黃曉燕，甘燕玲，曹玲，陳麗丹，王露霞

（中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510010）

隨著碳青霉烯酶類抗生素使用的增多，導(dǎo)致耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）出現(xiàn)并呈明顯上升趨勢，成為臨床治療感染的新挑戰(zhàn)。目前對CRKP感染治療有效的藥物種類有限，臨床常采用聯(lián)合用藥治療的方案，因此，臨床治療策略的可行性分析，尤其是治療藥物的最佳搭配方案值得探索。本文選取臨床常用抗生素對CRKP進(jìn)行體外抗菌活性研究，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 菌株

收集廣州地區(qū)某三甲醫(yī)院2018年10月?2019年9月臨床分離的616株非重復(fù)肺炎克雷伯菌，篩選出CRKP37株。其中來源于痰液（包含肺泡灌洗液）25（68%）株、血液5（13%）株、中段尿3（8%）株、引流液2（5%）株、腦脊液1（3%）株、膿液化1（3%）株；標(biāo)本主要分布在ICU 13（35%）株、老年ICU 10（27%）株、呼吸內(nèi)科6（16%）株、神經(jīng)外科4（11%）株、泌尿外科3（8%）株以及血液科1（3%）株。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC8739，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與試劑

運(yùn)用VITEK MSIVD3.0質(zhì)譜儀及其配套靶板、基質(zhì)液（法國生物梅里埃）；Vitek2 Compect鑒定藥敏分析系統(tǒng)及其配套藥敏卡（法國生物梅埃）；BIORAD基因擴(kuò)增儀（美國伯樂）；DYY-6C型瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Gel DOCTMXR+凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂）；DNA定量marker（北京天根生化科技有限公司）；核酸染料（北京天根生化科技有限公司）；瓊脂糖（西班牙Biow‐est）；96孔平底培養(yǎng)板（無錫耐思生物科技有限公司）；Muller-Hinton（MH）瓊脂培養(yǎng)基（廣州迪景生物技術(shù)有限公司）；Muller-Hinton（MH）肉湯（美國Difco公司）；CAMHB肉湯干粉；多黏菌素B、亞胺培南、米諾環(huán)素、磷霉素、多西環(huán)素藥敏紙片（英國OXOID）；替加環(huán)素（上海阿拉丁生化科技有限公司）。

2 方法

2.1 可疑產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的篩選

運(yùn)用VITEK MSIVD3.0質(zhì)譜儀鑒定到種，使用Vitek2 Compect鑒定藥敏分析系統(tǒng)挑選對美羅培南或亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌株，采用手工K-B法復(fù)檢，儀器法及手工法均耐藥者采用改良Hodge試驗進(jìn)行耐藥表型確認(rèn)。

2.2 改良Hodge試驗

用無菌生理鹽水制備0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌ATCC25922懸液，10倍稀釋后均勻涂布于MH平板，在平板中心貼厄他培南紙片。挑取3～5個血平板上過夜培養(yǎng)的新鮮待測菌和質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705菌落，垂直于紙片邊緣向外劃一條20～25 mm的直線，孵育后觀察結(jié)果，待測菌株與抑菌環(huán)交叉處出現(xiàn)矢狀生長的為產(chǎn)碳青霉烯酶陽性株［1］。

2.3 CRKP基因組DNA模板的提取

采用熱激法制備CRKP的DNA模板[2]：用無菌棉簽將分離純化的細(xì)菌洗脫到200μL無菌蒸餾水中，并置于?20℃冰箱中1 min。取出后，將其放入預(yù)先準(zhǔn)備的100℃金屬水浴鍋中,靜置10 min，然后置于?20℃中保持1 min，然后離心（10 000 r/min）10 min使被裂解的細(xì)菌沉淀下來，將上清吸取到新的EP管中，該上清液即為提取的DNA模板溶液，將樣品儲存在?20℃冰箱中以備后用。

