劉司南，黃子超，畢文超，崔瑞霞，曲 凱，劉 昌

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061；2. 陜西省腫瘤醫(yī)院，陜西西安 710061；3. 西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院，陜西西安 710054)

肝硬化是世界范圍內(nèi)的重要健康問(wèn)題，尚缺乏有效治療[1-2]。肝移植是目前唯一根治方法，但并不能滿足臨床需求[3]。肝纖維化是肝硬化的早期狀態(tài)，是肝臟損傷后，炎癥遷延所致的過(guò)度修復(fù)反應(yīng)[4-5]。已證實(shí)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。肝臟損傷后，炎癥介質(zhì)促進(jìn)HSC活化、增生[6]，產(chǎn)生膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular metrics, ECM)，引起肝臟結(jié)構(gòu)重塑[7-8]。因此，抑制活化的HSC成為治療肝纖維化的重要切入點(diǎn)[9]。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等多種細(xì)胞因子，與HSC表面的特異受體結(jié)合會(huì)激活HSC[10]。其中，PDGF是HSC最強(qiáng)的有絲分裂原，通過(guò)與HSC表面的受體酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinases, RTKs)結(jié)合，促進(jìn)HSC活化、增殖[11]，VEGF作用機(jī)制與其相仿。

阿西替尼(Axitinib)是新一代強(qiáng)效的多靶點(diǎn)酪氨酸激酶受體抑制劑，可靶向阻滯PDGFR和VEGFR-1/2/3，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，目前已應(yīng)用于腎癌、結(jié)腸癌的治療[12-14]。據(jù)此推斷其可能影響活化HSC的細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡而在肝纖維化治療中發(fā)揮作用。本研究通過(guò)觀察阿西替尼對(duì)CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝組織纖維增生的影響以及對(duì)體外HSC系(LX2)細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡的影響，探究其在抗肝纖維化治療中的作用，為肝硬化的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物阿西替尼(AG-013736)購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司。8周齡C57BL/6小鼠48只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量25～35 g，清潔級(jí)，按12 h/12 h明暗周期飼養(yǎng)。人肝細(xì)胞系LO2細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，人LX2購(gòu)自湖南湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)。

1.2 造模及分組與取材應(yīng)用四氯化碳(carbon tetrachloride, CCL4)橄欖油溶液2 mL/kg腹腔注射，每周2次，連續(xù)4周，誘導(dǎo)小鼠肝臟纖維化模型。實(shí)驗(yàn)分為6組(各組n=8)。對(duì)照組僅腹腔注射2 mL/kg的橄欖油，每周2次，連續(xù)4周；CCl4造模2周組、4周組，用CCl4橄欖油溶液分別造模處理2周、4周后處死，阿西替尼治療1周組、2周組于造模4周時(shí)給予阿西替尼CMC稀釋液600 μg/只灌胃，每周2次，分別共給藥1周、2周時(shí)處死；CMC對(duì)照組于造模4周時(shí)給予CMC 10 mg/mL的工作液灌胃2周(2次/周)。于各組處理終點(diǎn)處死小鼠后取材肝組織，以100 mL/L甲醛固定，制作石蠟切片，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 肝組織切片染色對(duì)各組切片進(jìn)行HE染色與Masson染色，顯微鏡下觀察。光鏡下，膠原纖維被染成藍(lán)綠色，每樣本隨機(jī)選取15個(gè)高倍視野(200×)，采用Motic Med數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行膠原纖維陽(yáng)性面積半定量，分析判斷膠原面積密度變化。

