賈彩霞 陳建新 龐小涵 高闊 李京忠 張飛龍 王金平 王偉 徐曉新 趙慧輝

摘要 目的：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，預(yù)測大黃素治療腦缺血中風(fēng)的作用機(jī)制。方法：使用SymMap、TCMSP、OMIM、Drugbank數(shù)據(jù)庫獲得大黃素治療腦缺血中風(fēng)靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行格式統(tǒng)一及非人源靶點的去除。然后利用AlzData數(shù)據(jù)庫進(jìn)行大黃素治療腦缺血中風(fēng)的靶點在大腦細(xì)胞中的分布表達(dá)情況分析，使用DAVID數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行KEGG通路分析和GO分析，得到相關(guān)通路。結(jié)果：大黃素治療腦缺血中風(fēng)的潛在作用靶點共10個，分別為CASP3、KDR、PTGS1、TNF、MMP9、PRKCE、PTGS2、MYC、TP53，各自在大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等中有不同程度的表達(dá)，涉及KEGG相關(guān)富集通路12條、GO生物過程富集條目14條、GO細(xì)胞組分富集條目3條、GO細(xì)胞功能富集條目2條。分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)與CASP3、KDR、PTGS1、TNF、MMP9結(jié)合較好。結(jié)論：大黃素可能主要通過CASP3、KDR、PTGS1、TNF、MMP9作用于細(xì)胞凋亡通路及炎癥反應(yīng)相關(guān)等通路來發(fā)揮治療腦缺血中風(fēng)的作用。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;腦缺血中風(fēng);大黃素;靶點;通路;機(jī)制

Mechanism Research of Emodin in the Treatment of Ischemic Stroke Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

JIA Caixia1，CHEN Jianxin1，PANG Xiaohan1，GAO Kuo2，LI Jingzhong1，ZHANG Feilong1，WANG Jinping3，WANG Wei1，XU Xiaoxin1，ZHAO Huihui1

（1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 3 China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To research the mechanism of emodin in the treatment of ischemic stroke based on network pharmacology and molecular docking.Methods：Emodin targets for ischemic stroke were obtained by using SymMap，TCMSP，OMIM and Drugbank databases，and the format was unified and non-human targets were removed by Uniprot database.Then AlzData database was used to analyze the distribution and expression of emodin targets in brain cells for cerebral ischemia stroke.KEGG pathway and GO enrichment analysis was performed on the target of emodin for ischemic stroke using DAVID database to obtain the relevant pathway.Results：There were 10 potential targets for emodin in the treatment of ischemic stroke，which were CASP3，KDR，PTGS1，TNF，MMP9，PRKCE，PTGS2，MYC，TP53.They were expressed in astrocytes，microglia and endothelial cells in a different degrees.There were 12 KEGG related enrichment pathways，14 GO biological process enrichment items，3 GO cell component enrichment items，and 2 GO cell functional enrichment items related to ischemic stroke，and it had a good combination with CASP3，KDR，PTGS1，TNF and MMP9.Conclusion：Emodin may play a role in the treatment of ischemic stroke mainly through CASP3，KDR，PTGS1，TNF，MMP9 acting on apoptosis pathways and inflammation-related pathways.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Ischemic stroke; Emodin; Target; Pathway; Mechanism

