吳現(xiàn)磊 ，宋錦添 2，侯鵬飛 ，秦二云 ，孟妍 ，張令巧

（1.濮陽市油田總醫(yī)院消化內科，河南濮陽 457001；2.福建醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院/福建省腫瘤醫(yī)院消化道腫瘤內科，福建 福州 350014）

胃癌是最常見的癌癥類型之一，在癌癥相關的死亡人數(shù)中排名第2[1]。早期胃癌可通過手術切除進行治療，但大部分患者確診時已為晚期，靶向藥物治療是常用的治療方法，對癌癥基礎的復雜病理生理學的深入了解和對癌癥相關的分子生物標志物的識別，推動了靶向抗腫瘤藥物的開發(fā)[2]。

腫瘤生長和轉移過程的一個關鍵特征是異常的血管生成，因此，抑制腫瘤血管生成或破壞現(xiàn)有腫瘤血管系統(tǒng)的藥物受到廣泛關注[3]。血管內皮生長因子受體2（VEGFR2）是參與血管生成的兩種酪氨酸激酶受體之一，當被其配體VEGF激活時能促進血管形成、腫瘤增殖和遷移[4]。阿帕替尼是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI），它能高度選擇性地結合并強烈抑制VEGFR-2從而達到抑制血管生成的作用[5]。一項Ⅱ期研究顯示，與安慰劑相比，阿帕替尼改善了化療難治性晚期或轉移性胃癌患者的OS和PFS[6]。隨機、安慰劑對照的Ⅲ期試驗進一步證實阿帕替尼對至少有2種既往全身化療失敗的晚期或轉移性胃癌的患者有療效[7]。但阿帕替尼在胃癌中的下游調控網絡的相關研究還不夠充分，有待進一步研究完善。

SRY相關高遷移率族盒蛋白-5（SOX5）是SOX家族蛋白的一員，并作為轉錄因子參與胚胎的發(fā)育[8-9]。SOX5在各種類型的癌癥中起重要作用。據報道SOX5可能通過與yes相關蛋白1（YAP1）相互作用而成為致癌因子，從而促進了非小細胞肺癌細胞的遷移和增殖[10]。此外，已發(fā)現(xiàn)SOX5可以促進2型糖尿病患者的葡萄糖代謝[11]。而GLUT4是與糖酵解相關的基因[12]。目前，已有研究表明阿帕替尼能通過抑制胃癌細胞的糖酵解調控胃癌的增殖和凋亡。但相關通路研究較少，且沒有關于SOX5/GLUT4信號軸在阿帕替尼抑制胃癌糖酵解中的研究。

本研究探討了阿帕替尼對胃癌細胞的作用，發(fā)現(xiàn)阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸影響葡萄糖代謝抑制胃癌細胞活力。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

細胞代謝分析儀（美國安捷倫科技有限公司，型號Seahorse XFp）；酶標儀（美國BioTek有限公司，型號ELx800）；qRT-PCR熒光定量儀（美國Applied Biosystems公司，型號7900HT）；乳酸比色測定試劑盒、葡萄糖攝取比色測定試劑盒（北京安諾倫有限公司）；CCK-8（日本Dojindo）；BCA定量試劑盒、Lipofectamine 2000（賽默飛世爾科技公司）；阿帕替尼（美國MedChemExpress公司，批號YN968D1）。

1.2 細胞系來源及培養(yǎng)

本研究中使用的細胞系為胃癌細胞系BGC-823（BNCC337689），購自北納生物（中國北京）。BGC-823在含谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。置于37℃，5%（φ）CO2培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。阿帕替尼購自MCE（MedChemExpress）。稱取50 mg阿帕替尼溶于1 mL DMSO后放入?20℃冰箱保存，使用時用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3 細胞轉染及實驗分組

重組質粒pENTER-SOX5（oe-NC）和SOX5的過表達質粒（oe-SOX5）、GLUT4的過表達質粒（oe-GLUT4）均購自Vigene Biosciences（中國濟南）。根據生產商的說明通過Lipofectamine 2000（Invitro‐gen，Carlsbad，CA，USA）轉染細胞。并根據本課題實驗要求，分為：control組、不同濃度（0μmoL/L、10μmoL/L、20μmoL/L、30μmoL/L、40μmoL/L、50μmoL/L）阿帕替尼處理組（oe-NC+apatinib）、過表達SOX5并阿帕替尼處理組（oe-SOX5+apa‐tinib）、過表達GLUT4并阿帕替尼處理組（oe-GLUT4+apatinib）。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

使用Trizol（Invitrogen）按照制造商的方案從胃癌細胞中提取總RNA。使用反轉錄系統(tǒng)試劑盒（Invitrogen）合成cDNA。qRT-PCR在ABI 7900HT儀器上進行。使用miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，Germany）進行定量PCR。以GAPDH為內參分別歸一化處理。所用引物見表1。結果用2?ΔΔCt值來比較對照組和實驗組的目的基因相對表達量的差異。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 Western blot實驗