α-SMA免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟，修復(fù)抗原，30 mL/L過(guò)氧化氫阻斷后，鼠單抗α-SMA(美國(guó)Santa Cruz公司)，4 ℃過(guò)夜，按照SP法試劑盒(中山生物)說(shuō)明書(shū)操作，DAB(中杉金橋)顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封固，顯微鏡下拍照觀察蛋白定位、評(píng)分、陽(yáng)性染色面積分析。結(jié)果判定：每張切片均勻區(qū)域隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，細(xì)胞數(shù)≥1 000/視野。觀察每個(gè)視野細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞以及染色強(qiáng)弱度，計(jì)算組織切片免疫組化得分(immunohistochemical score, IHS)，根據(jù)Remmele和Stegner提出的免疫反應(yīng)積分(IRS)打分法，使用染色強(qiáng)度(Sl)及陽(yáng)性細(xì)胞百分比(PP)計(jì)算：公式即IRS=SI×PP[15]。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性復(fù)蘇LO2細(xì)胞及LX2細(xì)胞后培養(yǎng)、傳代，同步后種入96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。調(diào)零組僅加入培養(yǎng)基，對(duì)照組為培養(yǎng)基+同步化細(xì)胞，不同干預(yù)濃度的藥物實(shí)驗(yàn)組為培養(yǎng)基+某濃度阿西替尼+同步化細(xì)胞，于培養(yǎng)48、72 h時(shí)分別取96孔板，加入20 μL MTT溶液，再培養(yǎng)4 h，終止并加入150 μL DMSO，震蕩混勻，放入酶標(biāo)儀檢測(cè)。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，計(jì)算各組的平均值，計(jì)算IC50，繪制抑制率曲線。

1.5 Annexin-V/PI聯(lián)合標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡LO2細(xì)胞及LX2細(xì)胞同步化后種于6孔板，分為溶劑對(duì)照組及62.5、250、500、1 000 μmol/L阿西替尼組分別進(jìn)行干預(yù)。于48、72 h時(shí)收集細(xì)胞，漂洗后進(jìn)行Annexin-V染色(按照Annexin-V/PI聯(lián)合標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行)，將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液。置于488 nm波長(zhǎng)激發(fā)光的流式細(xì)胞儀上進(jìn)行凋亡檢測(cè)，上機(jī)測(cè)定時(shí)獲取1×104個(gè)以上細(xì)胞，重復(fù)2次后分析結(jié)果。

1.6 Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)按照1.4項(xiàng)中分組干預(yù)細(xì)胞48 h，裂解細(xì)胞離心后收集蛋白并測(cè)定濃度。制備100 g/L聚丙烯酰胺凝膠，上樣后90 V電泳90 min后，于250 mA，濕轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜，100 g/L PBST脫脂牛奶封閉2 h，一抗孵育過(guò)夜(Caspase3，1∶1 000；Fas，1∶3 000；Bcl-2，1∶2 000；Caspas8，1∶500；β-actin，1∶5 000)，PBST洗膜3次，10 min/次，二抗孵育1 h(先鋒生物，1∶10 000)，再次洗膜3次，步驟同前。最后進(jìn)行暗室發(fā)光并采集圖像，應(yīng)用蛋白灰度與內(nèi)參灰度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的組織病理學(xué)觀察肝臟組織HE染色顯示(圖1)：對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常。CCL4造模2周組肝組織正常小葉結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)及中央靜脈增多，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；造模4周組肝細(xì)胞大片壞死并被白色纖維結(jié)締組織取代，小葉結(jié)構(gòu)消失。

圖1 小鼠肝臟組織病理學(xué)HE染色

2.2 Masson染色結(jié)果Masson染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CCL4造模組可見(jiàn)膠原纖維為主的ECM明顯增多，分布于匯管區(qū)及中央靜脈周圍，并伸入肝小葉內(nèi)包繞肝細(xì)胞形成假小葉，肝小葉結(jié)構(gòu)喪失；阿西替尼治療1周組和治療2周組的小鼠肝組織中央靜脈周圍和匯管區(qū)膠原纖維較前減少；CCL4造模2周組、4周組的膠原面積密度半定量測(cè)定分別為(13.67±0.68)%、(24.43±4.21)%，明顯高于對(duì)照組的(1.73±0.31)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；阿西替尼治療1周組及治療2周組分別為(17.63±1.51)%、(11.15±1.242)%，明顯低于造模4周組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而CMC對(duì)照組的膠原面積密度為(27.09±3.07)%，與造模4周組比較差異不明顯(P>0.05，圖2)。