中圖分類號：R285文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.06.005

中風(fēng)是世界范圍內(nèi)造成殘疾甚至死亡很大比例的一種腦血管疾病[1]，分為缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)，其中85%的中風(fēng)是缺血性的[2]。缺血性腦中風(fēng)是常見的腦血管病，是由腦血管狹窄或閉塞引起的，具有高并發(fā)率和高死亡率的特點[3]。在中醫(yī)學(xué)中被認(rèn)為是“中風(fēng)”，李東垣曰：“中風(fēng)為百病之長，乃氣血閉而不行”[4]。因此，活血調(diào)氣成為治療中風(fēng)的重要治則。《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載大黃，性味苦寒，具有瀉下通便、活血化瘀等功能，目前研究表明其含有的有效化合物有蒽醌類（如游離型蒽醌大黃素，結(jié)合型蒽醌大黃素甲醚葡萄糖苷）、多糖、鞣質(zhì)等[5]。大黃素作為發(fā)揮藥理學(xué)作用的一個重要成分，在缺血性腦卒的治療中起到了至關(guān)重要的作用，有相關(guān)報道稱其可以抗氧化、抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6]，能夠改善缺血性中風(fēng)大鼠的神經(jīng)功能[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合了多種學(xué)科的理論基礎(chǔ)，能夠?qū)⑺幬?、藥物的化學(xué)成分、靶點等之間的聯(lián)系展示出來，SymMap數(shù)據(jù)庫包含了中藥、成分、靶點、疾病、中醫(yī)癥狀、西醫(yī)癥狀6個部分，可通過其來搜索大黃素的靶點。反向分子對接技術(shù)可以將小分子藥物與大分子靶標(biāo)的潛在結(jié)合口袋進(jìn)行對接，根據(jù)結(jié)合的緊密程度篩選小分子藥物的靶點，我們從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度對大黃素治療缺血性中風(fēng)的作用機(jī)制進(jìn)行研究，并利用反向分子對接技術(shù)對其作用靶點進(jìn)行模擬篩選，旨在為進(jìn)一步闡述大黃素在缺血性中風(fēng)方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大黃素結(jié)構(gòu)及其對應(yīng)靶點的獲得 在Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中以大黃素的CAS號（518-82-1）為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，查找大黃素的SDF結(jié)構(gòu)，并下載保存。利用SymMap數(shù)據(jù)庫（https：//www.symmap.org/）和TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）搜索大黃素的靶點，并去除重復(fù)的靶點，最終得到大黃素的潛在作用靶點。

1.2 腦缺血中風(fēng)靶點的獲得 使用Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）、Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）進(jìn)行腦缺血中風(fēng)靶點的搜索，將搜索得到的靶點在uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//ebi12.uniprot.org/）中進(jìn)行名稱和編號的格式統(tǒng)一，刪除重復(fù)，然后排除非人源靶點，獲得疾病靶點，以便進(jìn)行下一步的分析。將大黃素潛在作用靶點與腦缺血性中風(fēng)靶點進(jìn)行映射，最終獲得大黃素治療腦缺血性中風(fēng)的靶點。

1.3 大黃素治療腦缺血性中風(fēng)的靶點在大腦細(xì)胞中的分布表達(dá)情況 利用AlzData數(shù)據(jù)庫[8-9]（http：//www.alzdata.org/index.html）將上述得到的大黃素治療腦缺血性中風(fēng)的相關(guān)靶點進(jìn)行其在大腦不同類型細(xì)胞中（主要觀察的細(xì)胞為：內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocytes）、小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia）、少突細(xì)胞（Oligodendrocytes）、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（OPC）、神經(jīng)元（Neurous）的分布表達(dá)情況分析。具體方法為：打開AlzData數(shù)據(jù)庫之后選擇Single Cell Expression，點擊進(jìn)入查詢界面，然后將上述得到的大黃素治療腦缺血性中風(fēng)的相關(guān)靶點輸入，點擊Submit，隨后對其結(jié)果進(jìn)行基因單細(xì)胞表達(dá)情況分析。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）是一個在線搜索的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫，能夠?qū)蝹€蛋白質(zhì)進(jìn)行檢索，得到此蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的所有蛋白構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)，也可以對輸入的多個蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行挖掘。通過Sting數(shù)據(jù)庫分析大黃素治療腦缺血中風(fēng)的潛在作用靶點蛋白之間的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，并使用Cytoscape_v3.2.1軟件進(jìn)行結(jié)果的可視化，用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征的分析。

