屠玲艷，吳學(xué)謙，許海順

（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

三葉青Tetrastigmahemsleyanum為葡萄科Vitaceae崖爬藤屬Tetrastigma的藥用植物，主要以地下塊根入藥。在臨床中，三葉青內(nèi)服可治療咽喉炎、肝炎、肺炎、小兒高熱驚厥及病毒性腦膜炎等炎癥，外用可治毒蛇咬傷、跌打損傷、癰疽等疾病，被譽(yù)為“植物抗生素”，是中國獨(dú)有的珍貴藥材，主要分布于浙江、湖南、廣東、廣西、四川等地[1]。由于三葉青具有良好的抗腫瘤功效且無毒副作用[2]，導(dǎo)致三葉青需求量大量增加，人工栽培面積不斷擴(kuò)大。人工種植三葉青多采取遮光大棚霧噴管理，藤葉生長茂盛，但塊根品質(zhì)卻遠(yuǎn)不如生長環(huán)境苛刻的野生三葉青[3?5]。逆境脅迫雖抑制植物的生長發(fā)育，特別是營養(yǎng)生長，但同時(shí)也會(huì)促進(jìn)或者抑制植物中黃酮等一些次生代謝產(chǎn)物的累積[6?9]。三葉青喜陰濕環(huán)境，野生三葉青多生長于山坡或山溝、溪谷兩旁的針闊混交林或雜木林林下背陰處[10?11]，可見水分條件對(duì)三葉青的生長影響較大。目前，溫度[12?13]、光照[14?15]、土壤肥料[16?17]等環(huán)境因子對(duì)三葉青生長的影響已有研究，但關(guān)于水分脅迫對(duì)三葉青特別是三葉青黃酮含量的影響還未見報(bào)道。因此，本研究分析了水分脅迫對(duì)三葉青生長、黃酮含量及其合成途徑中關(guān)鍵酶的影響，為人工種植高品質(zhì)三葉青提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

三葉青由浙江五養(yǎng)堂藥業(yè)有限公司遂昌縣金竹藥王谷三葉青基地提供。為了保持試驗(yàn)材料的一致性，以專用袋標(biāo)準(zhǔn)化繁育的2年生三葉青植株作為供試材料。

1.2 材料處理

實(shí)驗(yàn)地位于浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū) (30°15′28″N，119°43′35″E)，該區(qū)全年降水量 1 628.6 mm，全年平均氣溫16.4 ℃，年日照時(shí)數(shù)1 847.3 h，無霜期237.0 d。取長勢良好的2年生的三葉青植株，種植在上口徑20 cm、下口徑15 cm、高20 cm的塑料花盆中，栽培基質(zhì)為過篩土∶營養(yǎng)基質(zhì)=2∶1(質(zhì)量比)，每盆1株，緩苗5周，緩苗期間定時(shí)定量澆水。5周后，選取長勢基本一致的2年生植株57株，隨機(jī)分為3組，每組19盆，設(shè)置3個(gè)處理組，分別為干旱、水澇和對(duì)照。干旱組在試驗(yàn)期間一直不澆水，水澇組保證地下部分在試驗(yàn)期間一直處于淹水狀態(tài)，對(duì)照組在試驗(yàn)期間正常澆水。

1.3 樣品獲取

干旱組在脅迫處理的第1、8、16、24、32、40天，于相同葉位隨機(jī)取樣3盆(預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三葉青在不澆水40 d左右出現(xiàn)死亡現(xiàn)象)，水澇組在脅迫處理的第1、4、8、12、16、20天，于相同葉位隨機(jī)取樣3盆(預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三葉青在水淹20 d左右出現(xiàn)死亡現(xiàn)象)，對(duì)照組在脅迫處理的第1、4、8、12、16、20、24、32、40天，于相同葉位處隨機(jī)取樣3盆。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，所有樣品取樣后立即用清水洗凈擦干后再立即用液氮預(yù)冷，于?80 ℃冰箱保存待測。

電鏡樣品取樣，在脅迫處理最后1 d，取植株的中部成熟葉片，中間靠近大葉脈處部位切成長0.1 cm、寬0.2 cm左右的小片(避開大葉脈)后迅速放入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液中，抽真空至材料沉入固定液底部，4 ℃固定過夜，每個(gè)試驗(yàn)組重復(fù)3次。

1.4 研究方法

1.4.1 三葉青葉片及塊根表型拍攝 隨機(jī)取實(shí)驗(yàn)三葉青進(jìn)行葉片表型拍攝，再取塊根，洗凈后擦干進(jìn)行塊根表型拍攝。

1.4.2 葉綠體超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察預(yù)處理 倒掉固定液，用0.1 mol·L?1pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸固定樣品1～2 h后漂洗3次。然后用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%和95%)對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理，每種體積分?jǐn)?shù)處理15 min，再用純乙醇處理20 min，最后用純丙酮處理20 min。接著用Spurr包埋劑與丙酮的混合液(V/V=1/1)處理樣品1 h；再用Spurr包埋劑與丙酮的混合液(V/V=3/1)處理樣品3 h；最后用純包埋劑處理樣品過夜。將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來，70 ℃加熱過夜，即得到包埋好的樣品；樣品在LEICA EM UC7型超薄切片機(jī)中切片，獲得70～90 nm的切片；切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液(體積分?jǐn)?shù))各染色5～10 min。最后在Hitachi H-7 650型透射電鏡中觀察葉肉細(xì)胞中的葉綠體。