將各組細胞使用冷PBS洗滌3次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min，BCA定量試劑盒進行蛋白定量，然后加入10μL上樣緩沖液95℃煮10 min后，于100 V進行SDS-PAGE。電泳結束后，將蛋白轉移至NC膜，封閉液（5%BSA/TBST）封閉60 min。加入一抗兔抗GLUT4（abcam，USA）、SOX5（abcam，USA）、β-actin（abcam，USA），4℃過夜孵育。一抗孵育完畢后，用1×TBST溶液（Solarbio，Beijing，China）室溫下?lián)u床搖動洗膜，5 min×3次，加辣根過氧化酶標記的二抗山羊抗兔IgG（abcam，USA），室溫下雜交120 min，TBST洗膜3次，每次20 min后用ECL試劑盒（Solarbio，Beijing，China）進行發(fā)光反應，拍照觀察蛋白印記。

1.6 細胞增殖能力測定

CCK8法測試細胞增殖能力。將5×103個胃癌細胞接種到具有100μL培養(yǎng)基的96孔板中的每孔中。設置空白孔（有培養(yǎng)基，無細胞）和對照孔（培養(yǎng)基不加藥，有細胞）。第2天，用不同濃度的阿帕替尼處理細胞。使用CCK-8溶液繼續(xù)孵育1 h。監(jiān)測48 h后的細胞存活率，并通過2次吸收后的吸光度測量評估存活細胞的數(shù)量。使用酶標儀測定450 nm各孔的吸光值。將各測試孔的吸光度A減去調零孔吸光度A或對照孔吸光度A。各重復孔的吸光度A取平均數(shù)。細胞生存率=（加藥細胞吸光度A?空白吸光度A）/（對照細胞吸光度A?空白吸光度A）×100%。

1.7 糖酵解過程分析（葡萄糖攝取、乳酸生成、細胞外酸化速率）

將細胞預處理24 h，接種在96孔板中并保持過夜。去除培養(yǎng)基，將細胞用PBS洗滌3次，然后根據制造商的規(guī)程，使用葡萄糖攝取比色測定試劑盒測定葡萄糖攝取。為了測量乳酸，將細胞在不含酚紅的DMEM中（Hyclone，USA）培養(yǎng)15 h，然后收集培養(yǎng)基。使用乳酸比色測定試劑盒對乳酸水平進行定量，并使用BCA蛋白測定試劑盒針對相應的總蛋白質水平對濃度進行標準化。為了測量細胞外酸化速率，將糖酵解壓力試劑盒中的藥物誘導劑分別加入加藥板上的各加藥孔中，其中葡萄糖、寡霉素及2-脫氧葡萄糖的使用濃度分別為10 mmol/L、1μmol/L及50 mmol/L。隨后采用細胞代謝分析儀檢測各組細胞的細胞外酸化速率，并計算糖酵解能力值及糖酵解保留值。

1.8 GLUT4啟動子活性檢測

將長度約500 bp的GLUT4基因啟動子區(qū)作為pGL3-GLUT4-Promoter插入到pGL3堿性熒光素酶報告載體中。根據制造商的說明，使用QuikChange定點誘變試劑盒（Stratagene）對GLUT4啟動子進行定點誘變，通過DNA測序確認突變。將100 ng構建的質粒和7 ng Renilla熒光素酶對照質粒轉染到6孔板中SOX5過表達或沉默的細胞中。48 h后，使用雙熒光素酶測定試劑盒（Promega，USA）測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性。利用海腎熒光素將報告熒光素酶活性結果進行標準化。

1.9 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據均采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件處理，計量資料用x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 阿帕替尼對胃癌細胞的增殖和糖酵解的影響

檢測結果顯示，阿帕替尼可濃度依賴性地抑制BGC-823細胞的體外增殖（圖1A）。20μmol/L阿帕替尼處理后可顯著降低BGC-823細胞內葡萄糖攝取量（圖1B）和乳酸生成量（圖1C）。為進一步證實阿帕替尼對胃癌細胞有氧糖酵解活性的抑制作用，細胞代謝分析儀檢測結果顯示：與對照組相比，用阿帕替尼處理后，癌細胞外酸化速率降低。表明阿帕替尼可抑制由寡霉素（oligomycin）激活的BGC-823細胞的有氧糖酵解活性（圖1D）。進一步對各糖酵解參數(shù)進行計算，發(fā)現(xiàn)相較于對照組，阿帕替尼處理組的BGC-823細胞糖酵解能力值及糖酵解儲備值均明顯下降（圖1E）。這些結果表明阿帕替尼能抑制胃癌細胞的增殖和糖酵解。

圖1 阿帕替尼對胃癌細胞的增殖和糖酵解的影響Figure 1 Effect of apatinib on the proliferation and glycolysis of gastric cancer cells