1.5 KEGG通路分析和GO分析 DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）是一個生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫[10]，其包含生物學(xué)數(shù)據(jù)及相應(yīng)分析工具，其中在Functional Annotation工具下包含3個子工具：第1個子工具為Functional Annotation Clustering，這部分主要是對注釋上的條目做聚類，分?jǐn)?shù)越高，表示該組內(nèi)的基因在列表中越重要;第2個子工具為Functional Annotation Chart，這部分主要提供GO注釋、KEGG注釋、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等;第3個子工具為Functional Annotation Table，主要是對基因的功能注釋，以表格的形成展示。因此我們使用DAVID數(shù)據(jù)庫Functional Annotation工具對大黃素治療腦缺血性中風(fēng)的靶點進(jìn)行KEGG通路分析和GO分析，并利用Cytoscape_v3.2.1軟件構(gòu)建通路與之相關(guān)的靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對接 根據(jù)大黃素治療腦缺血性中風(fēng)的蛋白名稱在PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）中進(jìn)行下載蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，然后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫中記載的Structure相應(yīng)鏈信息，保留相應(yīng)的鏈，進(jìn)行去水、去除多余鏈、加氫等操作之后生成活性口袋，做好蛋白預(yù)處理，并將下載好的大黃素結(jié)構(gòu)利用Sybyl軟件進(jìn)行能量最小化處理，具體操作為點擊Applications，選擇Ligand Preparation選項，點擊set up之后選擇Generate One preferred 3D Structure選項[11]。隨后采用Sybyl2.0的Surflex-Dock功能將準(zhǔn)備好的蛋白與小分子進(jìn)行分子對接，并將完成后的結(jié)果導(dǎo)入到Excel表格中，通過對接會得到幾種得分：Total Score、Crash、Polar、D_SCORE、PMF_SCORE、G_SCORE、CHEMSCORE、CSCORE、GLOBAL_CSCORE，本次實驗采用的是CSCORE得分來評價大黃素與活性靶點的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 大黃素結(jié)構(gòu)的獲得 應(yīng)用Pubchem數(shù)據(jù)庫得到的大黃素SDF結(jié)構(gòu)。見圖1。利用SymMap數(shù)據(jù)庫和TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索得到大黃素的潛在作用靶點，共得到34個。見圖2A。

2.2 腦缺血性中風(fēng)靶點的獲得 經(jīng)過OMIM和Drugbank數(shù)據(jù)庫的檢索及格式統(tǒng)一，去除重復(fù)，去除非人源靶點之后，共得到腦缺血性中風(fēng)靶點共176個，其中來源于OMIM數(shù)據(jù)庫中的有121個，來源于Drugbank數(shù)據(jù)庫中的有55個。將大黃素潛在作用靶點與腦缺血性中風(fēng)靶點進(jìn)行映射，最終獲得大黃素治療腦腦缺血中風(fēng)靶點10個（ACTA2、CASP3、KDR、MMP9、MYC、PRKCE、PTGS1、PTGS2、TNF、TP53），隨后將大黃素的靶點與腦缺血中風(fēng)的相關(guān)靶點運(yùn)用在線工具Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進(jìn)行韋恩圖的繪制。見圖2B。

2.3 大黃素治療腦缺血性中風(fēng)的靶點在大腦細(xì)胞中的分布表達(dá)情況 利用AlzData數(shù)據(jù)庫將大黃素治療腦缺血性中風(fēng)的靶點進(jìn)行其在大腦不同類型細(xì)胞中的分布表達(dá)情況分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ACTA2在這些細(xì)胞中表達(dá)程度不是很高，幾乎不表達(dá)，CASP3主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocytes）、少突細(xì)胞（Oligodendrocytes）、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（OPC）、神經(jīng)元（Neurous）中表達(dá)，KDR主要在內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial）中表達(dá)，MMP9在這些細(xì)胞中表達(dá)程度不是很高，幾乎不表達(dá)，MYC主要在內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial）、小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia）中表達(dá)，PRKCE主要在神經(jīng)元（Neurous）中表達(dá)，PTGS1主要在小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia）中表達(dá)，PTGS2主要在小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia）中表達(dá)，TNF在這些細(xì)胞中表達(dá)程度不是很高，幾乎不表達(dá)，TP53主要在內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocytes）、小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia）、少突細(xì)胞（Oligodendrocytes）中表達(dá)。見圖3A、3B、3C、3D。

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述得到的大黃素治療腦腦缺血中風(fēng)的潛在作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。見圖4。然后將相互作用結(jié)果通過Cytoscape軟件進(jìn)行結(jié)果的可視化，用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征的分析，Degree值按照從大到小的順序依次為TNF（Degree=8）、CASP3（Degree=7）、TP53（Degree=7）、PTGS2（Degree=7）、KDR（Degree=6）、MMP9（Degree=6）、MYC（Degree=6）、ACTA2（Degree=3）、PTGS1（Degree=2）。