2.3 各組小鼠肝組織中α-SMA的表達(dá)變化免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CCL4造模2周組、4周組的小鼠肝臟組織α-SMA 陽(yáng)性染色面積比率分別為(4.92±0.30)%、(30.62±9.14)%，免疫反應(yīng)積分(IRS)分別為(1.6±0.2)和(5.0±0.4)分；而阿西替尼治療1周組、2周組陽(yáng)性面積比率及免疫反應(yīng)積則分別為(11.12±0.31)%、(6.93±1.08)%和(3.07±0.42)、(1.67±0.42)分，α-SMA陽(yáng)性表達(dá)呈下降趨勢(shì)。與CCL4造模4周組及CMC對(duì)照組[(28.52±6.23)%、(5.27±0.11)分]的差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 小鼠肝組織α-SMA免疫組化染色(200×)

2.4 阿西替尼對(duì)肝細(xì)胞活性及凋亡的作用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿西替尼各濃度組間的LX2抑制率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。干預(yù)48、72 h，阿西替尼對(duì)LX2活性的50%抑制濃度(IC50)分別為127.6、284.5 nmol/L。LX2抑制率的擬合曲線顯示，阿西替尼對(duì)LX2細(xì)胞活性的48、72 h抑制作用均隨著藥物濃度增高而逐漸增高(圖4A、4B)。而對(duì)LO2組細(xì)胞活性抑制作用不顯著，僅高濃度組(1 000 nmol/L)同未干預(yù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，與對(duì)照溶劑組比較，250 nmol/L阿西替尼干預(yù)組48 h時(shí)的LX2細(xì)胞凋亡率即開(kāi)始升高，且凋亡率隨著各干預(yù)組濃度增加而增高，72 h時(shí)抑制作用更加明顯(圖4C)。而LO2組干預(yù)48、72 h，低濃度各組凋亡率與對(duì)照溶劑組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，僅濃度達(dá)500、1 000 nmol/L時(shí)凋亡率與溶劑對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4D)。

圖2 各組肝臟組織Masson染色(200×)及膠原沉積面積(面積密度%)的比較Fig.2 Masson staining (200×) and collagen deposition area (area density%) in liver tissue膠原沉積染色為藍(lán)綠色。A:對(duì)照組;B:CCL4造模2周組;C:CCL4造模4周組;D:CMC對(duì)照組;E:阿西替尼治療1周組;F:阿西替尼治療2周組;G:統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。ns:兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 阿西替尼作用于肝星狀細(xì)胞系LX2和肝細(xì)胞系LO2的影響

2.5 LX2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化Western blotting檢測(cè)顯示，與溶劑對(duì)照組比較，阿西替尼干預(yù)LX248 h，自250 nmol/L濃度組開(kāi)始，各組Fas、Caspase-8及Caspase-3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；各濃度組Fas、Caspase-8以及Caspase-3蛋白表達(dá)均上調(diào)，而B(niǎo)cl-2明顯下調(diào)，且與藥物濃度存在依賴關(guān)系；而LO2細(xì)胞株各濃度組蛋白表達(dá)與對(duì)照組差異不明顯，僅1 000 nmol/L高濃度組有差異(P<0.05，圖5)。

圖5 Western blotting檢測(cè)阿西替尼處理的LX2(A)及LO2細(xì)胞(B)中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

