張 遠(yuǎn) 關(guān)鳳軍 于 跑 陳 娜 邱 閃 彭倩倩

兒童頻繁復(fù)發(fā)/激素依賴腎病綜合征(frequent relapse nephrotic syndrome/steroid-dependent nephrotic syndrome，F(xiàn)RNS/SDNS)臨床上較為棘手，發(fā)生率較高[1]。目前FRNS/SDNS的標(biāo)準(zhǔn)治療是在糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)基礎(chǔ)上加用各種免疫抑制劑，或者反復(fù)加大GC劑量，但臨床療效仍不理想[2]。近年來研究報(bào)道應(yīng)用利妥昔單抗(rituximab, RTX)治療FRNS/SDNS可顯著降低其復(fù)發(fā)率，該藥的主要作用機(jī)制是通過結(jié)合B淋巴細(xì)胞表面的CD20抗原從而導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞凋亡，或者通過抑制B淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞之間的相互作用，從而可預(yù)防FRNS/SDNS的復(fù)發(fā)[1，3，4]。RTX有效治療FRNS/SDNS的機(jī)制證實(shí)了B淋巴細(xì)胞數(shù)量增多以及異?；罨瘏⑴c了(primary nephrotic syndrome，PNS)的發(fā)病。基于此，進(jìn)一步探討FRNS/SDNS中與B淋巴細(xì)胞活化相關(guān)的因素，以期為優(yōu)化RTX的治療、進(jìn)一步減少該疾病的復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。

資料與方法

1.一般資料：選擇2018年10月～2019年7月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院診斷為初發(fā)PNS患兒70例，隨訪時(shí)間1年，所有患兒均給予誘導(dǎo)緩解及鞏固維持治療。根據(jù)其對GC的療效及隨訪期間復(fù)發(fā)頻次，排除不符合標(biāo)準(zhǔn)的PNS患兒，最終納入本研究患兒58例，其中FRNS/SDNS組38例，其中男患兒21例，女患兒17例，患兒年齡1.3～14.2(6.7±3.4)歲；非頻復(fù)發(fā)腎病綜合征(non-frequent relapses nephrotic syndrome，NFRNS)組患兒20例，其中男患兒12例，女患兒8例，患兒年齡2.0～13.0(7.1±3.6)歲；另選取年齡、性別相匹配的健康體檢兒童20例作為對照組，其中男性9例，女性11例，兒童年齡1.6～12.0(6.6±3.2)歲。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的《兒童激素敏感、復(fù)發(fā)/依賴腎病綜合征診治指南(2016年)》的標(biāo)準(zhǔn)[5]。各組性別、年齡等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批通過。

2.治療方法與療效判定：(1)治療方法：所有患兒初次發(fā)病時(shí)均給予醋酸潑尼松片(江蘇恒瑞制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H41020636)2mg/(kg·d)分3次口服治療，正規(guī)減量。完全緩解以血生化、尿檢完全正常為標(biāo)準(zhǔn)。所有患兒均在完全緩解后l周復(fù)測各項(xiàng)指標(biāo)。(2)療效判定：PNS復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)3天，24h尿蛋白定量≥50mg/kg，或晨尿的尿蛋白/肌酐(mg/mg)≥2.0，或晨尿蛋白由陰性轉(zhuǎn)為(+++)～(++++)。NFRNS：首次完全緩解后6個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)1次，或1年內(nèi)復(fù)發(fā)1～3次。SDNS：對GC敏感(以潑尼松足量[2mg/(kg·d)或 60mg/(m2·d)]治療≤4 周尿蛋白轉(zhuǎn)陰者)，但連續(xù)2次減量或停藥2周內(nèi)復(fù)發(fā)者。FRNS：經(jīng)GC標(biāo)準(zhǔn)療程治療后緩解，但病程中半年內(nèi)復(fù)發(fā)≥2次，或1年內(nèi)復(fù)發(fā)≥4次[5]。

3.主要試劑和儀器：藻青蛋白(allophycocyanin, APC)標(biāo)記的抗人CD19抗體、異硫氰熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的抗人Notch1抗體、藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)標(biāo)記的抗人Notch2抗體(美國BD Biosciences公司)，人跨膜受體蛋白Notch1、Notch2、sCD23 ELISA試劑盒(上海江萊生物有限公司)。

