表達的31個lncRNAs輸入Mircode數(shù)據(jù)庫，預測到546個lncRNA-miRNA的調(diào)控關(guān)系。通過miRDB、miRTarBase、TargetScan數(shù)據(jù)庫預測得到miRNA的靶向mRNA。為保證結(jié)果可靠，本研究僅選取被3個數(shù)據(jù)庫同時預測到的共1 900個miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系。

圖1 HIE疾病GEO芯片差異表達基因

2.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)

將預測到的靶向mRNAs與六味地黃湯作用靶點取交集，得到有效成分33個，藥物-疾病關(guān)鍵lncRNAs 13個，關(guān)鍵miRNAs 20個，關(guān)鍵mRNAs 33個。運用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖2。活性成分按節(jié)點度大小依次有槲皮素（Quercetin，MOL000098）、山柰酚（Kaempferol，MOL000422）、(+)-兒茶素（(+)-Catechin，MOL000492）、薯蕷皂苷元（Diosgenin，MOL000546）等，見表2。由13個關(guān)鍵lncRNAs、20個關(guān)鍵miRNAs、33個關(guān)鍵mRNAs構(gòu)成的三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)見圖3。其中，H19與miR-17-5p分別在lncRNA組及miRNA組的靶基因數(shù)目最多，見表3。借助STRING數(shù)據(jù)庫，隱去無相互作用的蛋白后，繪制包含31個節(jié)點和198條邊的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中，節(jié)點度居前列的核心作用基因有MYC、JUN、VEGFA、CCND1、ESR1、MAPK1、PTGS2、FOS、MAPK8、CDKN1A等，見圖4。

圖4 六味地黃湯治療HIE蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)與核心作用基因

表3 六味地黃湯治療HIE三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)主要基因及其靶點

圖2 六味地黃湯活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

表2 六味地黃湯主要活性成分節(jié)點度

圖3 六味地黃湯治療HIE lncRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)

2.4 關(guān)鍵靶點富集分析

對關(guān)鍵靶點進行GO功能及KEGG通路富集分析，共獲得679個GO功能富集結(jié)果，其中分子功能主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性與DNA、RNA聚合酶活性等，生物過程主要富集在對激素、氧濃度反應等，細胞組分主要富集在RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復合物及核轉(zhuǎn)錄因子復合物上。KEGG通路富集分析得到107條通路，主要包括PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路及Wnt信號通路。此外，還可能涉及調(diào)控細胞衰老、細胞周期及細胞凋亡等，提示六味地黃湯治療HIE與多條通路、多個生物過程有關(guān)。見圖5、表4。

表4 六味地黃湯治療HIE關(guān)鍵靶點KEGG通路富集分析主要通路及相關(guān)基因

圖5 六味地黃湯治療HIE關(guān)鍵靶點GO功能及KEGG通路富集分析

2.5 分子對接結(jié)果

將六味地黃湯治療HIE節(jié)點度值排名居前列的槲皮素、山柰酚、(+)-兒茶素及薯蕷皂苷元等活性成分與主要KEGG通路PI3K-Akt信號通路的2個標志蛋白PIK3CA（PBD ID：2RD0）、AKT1（PBD ID：1H10-1）進行分子對接。結(jié)果顯示各活性成分與PIK3CA、AKT1的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，表明其均能與靶點較好結(jié)合，其中薯蕷皂苷元分別與2個靶點的結(jié)合能最低，見表5、圖6。

表5 六味地黃湯中主要活性成分的分子對接結(jié)合能

圖6 薯蕷皂苷元與PIK3CA、AKT1分子對接示意圖

3 討論

HIE發(fā)病機制較為復雜，其腦損傷為多重因素、多種機制交互作用發(fā)生的“瀑布式”病理變化，包括神經(jīng)細胞能量代謝障礙、神經(jīng)炎性毒性損傷等[1]，因此單一藥物或措施無法逆轉(zhuǎn)其病理改變。中藥具有多組分、多靶點的特點，能夠?qū)膊〉牟煌±憝h(huán)節(jié)發(fā)揮協(xié)同作用，為治療HIE提供了新思路。根據(jù)HIE臨床表現(xiàn)，可將其歸屬中醫(yī)學“初生不啼”“胎搐”等范疇，主要病機為先天精血虧虛，胎元不足?；凇澳I藏精，精生髓，髓聚腦”的“腎腦相關(guān)”理論，治以補腎固本、填精益髓，六味地黃湯為代表方劑。既往研究表明，六味地黃湯能清除HIE大鼠腦組織內(nèi)的氧自由基，并能通過調(diào)控低氧誘導因子-1α的基因表達，促進HIE大鼠病變腦組織的修復[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯中槲皮素、山柰酚、(+)-兒茶素及薯蕷皂苷元等活性成分與HIE疾病密切相關(guān)，另外通過STRING數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)MYC、JUN、VEGFA、CCND1、ESR1及MAPK1等可能是蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵蛋白。相關(guān)研究亦證實了上述成分及靶點的作用，如槲皮素能抑制HIE大鼠的神經(jīng)細胞凋亡，并促進神經(jīng)再生[14-15]；山柰酚具有抑制神經(jīng)炎性損傷及保護血腦屏障的作用[16]；(+)-兒茶素能通過改善能量代謝及拮抗神經(jīng)毒性的方式，改善缺血缺氧神經(jīng)元活性[17]；薯蕷皂苷元能通過抑制小膠質(zhì)細胞活化降低炎癥反應，減輕腦損傷[18]。關(guān)鍵蛋白中的FOS與MAPK1屬于應激蛋白激酶，在神經(jīng)系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導中具有重要作用，廣泛參與神經(jīng)細胞的生長和分化等生理過程[19]。CCND1屬細胞周期家族，具有調(diào)控細胞生長、分裂與死亡的作用[20]。VEGFA為血管內(nèi)皮生長因子家族成員，與大腦缺血缺氧后的血管新生密切相關(guān)[21]。ESR1是一種雌激素受體，有研究表明ESR1具有維持神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的作用[22]。此外，分子對接結(jié)果顯示主要活性成分均能與標志靶點較好結(jié)合，一定程度上驗證了本研究的準確性。