2.5 KEGG通路分析和GO分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫對大黃素治療腦缺血中風(fēng)的靶點進(jìn)行KEGG通路分析和GO分析，最終得到29條KEGG通路，其中P<0.01的通路有12條，涉及癌癥中的蛋白聚糖通路（Proteoglycans in Cancer）、癌癥中的microRNAs通路（microRNAs in Cancer）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、細(xì)胞凋亡（Apoptosis）、MAPK信號通路（MAPK Signaling Pathway）等。見表1。47條GO生物過程（Biological Progress，BP），其中P<0.01的生物過程有14條，涉及凋亡過程的負(fù)調(diào)控（Negative Regulation of Apoptotic Process）、基因表達(dá)的正調(diào)控（Positive Regulation of Gene Expression）、血壓的調(diào)節(jié)（Regulation of Blood Pressure）、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)（Response to Glucocorticoid）、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)（Cellular Response to Hypoxia）、蛋白磷酸化的正調(diào)控（Positive Regulation of Protein Phosphorylation）等，8條富集的細(xì)胞組分（Cellular Component，CC），其中P<0.01的細(xì)胞組分有3條，分別為蛋白質(zhì)復(fù)合體、膜筏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，9條富集的細(xì)胞功能（Molecular、Function，MF），其中P<0.01的細(xì)胞功能有2條，分別為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶活性（Prostaglandin-endoperoxide Synthase Activity）和蛋白酶結(jié)合（Protease Binding）。見表2。利用Cytoscape_v3.2.1軟件構(gòu)建通路與之相關(guān)的靶點網(wǎng)絡(luò)。見圖5。其中MYC（Degree=16），PTGS2（Degree=15），TP53（Degree=14），CASP3（Degree=13），TNF（Degree=12）的Degree值較大，表明大黃素可能主要通過這些蛋白作用于各種通路。

2.6 分子對接 分子對接作為一種應(yīng)用廣泛的虛擬篩選方法，其可以預(yù)測小分子配體與合適的靶點結(jié)合位點的結(jié)合構(gòu)象。反向分子對接是一種新的方法，可以通過對接實現(xiàn)與虛擬篩選相反的功能，是根據(jù)單配體多靶點的概念篩選蛋白與小分子化合物的方法[12]。Sybyl軟件涵蓋藥物設(shè)計的各個方面，應(yīng)用分子對接軟件Sybyl可以評估大黃素與靶點之間的結(jié)合活性強(qiáng)弱。經(jīng)過蛋白晶體結(jié)構(gòu)下載及預(yù)處理，其中ACTA2沒有搜索到相關(guān)晶體結(jié)構(gòu)，最終共得到處理好的蛋白靶點9個，采用Sybyl 2.0進(jìn)行大黃素和其治療腦缺血中風(fēng)靶點[CASP3（PDB ID：2J32），KDR（PDB ID：3VO3），PTGS1（PDB ID：6N4E），TNF（PDB ID：5UUI），MMP9（PDB ID：6ESM），PRKCE（PDB ID：2WH0），PTGS2（PDB ID：5F19），MYC（PDB ID：6G6K），TP53（PDB ID：3D06）]進(jìn)行對接，得到對接分?jǐn)?shù)。見表3。Cscroe綜合了多種打分函數(shù)，代表了活性位點和配體的親和力，得分包含0，1，2，3，4，5。其中0分表示配體與受體之間無法穩(wěn)定結(jié)合，3～4分表示二者結(jié)合相對穩(wěn)定，需要進(jìn)一步考慮，5分表示配體與受體之間有較好的親和力[11]。因此通過以Cscore值作為評價大黃素與靶點之間的相互作用，可以看出CASP3、KDR、PTGS1 3種蛋白靶點與大黃素的結(jié)合能力最強(qiáng)，其中大黃素與CASP3的結(jié)合活性位點氨基酸殘基為A/ARG207、A/ARG64、A/HIS121、A/SER205，大黃素與KDR的結(jié)合活性位點氨基酸殘基為A/ASP814，大黃素與PTGS1的結(jié)合活性位點氨基酸殘基為A/CXL200、A/ARG14、A/THR159。見圖6。TNF、MMP9與大黃素的結(jié)合活性相對較好。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)近些年來已成為藥物研究領(lǐng)域日益重要的研究熱點，反向分子對接技術(shù)也逐漸成為中醫(yī)藥現(xiàn)代化的有益工具，它可以將小分子藥物與大分子靶標(biāo)的潛在結(jié)合口袋進(jìn)行對接，根據(jù)結(jié)合的緊密程度篩選小分子藥物的靶點。中風(fēng)是全球死亡和長期殘疾的主要原因[13-14]，大量證據(jù)表明，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在腦卒中的病理生理中起著重要作用[15-16]。