HSC是肝纖維化反應(yīng)的重要效應(yīng)器，也是細(xì)胞因子的主要來(lái)源和靶點(diǎn)[16]。慢性肝病中，細(xì)胞因子的釋放刺激HSC活化和增殖，通過(guò)自分泌或旁分泌方式釋放PDGF等因子并表達(dá)相應(yīng)的受體，導(dǎo)致膠原等ECM過(guò)量沉積，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生進(jìn)展[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，靜止的HSC并不表達(dá)PDGFR，僅當(dāng)其活化后才會(huì)表達(dá)[19-21]。抑制酪氨酸激酶受體PDGFR、VEGFR活性，可能引起活化的HSC的系列變化，進(jìn)而影響肝纖維化的進(jìn)一步進(jìn)展。阿西替尼為一種多靶點(diǎn)酪氨酸激酶受體抑制劑，能夠阻止多個(gè)酪氨酸激酶受體活性，可能誘導(dǎo)活化的HSC凋亡，發(fā)揮抗纖維化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CCL4可以誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，肝纖維化程度逐漸加重。同時(shí)，Masson染色結(jié)果顯示，應(yīng)用阿西替尼治療組小鼠肝臟膠原沉積面積較溶劑對(duì)照組和造模組大幅下降，提示阿西替尼可以改善CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化模型的膠原組織增生狀況。這一結(jié)果與MEJIAS等[19]應(yīng)用索拉非尼治療膽管結(jié)扎(BDL)大鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。

活化的HSC產(chǎn)生膠原等ECM的累積可導(dǎo)致肝纖維化形成。為明確阿西替尼治療時(shí)膠原沉積減少是否與其影響活化的HSC有關(guān)，進(jìn)而應(yīng)用免疫組化實(shí)驗(yàn)標(biāo)記已知的HSC的活化標(biāo)記物α-SMA觀察阿西替尼干預(yù)小鼠肝臟活化HSC的表達(dá)，結(jié)果顯示，阿西替尼組肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞(活化的HSC)面積比率較CCL44周造模組及CMC對(duì)照組顯著降低，這提示阿西替尼通過(guò)使活化的HSC減少而抑制肝纖維化進(jìn)程。

酪氨酸激酶抑制劑如尼羅替尼、索拉非尼等能夠通過(guò)影響活化HSC而發(fā)揮一定的抗肝纖維化作用[22-23]。本研究進(jìn)一步通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)阿西替尼嚴(yán)重抑制肝星狀細(xì)胞系LX2的細(xì)胞活性，且效應(yīng)具有濃度依賴性。據(jù)此推測(cè)，阿西替尼可能通過(guò)影響活化HSC的活性發(fā)揮抗纖維化作用。研究報(bào)道，活化的HSC中NF-κB通路激活，誘導(dǎo)抗凋亡蛋白如Bcl-2等表達(dá)升高，從而抵抗細(xì)胞死亡刺激[24]。有文獻(xiàn)報(bào)道，誘導(dǎo)活化的HSC凋亡可減輕肝纖維化[25]，因此，誘導(dǎo)HSC細(xì)胞死亡對(duì)肝纖維化的治療具有潛在價(jià)值。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同濃度阿西替尼干預(yù)LX2后，其凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)明顯增加。這證實(shí)了阿西替尼可誘導(dǎo)活化的HSC發(fā)生凋亡。本研究還檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)阿西替尼誘導(dǎo)HCS凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)Fas/Fas-L激活一系列Caspase家族的酶聯(lián)反應(yīng)和下調(diào)Bcl-2/Bax而實(shí)現(xiàn)的。此外，實(shí)驗(yàn)設(shè)置的LO2對(duì)照組被阿西替尼抑制的IC50范圍遠(yuǎn)大于LX2，且僅較高濃度時(shí)凋亡相關(guān)蛋白才顯示出差異。這提示在一定濃度范圍內(nèi)，阿西替尼治療較為安全。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)镠SC激活后其表面表達(dá)PDGFR、VEGFR等多種酪氨酸受體激酶，導(dǎo)致其對(duì)于阿西替尼藥物敏感性增高所致，但尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究初步驗(yàn)證了阿西替尼可以通過(guò)抑制活化的HSC活性，誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)揮抗肝纖維化作用，且在合適的劑量范圍內(nèi)阿西替尼對(duì)肝星狀細(xì)胞的抑制作用不會(huì)引起正常肝細(xì)胞的損傷和凋亡。這為阿西替尼治療肝纖維化的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，但還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究其具體機(jī)制和治療安全性。