在KEGG通路富集分析結(jié)果中，居前列的PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路是大腦缺血缺氧后的重要調(diào)控通路，與氧化應激、炎癥反應及凋亡等病理過程密切相關(guān)[23-24]。PI3K-Akt通路是調(diào)控細胞生長、代謝及存活的經(jīng)典通路，并且廣泛參與了許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[25]。研究表明，HIE新生兔模型中PI3K-Akt通路被激活，并抑制神經(jīng)元的凋亡[26]，阻斷PI3K-Akt通路則會誘導腦內(nèi)炎癥反應及細胞凋亡，加重神經(jīng)功能損害[27]。有實驗顯示，在腦缺血后活化的MAPK通路會激活Nrf2通路，而補腎中藥能夠抑制MAPK通路的磷酸化，扭轉(zhuǎn)Nrf2核移位，減少氧化應激[28]；亦有研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路與炎癥反應密切相關(guān)，其在大腦缺血后可激活下游的NF-κB通路，促進炎癥反應[29]，而抑制MAPK通路活化則可以減輕炎癥反應，具有神經(jīng)保護作用[30]。此外，IL-17信號通路、TNF信號通路為腦損傷后主要的炎癥反應通路[31]。前期研究顯示，腦損傷后會導致腦內(nèi)炎癥“級聯(lián)反應”產(chǎn)生，而六味地黃湯能夠抑制炎癥反應，減輕腦損傷[4]。Wnt信號通路則是腦損傷后神經(jīng)再生的重要調(diào)控通路[32]。綜上，六味地黃湯治療HIE的作用機制與多條通路、多個生物過程存在一定的聯(lián)系，這與中醫(yī)標本兼治的整體觀念相吻合，同時體現(xiàn)了中藥復方多靶點、多環(huán)節(jié)的治療特點。

基于生物信息學技術(shù)，本研究初步構(gòu)建了六味地黃湯治療HIE的lncRNA-miRNA-mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，其中，H19和miR-17-5p分別在lncRNA組及miRNA組節(jié)點度值最高，且miR-17-5p可以靶向調(diào)控KEGG通路富集居前列的PI3K-Akt通路及MAPK通路中MAPK1、CCND1、CDKN1A等多個基因。lncRNA H19與中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系密切，有研究顯示其在大腦缺血后表達顯著增加，并且與美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評分及腫瘤壞死因子-α表達水平呈正相關(guān)[33]；敲除lncRNA H19則會抑制腦缺血后的炎癥反應，并促進神經(jīng)再生[34]。lncRNA H19還能作為ceRNA海綿吸附miR-17-5p[35]，且敲除lncRNA H19可上調(diào)miR-17-5p的表達[36]。miR-17-5p不僅能在腦缺血后抑制下游PTEN基因表達進而磷酸化PI3K-Akt通路，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[37]，還能通過抑制下游p38-MAPK表達水平，減少HIE大鼠的神經(jīng)細胞凋亡[38]。此外，有研究顯示miR-17-5p能夠通過抑制炎癥反應等方式促進HIE大鼠的神經(jīng)修復[39]。上述研究表明，lncRNA H19/miR-17-5p網(wǎng)絡(luò)是一個與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護及修復有密切聯(lián)系的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，據(jù)此推測六味地黃湯治療HIE過程中，lncRNA H19可能作為ceRNA海綿參與miR-17-5p對下游各類基因的調(diào)控，進而具有影響神經(jīng)修復的作用。

綜上所述，本研究運用生物信息學及網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，初步探討了六味地黃湯治療HIE的有效成分及其潛在作用靶點，并構(gòu)建了lncRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)靶基因與大腦缺血缺氧后的氧化應激、炎癥反應及凋亡等病理過程密切相關(guān)，還預測lncRNA H19/miR-17-5p軸可能是其重要ceRNA調(diào)控軸，并進行了分子對接驗證，可為六味地黃湯的臨床運用和實驗研究提供依據(jù)和方向?？紤]到中藥活性成分在煎煮過程中及進入體內(nèi)可能發(fā)生的復雜變化，有必要通過后續(xù)實驗進一步驗證。