通過對大黃素治療腦缺血中風(fēng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，我們發(fā)現(xiàn)ACTA2、CASP3、KDR、MMP9、MYC、PRKCE、PTGS1、PTGS2、TNF、TP53是其潛在的關(guān)鍵治療靶點，主要涉及通路12條，與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、MAPK信號通路等相關(guān)通路有關(guān)，其發(fā)揮作用可能是通過這些通路實現(xiàn)的。另外據(jù)有關(guān)實驗報道：大黃素具有良好的抗炎作用，能夠降低血清炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子（TNF-a）和白細(xì)胞介素-1（IL-1）的水平，通過超聲心動圖和組織病理學(xué)檢查可發(fā)現(xiàn)實驗性自身免疫性心肌炎大鼠經(jīng)大黃素治療后左心室功能得到明顯改善，心肌炎嚴(yán)重程度顯著減輕[17]。Li等[18]通過調(diào)節(jié)Cx43和AQP4在腦缺血/再灌注（I/R）模型大鼠中的表達(dá)，評估了人參皂苷和大黃素在I/R模型大鼠中的獨(dú)立及聯(lián)合作用，實驗結(jié)果表明，人參皂苷和大黃素的單獨(dú)或聯(lián)合使用均能緩解神經(jīng)功能缺損評分（NDS），血腦屏障通透性和梗死面積。

另外，通過對大黃素治療腦缺血性中風(fēng)的靶點在大腦細(xì)胞中的分布表達(dá)情況分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要集中在星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。根據(jù)相關(guān)報道可知腦缺血中風(fēng)后，在梗死周圍區(qū)域增殖的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元的存活起著有益的作用[19-20]，Mukda等[21]的研究發(fā)現(xiàn)MCAO/MACO/R期間橋粒相關(guān)蛋白表達(dá)的增加反映了皮質(zhì)和紋狀體梗死周圍區(qū)域裂解的Caspase-3的減少，這表明了橋粒相關(guān)蛋白（Pinin）在缺血性卒中中的抗凋亡作用。TP53至少有12種亞型，它們可以促進(jìn)或抑制p53的全長活性或者具有獨(dú)立的功能，在這些亞型中，△133p53是最好的內(nèi)源性抑制劑細(xì)胞衰老的特征[22-23]，Turnquist等[24]的研究表明△133p53可能具有潛在的治療價值，能夠防止星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老，促進(jìn)DNA修復(fù)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。由此可推測大黃素治療腦缺血中風(fēng)的機(jī)制可能與CASP3的表達(dá)、TP53的表達(dá)及星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血中的作用有著不可分割的聯(lián)系。KDR是一種2型血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（VEGFR-2），相關(guān)信號通路能夠維持內(nèi)皮細(xì)胞的成活及增加血管的通透性[25]，而內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和星形細(xì)胞相互作用形成的血腦屏障在維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[26]，一些研究表明血腦屏障功能障礙是腦缺血性中風(fēng)、癲癇、阿爾茨海默病等的重要影響因素[27]。由此可推測大黃素治療腦缺血中風(fēng)的機(jī)制可能與KDR在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)有關(guān)。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦的主要免疫細(xì)胞，是最先對缺血性中風(fēng)引起的病理生理變化做出反應(yīng)的細(xì)胞，在缺血性腦中風(fēng)的治療中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[28]，推測大黃素治療腦缺血中風(fēng)的機(jī)制可能與MYC等靶點蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況有關(guān)。