2.2 阿帕替尼通過SOX5對胃癌細胞中的GLUT4啟動子活性的影響

結果顯示SOX5和GLUT4的表達量均隨著阿帕替尼濃度的升高而下降（圖2A～圖2B）。20μmol/L阿帕替尼處理后，SOX5和GLUT4的蛋白表達量顯著下調；阿帕替尼處理的同時過表達SOX5，SOX5和GLUT4的蛋白表達量相比于僅用阿帕替尼處理顯著上調（圖2C）。雙熒光素酶實驗檢測各處理組GLUT4啟動子活性，發(fā)現(xiàn)用阿帕替尼處理后GLUT4啟動子活性顯著下調；用阿帕替尼處理細胞并過表達SOX5后，GLUT4啟動子活性明顯高于僅用阿帕替尼處理（圖2D）。這些結果表明阿帕替尼能通過SOX5調節(jié)胃癌細胞中的GLUT4啟動子活性。

圖2 阿帕替尼通過SOX5對胃癌細胞中的GLUT4啟動子活性的影響Figure 2 Effect of apatinib on the activity of GLUT4 promoter in gastric cancer cells through SOX5

2.3 阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸對胃癌細胞的細胞活力和糖酵解的影響

qRT-PCR檢測各處理組SOX5和GLUT4的mRNA表達水平，結果顯示阿帕替尼處理后SOX5和GLUT4的mRNA表達水平均顯著下調；用阿帕替尼處理并同時過表達SOX5后,SOX5和GLUT4的mRNA表達水平相較于僅用阿帕替尼處理均發(fā)生顯著上調；用阿帕替尼處理并同時過表達GLUT4后SOX5 mRNA表達水平相較于僅用阿帕替尼處理沒有顯著變化，GLUT4 mRNA表達水平則發(fā)生顯著上調（圖3A）。CCK8檢測各處理組細胞存活率，結果顯示阿帕替尼處理后細胞生存率顯著下調；用阿帕替尼處理并同時過表達SOX5或GLUT4后，細胞生存率相較于僅用阿帕替尼處理均發(fā)生顯著上調（圖3B）。比色法結果顯示，阿帕替尼處理后葡萄糖攝取和乳酸生成速率均顯著下調；用阿帕替尼處理并同時過表達SOX5或GLUT4后則發(fā)生顯著上調（圖3C～圖3D）。細胞代謝分析儀檢測結果顯示過表達SOX5或GLUT4能逆轉阿帕替尼對細胞外酸化速率的抑制作用（圖3E）。進一步對各糖酵解參數(shù)進行計算，結果表明，過表達SOX5或GLUT4能逆轉阿帕替尼對細胞糖酵解能力值及糖酵解儲備值的抑制作用（圖3F）。阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸抑制胃癌細胞的細胞活力和糖酵解。

圖3 阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸對胃癌細胞的細胞活力和糖酵解的影響Figure 3 Effect of apatinib on the cell viability and glycolysis of gastric cancer cells through the SOX5/GLUT4 axis

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，估計每年全球有超過100萬的新病例，同時由于胃癌的診斷往往處于晚期，其死亡率很高[1]。糖酵解是癌癥的一個新特征，糖酵解產生能量和營養(yǎng)，并產生乳酸，為癌細胞生長提供了適當?shù)奈h(huán)境[13]。因此，靶向糖酵解是一種新的治療策略。本研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼通過SOX5/GLUT4信號軸調控胃癌細胞糖酵解并有效抑制細胞活力。

阿帕替尼在晚期胃癌中被證實是一種安全有效的小分子抗血管生成靶向藥物，也是晚期胃癌標準化療失敗后，明顯延長生存期的單藥[14]。已有大量報道闡釋關于阿帕替尼對多種癌細胞生物學功能的調節(jié)作用。例如Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼通過調節(jié)凋亡和自噬來調控胃癌細胞的生長；阿帕替尼通過下調缺氧誘導因子-1α和增加活性氧自由基水平促進胰腺癌細胞凋亡[16]；阿帕替尼通過AKTmTOR途徑誘導間變性甲狀腺癌保護性自噬和凋亡[17]。因此，推測阿帕替尼可能通過抑制特定的細胞功能，包括糖酵解來抑制胃癌細胞的活力。本研究使用不同濃度的阿帕替尼對胃癌細胞進行處理，發(fā)現(xiàn)阿帕替尼處理后癌細胞的糖酵解能力和細胞活力下降。

SOX5是SOX家族轉錄因子中的一員，在多種癌癥類型的進展中起著關鍵作用。據報道，SOX5通過激活twist介導的胃癌上皮-間充質轉化促進細胞侵襲和轉移[18]；SOX5通過轉激活EZH2促進乳腺癌的增殖和侵襲[19]；SOX5通過STAT3信號通路誘導VEGF表達，誘導肺腺癌血管生成[20]。這表明SOX5在胃癌可能作為一種癌基因發(fā)揮作用。此外有文獻報道在卵巢癌細胞中，阿帕替尼能夠抑制SOX5，進而抑制GLUT4的轉錄活性[21]。并且GLUT4已被證明與糖酵解有關[22]。本實驗數(shù)據與文獻報道趨勢一致，表明在胃癌細胞中阿帕替尼能夠降低SOX5的表達，從而抑制GLUT4的啟動子活性，來發(fā)揮其抑制糖酵解作用。

本研究結果表明，阿帕替尼可能通過抑制SOX5/GLUT4信號軸，抑制胃癌細胞糖酵解和細胞活力，為阿帕替尼調控糖酵解的機制提供了新的見解。