許世達，耿興敏，王露露

（南京林業(yè)大學 風景園林學院，江蘇 南京 210037）

乙烯響應因子(ERF)是AP2/ERF(apetala2/ethylene response factor)大家族中的1個亞族，最早從煙草Nicotianatabacum中分離發(fā)現，都含有1個AP2結構域。ERF受乙烯誘導表達，并且具有與生物脅迫抗性基因啟動子結合的能力[1]。隨著研究深入，ERF結構中各類基序的作用被廣泛關注，其中AP2結構域作為DNA結合域更是受到深入研究。在各類植物生長代謝與非生物脅迫響應等方面，ERF也受到農林研究者的重視。除乙烯外，其他信號分子及表達調控機制也影響著ERF的行使功能。本研究以ERF的結構特征、生物學功能以及有關的調控機制為主題，對近年有關ERF的研究進行綜述，以期為ERF表達調控和功能研究提供思路。

1 ERF的結構特征

1.1 ERF 結構概述

ERF含有1個AP2結構域，AP2結構域是ERF的DNA結合域，是其行使轉錄調控的關鍵。NAKANO等[2]根據系統發(fā)育關系、外顯子-內含子結構和蛋白質基序分別將擬南芥Arabidopsisthaliana和水稻Oryzasativa中的ERF分為12組和15組。這種分類方式適用多種植物，如苜蓿Medicagosativa[3]、二穗短柄草Brachypodiumdistachyon[4]、人參Panaxginseng[5]等。同組的ERF因為有著相似的結構和保守基序，通常具有相似的性質[2]。

AP2結構域最早發(fā)現于擬南芥AP2基因中，由大約60個氨基酸組成[1,6]。AP2結構域的N端存在1個堿性親水區(qū)，含有3個反平行的β-折疊，這3個β-折疊在識別順式作用元件中具有重要作用，C端有1個兩親性的α-螺旋，可能參與其他轉錄因子或DNA的相互作用[7]。ERF根據AP2結構域上特定位置的不同，氨基酸殘基可分為ERF與DREB，由于殘基的不同，ERF和DREB對啟動子的親和性和識別特異性會有差異[8]。ERF和DREB通常結合的順式元件分別是GCC(核心序列為GCCGCC)和DRE/CRT(dehydration-responsive element/C-repeat，核心序列為CCGAC)[9]。除這兩者外，ERF還可以結合其他的基序，例如剛毛檉柳Tamarixhispida的ThCRF1可與GCC、DRE、TTG1和TTG2基序結合[10]。ERF與基序結合的特異性似乎受到某種機制的調控，根據接收到的信號改變對基序的結合傾向，例如擬南芥中ERF1在茉莉酸誘導下與茉莉酸響應基因啟動子上的GCC基序結合，但受到非生物脅迫時，ERF1優(yōu)先與脅迫抗性基因啟動子上的DRE基序結合[11]。

1.2 功能基序

ERF在AP2域外含有一些保守的氨基酸基序。有些基序在ERF參與轉錄調控時起到重要作用，當基序缺失或突變時會導致功能的改變或缺失。比如EAR(ERF-associated amphiphilic repression)類基序，這類基序有2種保守序列，分別為LxLxLx和DLNxxP[12]。EAR基序可直接影響ERF轉錄調控的功能，例如擬南芥中ERF4有2種亞型，其中ERF4-R(含有EAR基序)能抑制基因表達，而ERF4-A(不含EAR基序)能上調基因表達[13]。有的基序具有激活結構域的功能，比如EDLL基序具有激活轉錄的功能，因保守的谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)和亮氨酸(L)殘基而得名，屬于酸性的激活結構域[14]?；蜻€有其他功能，如擬南芥ESR1中的ESR基序是激活結構域，當用VP16替換ESR基序時，ESR1喪失了促進芽再生的能力[15]。ERF功能基序可以通過基因編輯的方式添加至目標ERF基因中，修飾后ERF的功能根據基序的類別發(fā)生改變，例如將以EAR基序為基礎改造的SRDX序列添加至ERF中，使修飾后的ERF具有轉錄抑制的功能[16]。