經(jīng)過反向分子對接，結(jié)果表明CASP3、KDR、PTGS1 3個靶蛋白與大黃素的結(jié)合最好，TNF、MMP9相對較好，其中Caspase-3（CASP3）在凋亡過程中起著重要作用，Rosell等[29]的研究表明其與腦缺血中風(fēng)之后梗死灶的生長相關(guān)。Ahn等[30]的研究表明大黃素可以顯著減少光照血栓中風(fēng)模型小鼠的梗死體積并改善運(yùn)動功能，證實了Bcl-2/Bax，活性caspase-3、磷酸化（p）Akt，p-CREB和BDNF的表達(dá)水平對大黃素在腦缺血中有效的神經(jīng)保護(hù)作用。Leung等[31]通過研究大黃素在體外和體內(nèi)對缺血的神經(jīng)保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)大黃素減少局灶性腦缺血損傷后的梗死體積和細(xì)胞凋亡可能是通過激活ERK-1/2信號通路，提高Bcl-2和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（GLT-1）的表達(dá)，抑制激活的半胱天冬酶-3的活性實現(xiàn)的。且有研究還證明活化的Caspase-3是急性腦損傷后細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，有可能與慢性神經(jīng)退行性進(jìn)展有一定的聯(lián)系[32]。血管內(nèi)皮生長因子受體2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR-2）是一種2型血管內(nèi)皮生長因子受體，被認(rèn)為是促使血管生成的一個關(guān)鍵因素，在腦缺血損傷中扮演著調(diào)節(jié)和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的角色[33]。Feng等[34]的研究認(rèn)為VKORC1和Chr.9p21.3以及VEGFA和KDR 2種新的遺傳相互作用與卒中的風(fēng)險、亞型和卒中的未來預(yù)后有關(guān)。前列腺素G/H合成酶（PTGS1）是花生四烯酸代謝途徑中的酶，催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化生成前列腺素，而前列腺素是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，在血小板中，前列腺素能夠轉(zhuǎn)化為TXA2，從而促進(jìn)血小板活化和聚集[35]。Yi等[36]分析了297例動脈粥樣硬化血栓性卒中患者和291例對照組的PTGS1、PTGS2、TBXAS1、PTGIS、PTGES的11個變異及基因-基因間的相互作用，結(jié)果顯示PTGS2rs20417、PTGS1rs5602和TBXAS1rs41708 3位點的高危交互作用是動脈粥樣硬化血栓性卒中的獨(dú)立危險因素。此外，Zhao等[37]的研究也提到PTGS1與治療中風(fēng)的機(jī)制有關(guān)。腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）作為一種可溶性和跨膜蛋白，在腦卒中后炎癥反應(yīng)中起著重要作用，其實一種多功能的炎癥介質(zhì)，從發(fā)展到修復(fù)和長期驗證效應(yīng)，參與腦缺血中風(fēng)的所有階段[38]。MMPs是一組依賴于鋅和鈣的內(nèi)肽酶，能夠降解ECM的所有成分，包括層粘連蛋白、膠原和纖連蛋白，以及許多其他靶點，其中MMP2和MMP9在卒中中研究最為廣泛，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP9）在多種心血管疾病中發(fā)揮著重要的作用[39]，其降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，引發(fā)中風(fēng)[40]、動脈粥樣硬化[41]等心血管疾病的發(fā)生。MMP9是一種明膠酶，通常被認(rèn)為是酶原的一種形式，大腦中許多細(xì)胞都能分泌MMP9酶原[42]，有研究發(fā)現(xiàn)缺血急性期之后，在亞急性期間，浸潤的白細(xì)胞會進(jìn)一步釋放細(xì)胞因子、趨化因子和過量的ROS，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的產(chǎn)生，特別是MMP9，且MMP的激活可引起急性缺血性中風(fēng)后出血轉(zhuǎn)化相關(guān)的血腦屏障損傷[43-44]。

由此可見，大黃素治療腦缺血中風(fēng)的機(jī)制預(yù)測結(jié)果具有一定的可靠性，主要作用于CASP3、KDR、PTGS1、TNF、MMP9靶點，在大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等中有不同程度的表達(dá)，涉及12條KEGG相關(guān)通路，14條GO生物過程，3條GO細(xì)胞組分，2條GO細(xì)胞功能，表明大黃素可以通過多通路、多靶點對腦缺血中風(fēng)進(jìn)行治療。

參考文獻(xiàn)

[1]GBD 2015 Neurological Disorders Collaborator Group.Global，regional，and national burden of neurological disorders during 1990-2015： a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015[J].Lancet Neurol，2017，16（11）：877-897.

[2] Rammal SA，Almekhlafi MA.Diabetes mellitus and stroke in the Arab world[J].Journal of Taibah University Medical Sciences，2016，11（4）： 295-300.

[3]Liang Z，Wang X，Hao Y，et al.The Multifaceted Role of Astrocyte Connexin 43 in Ischemic Stroke Through Forming Hemichannels and Gap Junctions[J].Front Neurol，2020，11：703.