2.4 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的擴(kuò)增

使用PCR技術(shù)同時擴(kuò)增肺炎克雷伯菌的5種碳青霉烯酶基因KPC、IMP、VIM、NDM-1、OXA-48并鑒定。PCR擴(kuò)增體系（20μL）：DNA模板1μL，上下游引物各1μL，5×PCR mix 10μL，去離子水7μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性30 s，KPC、IMP、OXA、VIM、NDM5個基因在各自相對應(yīng)的退火溫度退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)之后72℃徹底延伸5 min。所用引物見表1。

表1 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因引物序列和預(yù)計片段大小Table 1 Primer sequence and predicted fragment size of carbapenemase gene of Klebsiella pneumoniae

2.5 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因擴(kuò)增片段電泳鑒定

用980 mL的去離子水與20 mL的50×TAE原液混合，稀釋至1×TAE緩沖液，以配置2%瓊脂糖凝膠和電泳液。反應(yīng)結(jié)束后，按順序在泳道內(nèi)分別加入10μL PCR產(chǎn)物，電壓設(shè)置為100 V，由負(fù)極向正極電泳30 min。電泳結(jié)束后，把凝膠放置在紫外光下，用Gel DOCTMXR+凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照保存。

2.6 單獨藥敏試驗

采用微量肉湯稀釋法分別測定6種不同梯度濃度藥物對CRKP的體外最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)，記錄結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSIM07-A10版，檢測時在肉湯培養(yǎng)基中加入25 mg/L的6-磷酸葡萄糖。

2.7 聯(lián)合藥敏實驗

采用微量棋盤法，用96孔板進(jìn)行實驗，把多黏菌素B、亞胺培南、米諾環(huán)素、替加環(huán)素、磷霉素、多西環(huán)素（分別以A、B、C、D、E表示）組合成15個不同藥物組：A+B、A+C、A+D、A+E、A+F、B+C、B+D、B+E、B+F、C+D、C+E、C+F、D+E、D+F、E+F，檢測各藥物組MIC聯(lián)合；同時設(shè)定生長對照（只加200μL菌懸液，無藥物）和無菌對照（只加200μL肉湯，無細(xì)菌）。每個組合各取相應(yīng)藥物50μL，按不同梯度濃度加入96孔板，充分混勻，把濃度為1×106CFU/mL的肺炎克雷伯菌懸液100μL加入所有孔中，使菌液終濃度大約為5×105CFU/mL，充分混勻，置35℃培養(yǎng)箱20 h，記錄MIC聯(lián)合，計算部分抑菌指數(shù)（fractitional inhibitory concentration index,FICI）作為聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果的判斷依據(jù)[3]：FICI=MICA聯(lián)合/MICA單用+MIC聯(lián)合/MICB單用，F(xiàn)ICI≤0.5，協(xié)同作用；0.52.0，拮抗作用。

3 結(jié)果

3.1 藥物敏感試驗結(jié)果

結(jié)果見圖1。37株CRKP菌均為多重耐藥菌，對碳青霉烯類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類藥物具有極高的耐藥率，均≥80%；對四環(huán)素類的多西環(huán)素、米諾環(huán)素以及氨基糖苷類的阿米卡星、氟喹諾酮類的左氧氟沙星的耐藥率是72.2%～79.4%；對添加酶抑制劑的抗生素呈現(xiàn)中敏或高耐，為53.8%～97.9%；對復(fù)方新諾明表現(xiàn)為中敏（敏感率57.7%)；對多黏菌素B及替加環(huán)素則呈高度敏感（敏感率92.8%、87.8%）。

圖1 CRKP藥敏結(jié)果Figure 1 Drug sensitivity of CRKPstrains(%)

3.2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測結(jié)果

PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明37株菌都是CRKP。見圖2。

圖2 部分瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 2 Agarose gel electrophoresis results

3.3 抗菌藥物單獨及聯(lián)用對CRKP的體外抗菌作用

3.3.1 實驗數(shù)據(jù) 15種藥物組合的MIC聯(lián)合均比MIC單獨值低，見表2。

表2 不同藥物單用及聯(lián)用對CRKP的MIC值Table 2 MICvalues of CRKPin single and combined use of drugs ρ/（μg·mL?1)