2 ERF的功能

ERF的生物學功能涉及范圍非常廣，脅迫和生長發(fā)育都有它的參與。ERF的功能主要由直接調控目標基因實現，也有一些是通過調控其他轉錄因子實現(表1)。

表 1 ERF 的功能Table 1 Function of ERF

2.1 ERF 在脅迫響應時的功能

ERF在植物受到脅迫時通過調控脅迫響應的相關基因以應對各種脅迫。生物脅迫中，ERF抵御真菌病原體最直接的方式是上調有關防衛(wèi)基因，如擬南芥中ERF96上調PDF和PR這類病理相關基因[17]；擬南芥中Ⅸb組ERF可以上調CYP81F2促進殺菌劑吲哚類硫苷合成[19]。還有通過促進程序性死亡以防止病原體的擴散，如番茄Solanumlycopersicum中ERF68可以上調有關細胞程序性死亡的基因促進細胞死亡[28]。非生物脅迫下ERF通過調控各種非生物脅迫抗性相關基因表達，提高植物抗逆性。碧冬茄中PhERF2在植株受水淹的情況下上調ADH1-2乙醇脫氫酶的表達，提高植株對水淹的抗性[31]。枇杷的EjERF39受低溫誘導，上調木質素合成基因Ej4CL1，促進果實木質化，減輕冷害[38]。ERF可以通過調控轉錄因子來增強植物抗性，例如山葡萄中VaERF092受低溫脅迫誘導并通過增強VaWRKY33表達，從而間接增強植株對低溫的抗性[32]。ERF還可以通過調控滲透調節(jié)物質以增強植物的抗性，例如小豆Vigna angularis中VaERF3在鹽堿脅迫中及水稻OsERF71在干旱脅迫中都可以誘導脯氨酸的積累，分別提高相應的脅迫抗性[39?40]。

ERF可能在逆境條件下負調控植物抗性，這會加劇植物所受的傷害。ERF可以通過直接抑制相關抗性基因的表達降低植物的抗性。擬南芥AtERF72會受缺鐵環(huán)境誘導并抑制參與鐵吸收的IRT1和HA2的表達，進一步抑制鐵吸收[22]。白樺Betulaplatyphylla中BpERF11受鹽脅迫和干旱脅迫誘導表達，抑制LEA和脫水蛋白基因的表達，并加劇干旱脅迫導致的傷害[41]。ERF還能通過抑制相關轉錄因子的表達以起到間接負調控。蘋果中MdERF4抑制具有鹽脅迫抗性的MdERF3表達，從而削弱了植物對鹽脅迫的抗性[24]。還有ERF通過抑制植物激素或信號分子以負調控脅迫的響應基因。小果野蕉中MaERF10受低溫脅迫誘導，與TIFY蛋白MaJAZ3互作通過抑制茉莉酸合成基因的表達以抑制茉莉酸信號途徑，從而使果實表現出明顯的冷害[33]。CaDRAT1在辣椒Capsicumannuum受到干旱脅迫時，通過抑制脫落酸(abscisic acid，ABA)合成基因的表達從而抑制了依靠ABA信號的干旱響應基因的表達[42]。

ERF負調控脅迫下的植物抗性或許是為維持其他系統的穩(wěn)定。番茄SlERF84可以增強干旱和鹽脅迫抗性，但會削弱生物脅迫抗性，原因可能是SlERF84通過增強活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除能力以減緩細胞死亡，從而削弱植物對病原體的抗性[43]。蘋果中MdERF4對MdERF3的調控可能是鹽脅迫下維持乙烯在植物體內穩(wěn)態(tài)的反饋調節(jié)機制[24]。番薯Ipomoeabatatas中IbERF4抑制非生物脅迫響應基因表達，這或許是因為IbERF4主要參與調控開花和葉片衰老而導致的[44]。