[4]陳亮，馬岱朝，唐勇，等.王肯堂論治中風(fēng)病思想探略[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2020，13（8）：1379-1383.

[5]容悅瑩，馮素香，吳純偉，等.大黃化學(xué)成分的藥動學(xué)及其代謝的研究進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2016，22（10）：199-203.

[6] 蔣丹.大黃提取物以及大黃素對缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2018.

[7]陳萬生，徐江平，李力，等.大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的促智活性及其機(jī)制[J].中草藥，2001，32（1）：39-41.

[8]Xu M，Zhang DF，Luo R，et al.A systematic integrated analysis of brain expression profiles reveals YAP1 and other prioritized hub genes as important upstream regulators in Alzheimer's disease[J].Alzheimers Dement，2018，14（2）：215-229.

[9] 馬重陽.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究精制清開靈注射液抗缺血性腦卒中的作用機(jī)制[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[10]Jiao X，Sherman BT，Huang da W，et al.DAVID-WS： a stateful web service to facilitate gene/protein list analysis[J].Bioinformatics，2012，28（13）：1805-1806.

[11]王俊堯，陳建新，趙慧輝.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究肝經(jīng)中藥與治療疾病的關(guān)系[J].世界中醫(yī)藥，2019，14（03）：581-584.

[12]Kharkar PS，Warrier S，Gaud RS.Reverse docking： a powerful tool for drug repositioning and drug rescue[J].Future Med Chem，2014，6（3）：333-342.

[13]Feigin VL，Norrving B，Mensah GA.Global Burden of Stroke[J].Circ Res，2017，120（3）：439-448.

[14]Zhang QZ，Guo YD，Li HM，et al.Protection against cerebral infarction by Withaferin A involves inhibition of neuronal apoptosis，activation of PI3K/Akt signaling pathway，and reduced intimal hyperplasia via inhibition of VSMC migration and matrix metalloproteinases[J].Adv Med Sci，2017，62（1）：186-192.

[15]Iadecola C，Anrather J.The immunology of stroke： from mechanisms to translation[J].Nat Med，2011，17（7）：796-808.

[16]Li P，Hu X，Gan Y，et al.Mechanistic insight into DNA damage and repair in ischemic stroke： exploiting the base excision repair pathway as a model of neuroprotection[J].Antioxid Redox Signal，2011，14（10）：1905-1918.

[17]Song ZC，Wang ZS，Bai JH，et al.Emodin，a naturally occurring anthraquinone，ameliorates experimental autoimmune myocarditis in rats[J].Tohoku J Exp Med，2012，227（3）：225-230.

[18]Li Y，Xu QQ，Shan CS，et al.Combined Use of Emodin and Ginsenoside Rb1 Exerts Synergistic Neuroprotection in Cerebral Ischemia/Reperfusion Rats[J].Front Pharmacol，2018，9：943.

[19]Becerra-Calixto A，Cardona-Gómez GP.The Role of Astrocytes in Neuroprotection after Brain Stroke： Potential in Cell Therapy[J].Front Mol Neurosci，2017，10：88.

[20]Shindo A，Maki T，Mandeville ET，et al.Astrocyte-Derived Pentraxin 3 Supports Blood-Brain Barrier Integrity Under Acute Phase of Stroke[J].Stroke，2016，47（4）：1094-100.

[21]Mukda S，Tsai CY，Leu S，et al.Pinin protects astrocytes from cell death after acute ischemic stroke via maintenance of mitochondrial anti-apoptotic and bioenergetics functions[J].J Biomed Sci，2019，26（1）：43.

[22]Turnquist C，Horikawa I，F(xiàn)oran E，et al.p53 isoforms regulate astrocyte-mediated neuroprotection and neurodegeneration[J].Cell Death Differ，2016，23（9）：1515-28.

[23]von Muhlinen N，Horikawa I，Alam F，et al.p53 isoforms regulate premature aging in human cells[J].Oncogene，2018，37（18）：2379-2393.

[24]Turnquist C，Beck JA，Horikawa I，et al.Radiation-induced astrocyte senescence is rescued by Δ133p53[J].Neuro Oncol，2019，21（4）：474-485.

[25]古聯(lián)，陳卓，李敏華，等.KDR基因rs2305948、rs2239702多態(tài)性與缺血性中風(fēng)、冠心病痰瘀證凝血功能的關(guān)聯(lián)性研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2019，42（4）：345-352.