3.3.2 計算FICI、數(shù)據(jù)分析 見表3。結(jié)果6種藥物相互聯(lián)合，有協(xié)同作用株藥物組合的有A+D:13.51%（5/37株），A+E:40.54%（15/37株），B+C:13.51%（5/37株），B+E:75.68%（28/37株），B+F:5.41%（2/37株），C+E:8.11%（3/37株），D+E:16.22%（6/37株），E+F:5.41%（2/37株）；有拮抗作用為A+B:24.32%（9/37株），A+F:27.03%（10/37株），B+C:8.11%（3/37株），B+D:70.27%（26/37株），B+E:8.11%（3/37株），B+F:54.05%（20/37株），C+D:5.41%（2/37株），C+E:13.51%（5/37株），D+E:2.7%（1/37株），E+F:2.7%（1/37株）；其余表現(xiàn)為相加或無關(guān)。

表3 CRKP體外聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果Table 3 Results of combined drugs sensitivity test of CRKP in vitro（n=37)

4 討論

CRKP感染的危險因素包括入住ICU（病情重、住院時間長、免疫力低下、多行開創(chuàng)性治療）、侵入性操作(有創(chuàng)呼吸機(jī)、深靜脈置管、尿道插管)、年齡（老年人、新生兒）、合并感染及碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用等。目前，對CRKP敏感的藥物僅有氨基糖苷類(尤其是慶大霉素)、氨曲南、多黏菌素B、磷霉素及替加環(huán)素，但臨床治療沒有明確的方案[4-5]，碳青霉烯類藥物仍是治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的首選抗生素[6]，進(jìn)一步導(dǎo)致了碳青霉烯類耐藥菌株的出現(xiàn)[7]。據(jù)統(tǒng)計，替加環(huán)素、多黏菌素對碳青霉烯耐藥菌株具有抗菌活性[8]，但單一用藥可使病原菌耐藥性逐漸增加[9]。有文獻(xiàn)報道，磷霉素聯(lián)合多黏菌素B聯(lián)合使用，可殺滅65%以上的CRKP，磷霉素不推薦單獨使用[10]。也有研究表明，無論是在院病死率、細(xì)菌清除失敗率和14 d累積生存率，聯(lián)合用藥效果均優(yōu)于單藥（P<0.05）[11]。但目前臨床不同藥物組合的抗菌療效少有報道，并不確切。因此，本研究通過實驗評價臨床上6種常見抗菌藥物在單用或聯(lián)用對CRKP的體外抗菌活性，為臨床用藥提供參考或依據(jù)。結(jié)果顯示：最優(yōu)給藥方案是多黏菌素B及亞胺培南分別與磷霉素聯(lián)合，具有顯著的協(xié)同作用（分別占40.54%和75.68%），這與回顧性研究報道一致[12]。但同時也檢測出亞胺培南分別與替加環(huán)素及多西環(huán)素聯(lián)合具有明顯的拮抗作用（分別占70.27%和54.05%），提示臨床用藥應(yīng)避免使用此兩種組合給藥方案。另外，本實驗中亞胺培南聯(lián)合替加環(huán)素應(yīng)用無協(xié)同作用，與Munoz-Price等[13]報道的應(yīng)用此組合成功治療CRKP感染病例結(jié)果不符，可能是替加環(huán)素起到主要抗菌活性作用，碳青霉烯類藥物的協(xié)同作用仍不清楚。國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未有關(guān)于上述3種抗菌藥物組合對CRKP的體外抗菌作用的報道，可能是考慮到3種藥物聯(lián)用可能產(chǎn)生的肝、腎毒性過大。目前，市面上熱門的新型酶抑制劑復(fù)合頭孢他啶/阿維巴坦(CAZ/AVI)，是廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑阿維巴坦和第三代頭孢菌素相結(jié)合的抗生素，可抑制ESBLs及AmpC酶、KPC酶和部分D類β-內(nèi)酰胺酶，抑菌活性雖然弱于替加環(huán)素和多黏菌素B，但明顯優(yōu)于美羅培南、亞胺培南、厄他培南、多利培南[14]，具有較好的應(yīng)用前景。