4.方法：(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測CD19+B淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)：測FRNS/SDNS組、NFRNS組GC初治前及治療后和健康對照組清晨空腹1ml EDTA抗凝靜脈血，首先測得總淋巴細(xì)胞絕對數(shù)；取100μl EDTA抗凝血，加入APC-CD19抗體，PBS洗滌，分析CD19+B淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，計(jì)算出B淋巴細(xì)胞絕對數(shù)。(2)CD19+B淋巴細(xì)胞Notch1、Notch2表達(dá)率測定：取兩根流式管，分別標(biāo)記為 B-1、B-2，B-1為同型對照組，B-2為待檢測組；B-1管加入抗APC、FITC和PE標(biāo)記的同型抗體，B-2管加入抗CD19(APC)、抗Notch1(FITC)和抗Notch2(PE)抗體；向B-1、B-2管中各加入混勻的50μl待測樣品，室溫避光孵育，37℃水浴，PBS洗滌1次，分析得出B淋巴細(xì)胞上Notch1、Notch2表達(dá)的相對數(shù)(百分?jǐn)?shù))。(3)ELISA法檢測外周血清中Notch1、Notch2、sCD23的表達(dá)量：根據(jù)ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行。(4)臨床和研究室指標(biāo)：收集各組患兒初次的發(fā)病年齡、性別、GC治療前后尿蛋白定量(urine protein quantification，UCFP)、IgG等指標(biāo)。

結(jié) 果

1.各組研究指標(biāo)比較：GC治療前，與健康對照組比較，F(xiàn)RNS/SDNS組、NFRNS組的UCFP、sCD23、CD19+B淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)、Notch1表達(dá)明顯升高，IgG降低，且FRNS/SDNS組較NFRNS組升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GC治療后，與健康對照組比較，F(xiàn)RNS/SDNS組和NFRNS組Notch1表達(dá)仍高于健康對照組，且FRNS/SDNS組仍高于NFRNS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UCFP、sCD23、CD19+B淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)、IgG、Notch2比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FRNS/SDNS組和NFRNS組UCFP、sCD23、CD19+B淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)、Notch1表達(dá)均較同組治療前降低，IgG較治療前升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Notch2與治療前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1、圖1。

表1 各組研究指標(biāo)比較

圖1 各組GC治療前、后B淋巴細(xì)胞表面Notch1、Notch2的表達(dá)率A.健康對照組；B.FRNS/SDNS組治療前；C.FRNS/SDNS組治療后；D.NFRNS組治療前；E.NFRNS組治療后

2.FRNS/SDNS組GC治療前B淋巴細(xì)胞上Notch1、Notch2表達(dá)率與UCFP、CD19+B淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)、sCD23、IgG的相關(guān)性分析：FRNS/SDNS組GC治療前Notch1表達(dá)率與B淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)(r=0.756，P<0.001)、sCD23(r=0.421，P=0.009)呈正相關(guān)，與IgG(r=-0.537，P=0.001)呈負(fù)相關(guān)，與UCFP無相關(guān)性(r=-0.154，P=0.355)；Notch2與UCFP、B細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)、sCD23、IgG均未顯示相關(guān)性(r=-0.019，-0.147，-0.042，-0.185，P>0.05)，詳見圖2。

討 論

PNS是兒童常見的腎小球疾病之一，近年來B細(xì)胞耗竭劑利妥昔單抗(RTX)治療FRNS/SDNS取得一定療效[3,4，6]。同時(shí)筆者前期研究及相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)FRNS/SDNS患兒存在B淋巴細(xì)胞亞群分布異常，過渡和記憶B細(xì)胞可能存在清除或功能障礙，過渡B細(xì)胞可能是早期篩選FRNS/SDNS的生物學(xué)標(biāo)志物[7,8]。Colucci等[9]通過檢測FRNS/SDNS患兒RTX治療后外周血B淋巴細(xì)胞亞群變化，發(fā)現(xiàn)記憶B細(xì)胞區(qū)室的恢復(fù)可作為預(yù)測復(fù)發(fā)的指標(biāo)。因此B細(xì)胞的數(shù)量、表型和功能異常在PNS特別是FRNS/SDNS的發(fā)生中可能具有重要作用。