2.2 ERF 在果實成熟中的功能

果實成熟的標志包括褪綠和變軟。ERF可以通過調控相關基因促進葉綠素的降解，比如甜橙和椪柑中CitERF6上調果實中參與葉綠素降解的CitPPH，從而促進果實褪綠[45]；甜橙CitERF13可以直接上調CitPPH和CitNYC加速果實褪綠[35]。一般果實在成熟后會發(fā)生軟化的現象，軟化會影響果實的貨架期壽命以及運輸，ERF能通過調控相關基因調節(jié)軟化的過程，比如桃子中PpeERF2通過抑制PpeNCED2、PpeNCED3(參與ABA合成)和PpePG1(參與細胞壁降解)的表達，以防止果實過早軟化[36]；同樣還有番木瓜中CpERF9和小果野蕉MaDEAR1，都是通過抑制相關細胞壁降解的基因表達，防止果實過早軟化[34,37]。

2.3 ERF 在花葉衰老與脫落中的功能

花或葉的衰老和脫落是植物的生理現象，但衰老和脫落并非為一種過程。衰老背后的本質是細胞的程序式死亡。以擬南芥為例，擬南芥WRKY53被視為葉片衰老的核心轉錄因子，ESP/ESR負調控WRKY53，AtERF4和AtERF8可以直接抑制ESP/ESR的表達從而間接加速葉的衰老[46]。擬南芥中過氧化氫(H2O2)正向增強WRKY53的表達，ERF4的2種亞型直接調控CAT3的表達以控制H2O2的量從而間接調控衰老進程[13]。ERF還可以通過調節(jié)其他信號分子及其信號轉導來調節(jié)花或葉的衰老。蕪菁中BrERF72由茉莉酮酸甲酯誘導并上調茉莉酸合成基因表達從而通過茉莉酸信號途徑加速葉片衰老[26]。KHASKHELI等[47]在月季花中篩選出可以上調細胞分裂素含量的基因RhERF113，在沉默其表達后，花加速衰老，而在補充外源細胞分裂素后可以使衰老速度恢復到正常水平。脫落是另一種過程，脫落器官在基部的離區(qū)細胞受乙烯等激素信號的誘導完成脫落。在乙烯信號傳導過程中有一類名為EDF(ethylene response DNA-binding factors)的蛋白質位于EIN3的下游[48]，EDF在植物開花期間促進花的衰老和脫落。一種名為FUF1的ERF可抑制EDF的表達從而達到延長花期的效果[49]。此外，月季的β-半乳糖苷酶基因RhBGLA1會加速花瓣的脫落，而RhERF1和RhERF4可以抑制此基因的表達，防止花瓣脫落[29]。

3 ERF的表達調控

3.1 植物對 ERF 的調控機制

3.1.1 信號分子對ERF的調控 ERF受各類信號分子的誘導從而表達并行使相應的功能(圖1)，這些信號分子通過在植物體內的信號轉導，逐級將體內和體外的環(huán)境信息傳遞，最終完成對ERF的表達調控。

圖 1 ERF與信號分子的調控關系Figure 1 Regulatory relationship between ERF and signal molecules

作為ERF的命名來源，乙烯對ERF的調控關系最先被發(fā)現[1]。乙烯經過信號轉導，誘導ERF在植物體內調控脅迫防御及生長發(fā)育等生理過程。以擬南芥為例，乙烯與位于內質網膜上的各類乙烯受體結合，使與受體關聯的激酶CTR1失活，無法磷酸化EIN2的C端[50]。未被磷酸化的EIN2從而進入細胞核，使轉錄因子EIN3能穩(wěn)定存在并發(fā)揮作用[51]，隨即EIN3激活包括ERF1等轉錄因子的轉錄，這些轉錄因子調控其他的乙烯響應基因以完成乙烯信號響應。除ERF1外還有許多受乙烯信號誘導的ERF，如枸杞Lyciumchinense中的LchERF受乙烯誘導增強植株鹽脅迫抗性[52]，擬南芥中AtERF4受乙烯誘導降低了對乙烯的敏感性[53]。