[26]Zhao Z，Nelson AR，Betsholtz C，et al.Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier[J].Cell，2015，163（5）：1064-1078.

[27]Daneman R，Prat A.The blood-brain barrier[J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2015，7（1）：a020412.

[28] Hu X，Leak RK，Shi Y，et al.Microglial and macrophage polarization—new prospects for brain repair[J].Nat Rev Neurol，.2014，11（1）： 56-64.

[29]Rosell A，Cuadrado E，Alvarez-Sabín J，et al.Caspase-3 is related to infarct growth after human ischemic stroke[J].Neurosci Lett，2008，430（1）：1-6.

[30]Ahn SM，Kim HN，Kim YR，et al.Emodin from Polygonum multiflorum ameliorates oxidative toxicity in HT22 cells and deficits in photothrombotic ischemia[J].J Ethnopharmacol，2016，188：13-20.

[31]Leung SW，Lai JH，Wu JC，et al.Neuroprotective Effects of Emodin against Ischemia/Reperfusion Injury through Activating ERK-1/2 Signaling Pathway[J].Int J Mol Sci，2020，21（8）：2899.

[32]Glushakova OY，Glushakov AA，Wijesinghe DS，et al.Prospective clinical biomarkers of caspase-mediated apoptosis associated with neuronal and neurovascular damage following stroke and other severe brain injuries： Implications for chronic neurodegeneration[J].Brain Circ，2017，3（2）：87-108.

[33]黃玉川，許婷婷.血管內(nèi)皮生長因子及其受體2在腦缺血缺氧損傷中的生物學(xué)表達(dá)意義[J].中國臨床康復(fù)，2005，9（25）：159-161.

[34]Feng C，Yang Y，Yang S，et al.Effect of gene-gene and gene-environment interaction on the risk of first-ever stroke and poststroke death[J].Mol Genet Genomic Med，2019，7（8）：e846.

[35] Green GA.Understanding NSAIDs： from aspirin to COX-2.[J].Clin Cornerstone，2001;3（5）：50-60..

[36]Yi X，Lin J，Wang C，et al.Interactions among Variants in Eicosanoid Genes Increase Risk of Atherothrombotic Stroke in Chinese Populations[J].J Stroke Cerebrovasc Dis，2017，26（8）：1773-1780.

[37]Zhao J，Lv C，Wu Q，et al.Computational systems pharmacology reveals an antiplatelet and neuroprotective mechanism of Deng-Zhan-Xi-Xin injection in the treatment of ischemic stroke[J].Pharmacol Res，2019，147：104365.

[38]Hallenbeck JM.The many faces of tumor necrosis factor in stroke[J].Nat Med，2002，8（12）：1363-1368.

[39]Kaplan RC，Smith NL，Zucker S，et al.Matrix metalloproteinase-3 （MMP3） and MMP9 genes and risk of myocardial infarction，ischemic stroke，and hemorrhagic stroke[J].Atherosclerosis，2008，201（1）：130-137.

[40]Wgster D，Zhu C，Bjrkegren J，et al.MMP-2 and MMP-9 are prominent matrix metalloproteinases during atherosclerosis development in the Ldlr（-/-）Apob（100/100） mouse[J].Int J Mol Med，2011，28（2）：247-253.

[41]Vandooren J，Van Damme J，Opdenakker G.On the structure and functions of gelatinase B/matrix metalloproteinase-9 in neuroinflammation[J].Prog Brain Res，2014，214：193-206.

[42]Kurogi R，Kikkawa Y，Matsuo S，et al.Upregulation of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 contributes to restoration of the extracellular matrix in the rabbit basilar artery during cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage[J].Brain Res，2015，1616：26-36.

[43]秦秀德，黃燕，朱磊，等.益腦康對動脈粥樣硬化基礎(chǔ)急性缺血性中風(fēng)大鼠腦組織病理及腦組織血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（16）：166-169.

[44]Zinnhardt B，Viel T，Wachsmuth L，et al.Multimodal imaging reveals temporal and spatial microglia and matrix metalloproteinase activity after experimental stroke[J].J Cereb Blood Flow Metab，2015，35（11）：1711-1721.

（2019-10-10收稿 責(zé)任編輯：王明）