Notch1可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的發(fā)育，體外促進(jìn)B淋巴細(xì)胞活化及促進(jìn)抗體分泌[10]。Bertrand等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Notch1在B淋巴細(xì)胞發(fā)育的多個(gè)階段均表達(dá)，且在外周B淋巴細(xì)胞中持續(xù)低表達(dá)，Notch2僅限于前B細(xì)胞區(qū)室內(nèi)表達(dá)。Notch1在淋巴細(xì)胞的發(fā)育和分化過程中起著非常重要的作用，Notch1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以抑制胸腺中B細(xì)胞發(fā)育為代價(jià)，促進(jìn)T細(xì)胞的發(fā)育[12]。Santos等[13]證實(shí)Notch可促進(jìn)B細(xì)胞分化為抗體分泌細(xì)胞。Arima等[14]通過小鼠模型證實(shí)了Notch1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)的B細(xì)胞通過白介素33(IL-33)依賴性方式放大調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和2型輔助型T細(xì)胞(Th2)相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而對T細(xì)胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。CD23是表達(dá)于活化的B淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，易被酶解為可溶性CD23(sCD23)，sCD23具有調(diào)節(jié)IgE的合成、刺激T和B淋巴細(xì)胞增殖等功能[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RNS/SDNS患兒疾病活動(dòng)期CD19+B細(xì)胞計(jì)數(shù)、sCD23表達(dá)升高顯著，經(jīng)GC治療緩解后均降低，提示FRNS/SDNS存在B淋巴細(xì)胞的異?；罨皵U(kuò)增[16，17]。Kim等[18]通過小鼠模型發(fā)現(xiàn)，腎小球中激活的B細(xì)胞可通過分泌IL-4誘導(dǎo)蛋白尿的產(chǎn)生和足突消失；同時(shí)FRNS/SDNS患兒外周循環(huán)中記憶B細(xì)胞升高，其可通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[7～9]。所以FRNS/SDNS患兒外周血中異常激活的B細(xì)胞可能通過抗體非依賴性方式發(fā)揮致病作用。Notch1主要在外周血CD4+T細(xì)胞中表達(dá)，而Notch2在B細(xì)胞邊緣區(qū)表達(dá)高于其他B細(xì)胞群。本研究發(fā)現(xiàn)Notch1在PNS患兒中表達(dá)高于健康對照組，因此筆者認(rèn)為Notch1參與了PNS的發(fā)病，并且FRNS/SDNS組較NFRNS組升高明顯，且FRNS/SDNS組中Notch1與B細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)、sCD23表達(dá)量呈正相關(guān)，Notch2在各時(shí)期未見明顯變化，因此Notch1的表達(dá)變化可能預(yù)測疾病復(fù)發(fā)。Notch1可激活B細(xì)胞受體信號(hào)(BCR)或脂多糖(LPS)，使Notch1在B細(xì)胞中表達(dá)增加，同時(shí)進(jìn)一步促進(jìn)B細(xì)胞活化，所以Notch1可在外周促進(jìn)B細(xì)胞活化和擴(kuò)增[14]。另有研究證實(shí)利用敲除糖尿病腎病模型中Notch1的表達(dá)，可減輕足細(xì)胞損傷，使蛋白尿減少，并延緩腎小球硬化的程度，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Notch1與TGF-β途徑相互作用，參與足細(xì)胞凋亡等過程[19]。因此，筆者猜測FRNS/SDNS存在外周血B淋巴細(xì)胞上Notch1的異常高表達(dá)，促進(jìn)了B細(xì)胞的活化，介導(dǎo)了本疾病的發(fā)生、發(fā)展。

免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是人體產(chǎn)生不同類別的抗體和發(fā)揮不同功能的基礎(chǔ)，本研究發(fā)現(xiàn)FRNS/SDNS患兒存在低IgG血癥，所以FRNS/SDNS患兒可能存在抑制性T細(xì)胞增高，導(dǎo)致使分泌IgM的B細(xì)胞向分泌IgG的B細(xì)胞發(fā)生功能障礙[20]。同時(shí)Notch1激活后可與相應(yīng)受體特異性結(jié)合，使活化的B細(xì)胞發(fā)生抗體轉(zhuǎn)化功能障礙，抑制IgG的生成，導(dǎo)致機(jī)體吞噬、抗體介導(dǎo)的免疫調(diào)理功能等降低，從而加重了患兒的感染復(fù)發(fā)概率。

綜上所述，F(xiàn)RNS/SDNS患兒疾病活動(dòng)期存在B淋巴細(xì)胞的異常擴(kuò)增及活化，Notch1高表達(dá)可能介導(dǎo)該疾病的發(fā)生，Notch1高表達(dá)可作為預(yù)測疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的指標(biāo)，這可能為FRNS/SDNS的治療提供了新的治療靶點(diǎn)。