ABA在植物對抗非生物脅迫時能通過誘導相關的ERF增強抗性。比如番茄ERF5基因的轉錄受外源ABA誘導并能增強植物對干旱和鹽脅迫的抗性[54]。ABA與乙烯2種信號在部分情況下也存在拮抗作用，例如擬南芥中ABA信號能激活下游ERF基因ABI4，而乙烯信號通過EIN3能夠抑制ABI4的表達，兩者的拮抗作用影響抗壞血酸與ROS的含量[55]。ERF也可以反過來調控ABA信號傳導。擬南芥AtERF4受ABA誘導并抑制ABA的信號傳導，ABA響應基因明顯下調[53]。

ERF和其他植物激素也有調控關系，這其中發(fā)現較多的是茉莉酸信號與ERF之間的調控，茉莉酸信號對ERF的調控主要表現在抗逆性和生長代謝等方面。例如在抵御脅迫時水稻OsERF71和擬南芥ERF96都可由茉莉酸信號誘導表達，提高植物對生物脅迫的抗性[17,25]。在植物生長代謝方面，茉莉酸信號可由ERF進一步促進茉莉酸的信號傳導，如蕪菁BrERF72可由茉莉酮酸甲酯誘導并上調參與茉莉酸合成相關基因從而加速葉片衰老[26]。茉莉酸信號通過ERF還能調控其他代謝相關的產物生成，例如番茄JRE4受茉莉酸誘導上調，JRE4直接上調甾醇還原酶和配糖生物堿代謝相關基因促進糖苷生物堿的合成[27]。生長素信號誘導ERF參與了脫落有關的調控，月季花瓣離層RhERF4受生長素誘導且抑制下游RhBGLA1的轉錄，從而抑制了離層果膠的降解，延緩花瓣脫落[29]。水楊酸是重要的植物防御激素，它本身能誘導ERF的表達，例如水稻的OsERF96和山海關楊Populusdeltoides‘Shanhaiguan’的PdERF-18[56?57]。

ROS在ERF接收脅迫信號過程中具有重要作用。脅迫初期位于細胞膜上的蛋白質感應到脅迫信息，需要次級信使將脅迫信息傳至內部。ROS作為次級信使之一能夠將細胞內的信號快速傳遞至細胞核，激活一系列蛋白激酶(protein kinases，PKs)或蛋白磷酸酶(protein phosphatases，PPs)，而PKs和PPs可以觸發(fā)對轉錄因子磷酸化或脫磷酸化級聯反應[58?59]。例如擬南芥中ROS會觸發(fā)MPK6，隨后MPK6磷酸化ERF6，最后ERF6調控下游相關ROS響應基因[60]。除此之外，還有水稻中受ROS誘導的SERF1，通過MAPK5磷酸化后激活，提高水稻的鹽脅迫抗性[61]。

3.1.2 其他因子對ERF的調控 在ERF基因轉錄后，目前有選擇性剪接和miRNA為主的2種調控方式。選擇性剪接在參與非生物脅迫的DREB中較為常見，如水稻的OsDREB2A/2B[62]和玉米Zeamays的ZmDREB2A[63]，只有在脅迫下才會產生具有功能的有效轉錄本。選擇性剪接還可導致功能轉變，例如擬南芥中，ERF4-A和ERF4-R的存在比率由RNA結合蛋白FPA控制，當葉片開始衰老時，ERF4-R的存在比率比未衰老時高，從而抑制抗氧化酶的表達以促進葉片的衰老[13]。miRNA作為一類非編碼RNA，主要通過降解mRNA或是沉默目標基因的翻譯以抑制目標基因的表達。如miRNA172通過抑制AP2/ERF蛋白的翻譯從而對調控生殖器官的發(fā)育以及抑制干細胞增殖起到了關鍵的作用[64]。選擇性剪接和miRNA都是針對mRNA的修飾方式，選擇性剪接使ERF可以產生多種轉錄本，豐富了ERF功能的多樣性。miRNA對mRNA進行直接修飾可以特異性負調控ERF，明晰miRNA對ERF的表達調控機制可以促進miRNA技術在ERF功能上的應用。

有一些調控機制可以降解或激活已翻譯成蛋白質的ERF。泛素化是降解ERF的調控方式之一，例如擬南芥中，響應干旱脅迫的AtERF53在非脅迫情況下會被帶有RING結構域的E3泛素連接酶RGLG2泛素化，使其被26s蛋白酶分解[65]。Ⅶ組的ERF被獨特的N端規(guī)則所調節(jié)，這些ERF的N端在正常生長環(huán)境下會被植物半胱氨酸氧化酶Pco1/2修飾，隨后被N端識別蛋白ATE1/2和PRT6識別并降解。其中半胱氨酸受氧氣(O2)與一氧化氮(NO)氧化，而非生物脅迫能抑制NO的積累。在植物處于缺氧狀態(tài)或是脅迫的情況下，Ⅶ組的ERF才得以穩(wěn)定存在，從而激活脅迫相關的應答基因[66?67]。不同于前兩者，磷酸化是一種激活ERF的機制，對ERF是重要的調控途徑。不同激酶磷酸化通常會導致ERF的功能發(fā)生變化，包括活性的變化和細胞器的定位等。WANG等[60]研究發(fā)現：擬南芥ERF6上的磷酸化位點可以被MPK6特異性識別并進行磷酸化，磷酸化后的ERF6轉錄因子對其下游基因具有更強的激活活性。盡管野大豆Glycinesoja的GsERF7本身含有核定位信號基序，但只有被GsSnRK1磷酸化之后才會從細胞質被重新定位至細胞核，從而發(fā)揮轉錄調控功能[68]。

3.2 ERF 對下游基因的調控機制

3.2.1 ERF對信號分子的調控 ERF有些功能是通過調控植物中的信號分子完成的，比如ERF通過調控植物激素合成途徑中的關鍵酶基因以控制植物激素信號通路。ERF通過調控乙烯合成關鍵基因的表達，從而調節(jié)乙烯的生物合成和信號傳導，例如蘋果果實中的MdERF3受乙烯誘導且能上調MdACS1的表達，從而加速乙烯的合成[23]。ERF還可以抑制乙烯合成關鍵酶基因的表達，以控制乙烯的生成，例如HAN等[69]在小果野蕉果實中發(fā)現MaERF11能夠有效抑制MaACO1的轉錄從而抑制乙烯的合成。除此之外，ERF也可以參與果實成熟過程中乙烯合成模式的轉換。例如蘋果果實成熟初期，MdERF2通過抑制酶活性較高的MdACS1的表達，并上調酶活性較低MdACS3a的表達，來限制乙烯在果實中的積累以放慢蘋果的成熟速度[23,70]。

ERF也可以通過調控ABA合成相關基因從源頭調控ABA的信號，例如煙草中JERF1直接上調ABA合成相關基因NtSDR以增加ABA的含量，增強煙草對鹽脅迫和低溫脅迫的抗性[71]。ERF還可抑制ABA信號，例如擬南芥AtERF4過表達株系的種子經ABA處理后，相比于野生型種子，ABA信號轉導下游基因表達量明顯下降[53]，這說明AtERF4是通過抑制ABA的信號傳導調控了ABA的信號。桃子PpeERF2可以直接抑制ABA合成相關基因PpeNCED2、PpeNCED3的表達以抑制ABA的合成[72]。其他植物激素如茉莉酸和水楊酸等也受到ERF的調控，例如蕪菁BrERF72上調參與茉莉酸合成相關基因從而加速葉片衰老[26]，蘋果MdERF11通過促進水楊酸的合成以增強植株對生物脅迫的抗性[73]。

ERF可以通過調控呼吸暴發(fā)氧化酶同系物(respiratory burst oxidase homolog，Rboh)家族基因，加速ROS生成，從而促進脅迫信號傳遞，完成早期脅迫響應。比如擬南芥中的AtERF73/74在脅迫初期能調控Rboh家族基因，Rboh催化H2O2生成，H2O2將脅迫信號繼續(xù)傳遞[18,74]。信號傳遞后過量的ROS會對植物產生氧化傷害，ERF通過加強ROS清除系統以清除過量的ROS。例如SUN等[75]將山葡萄中受低溫脅迫誘導的VaERF080/087轉入擬南芥，轉基因植株較野生型在低溫脅迫下活性氧清除酶具有更高活性，也表現出更好的低溫抗性。擬南芥ERF4-A可以上調CAT3的表達從而減緩細胞死亡[13]。植物激素可以通過ERF調節(jié)抗氧化系統以控制ROS，例如罌粟中PsAP2可由乙烯、茉莉酸和ABA誘導并通過上調AOX1a增強植株的抗氧化能力[30]。

3.2.2 蛋白質互作 ERF與蛋白質協作互作可以介入到多種反應。通過與相應的蛋白質協作能大幅提高轉錄激活能力。比如GmERF5與GmbHLH、GmEIF互作，可提高大豆Glycinemax對病原體的抗性[76]，OsERF3和WOX11互作調控細胞分裂素響應基因RR2以調節(jié)水稻的根冠發(fā)育[77]，EjERF39和EjMYB8互作調控木質素合成基因以增強枇杷果實低溫抗性[38]。具有轉錄抑制功能的ERF通過招募輔抑制因子以起到加強抑制的作用，例如在小果野蕉果實中，MaERF11可以抑制果實成熟相關基因的表達并可招募組蛋白去乙?；窶aHDA1增強抑制效果[69]。ERF通過與其他轉錄因子之間發(fā)生互作以競爭與目標啟動子結合的機會，例如蘋果MdERF2通過其N端與MdERF3的DNA結合域結合，從而使MdERF3無法與目標基因啟動子結合[23]。

4 展望

ERF是植物特有的轉錄因子，其AP2結構域作為DNA結合域受到大量關注，但在AP2結構域外尚有很多基序是未知的，且這些基序能否應用在基因工程中也需要進一步研究。ERF的功能受到很多農林領域研究者的關注，但對于ERF這個大家族來說，得到明確功能注釋的僅有少數，且主要出自少數模式作物，后期研究應對其他植物中ERF進行大量的功能驗證。園藝領域研究者對ERF調控果實成熟和花葉的衰老與脫落的關注較多，未來可以對園藝植物在切花或果實保鮮和花果期調控等課題深入研究。ERF既受信號分子調控，又調控信號分子的生成和傳導。目前有大量關于ERF與各類信號分子之間調控的研究，但大多數并未涉及到信號交叉或完整的調控網絡，或許未來研究者可以關注在信號調控網絡中ERF所發(fā)揮的節(jié)點作用。植物中一些因子對ERF調控使ERF適宜地發(fā)揮作用，這些調控機制有助于理解ERF發(fā)揮功能的過程，但很少得到具體應用。目前來看，應用miRNA具有一定的可行性，或許未來應更深入miRNA調控ERF的研究。ERF與蛋白質相互作用類型廣泛，具有結構域的特異性，但這方面的機理研究還有很多空缺，未來有關ERF-蛋白質特異性結合的機理應該得到深入研究。