1.4.3 黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定方法參照文獻(xiàn)[18?19]。以蘆丁不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg)為縱坐標(biāo)(y)，以波長500 nm下的吸光度D(500)為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.245 9x+0.001 6(R2=0.999 9)。測定樣品在500 nm波長下的吸光度D(500)，計(jì)算三葉青總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

1.4.4 黃酮合成關(guān)鍵酶活性測定 酶液制備及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定參照徐琳煜[20]的方法，以每克鮮質(zhì)量葉片每分鐘波長290 nm下的吸光度D(290)變化0.01為1個(gè)酶活力單位(16.67 nkat·g?1·min?1)。查爾酮合成酶 (CHS)活性測定參照試劑盒法(上海晶抗生物工程)：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度(×16.67 nkat·L?1)為縱坐標(biāo)(y)，波長450 nm下的吸光度D(450)為橫坐標(biāo)(x)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程y=92.238x+1.193 8(R2=0.999)，然后根據(jù)樣品的D(450)計(jì)算樣品相應(yīng)的濃度。查爾酮異構(gòu)酶(CHI)活性測定參照試劑盒法(上海晶抗生物工程)：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度(×16.67 nkat·L?1)為縱坐標(biāo)(y)，波長450 nm下的吸光度D(450)為橫坐標(biāo)(x)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程y=1 165.3x+50.552(R2=0.999)，然后根據(jù)樣品的D(450)計(jì)算出樣品相應(yīng)的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與制圖；運(yùn)用單因素方差分析和最小顯著極差法LSR進(jìn)行方差分析和多重比較 (α=0.05)；采用 Pearson’s進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分脅迫下三葉青葉片和塊根表型特征

水分脅迫嚴(yán)重影響三葉青的營養(yǎng)生長。從葉片表型來看，未遭受水分脅迫的三葉青(對(duì)照)葉片飽滿，色澤鮮艷，葉脈清晰；干旱脅迫40 d后，三葉青葉片失水，萎蔫，逐漸發(fā)黃枯萎；水澇脅迫20 d后，三葉青葉片失綠變黃(圖1)。從塊根的表觀形態(tài)上來看，對(duì)照組的塊根飽滿，形狀完好，而干旱組的塊根失水皺縮，表皮布滿溝壑，水澇組的塊根綿軟，表皮極易脫落，塊根幾乎腐爛(圖2)。

圖 1 水分脅迫對(duì)三葉青葉片的影響Figure 1 Effects of water stress on leaves of T.hemsleyanum

圖 2 水分脅迫對(duì)三葉青塊根的影響Figure 2 Effects of water stress on roots of T.hemsleyanum

2.2 水分脅迫下三葉青葉綠體超微結(jié)構(gòu)特征

葉綠體結(jié)構(gòu)的完整性及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性對(duì)光合作用的光能吸收和傳遞有著重要作用。與對(duì)照相比，水澇和干旱處理下葉綠體數(shù)目明顯減少(圖3A1，圖3B1，圖3C1)。水分脅迫下，三葉青葉片中的葉綠體在細(xì)胞內(nèi)的排列方式發(fā)生變化，與對(duì)照的緊貼細(xì)胞壁并且整齊分布相比，水澇和干旱處理后，葉肉細(xì)胞中的葉綠體與細(xì)胞壁分離，擠向液泡，在細(xì)胞中呈現(xiàn)擁擠混亂的現(xiàn)象，葉綠體向細(xì)胞中間靠攏，完全隨機(jī)分布在細(xì)胞中(圖3A1，圖3B1，圖3C1)。水澇和干旱處理后，葉肉細(xì)胞葉綠體膨脹，失去原本形態(tài)，葉綠體中淀粉粒數(shù)量增多，可能是代謝不正常導(dǎo)致淀粉粒無法運(yùn)出造成的(圖3A2，圖3B2，圖3B3)。與對(duì)照相比，水澇和干旱處理后，葉綠體基質(zhì)顏色變淺，葉綠體膨大，質(zhì)體小球顏色變淺，數(shù)量增多，體積變大(圖3A3，圖3B3，圖3C3)。對(duì)照基粒片層結(jié)構(gòu)整齊，緊密排列，而干旱和水澇處理后，基粒片層失去整齊緊密結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞質(zhì)之間不再有完整界限，結(jié)構(gòu)被破壞(圖3A4，圖3B4，圖3C4)。

圖 3 水分脅迫對(duì)三葉青葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響Figure 3 Effects of water stress on chloroplast ultrastructurey of leaves in T.hemsleyanum

2.3 水分脅迫對(duì)三葉青塊根黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

水分脅迫影響三葉青塊根的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。水澇脅迫8 d后，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對(duì)照(P＜0.05)，在脅迫12 d時(shí)達(dá)到最大值。干旱脅迫16 d后，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對(duì)照(P＜0.05)，在脅迫16 d時(shí)達(dá)到峰值(圖4)。對(duì)照總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持在比較穩(wěn)定的范圍內(nèi)，而水澇和干旱處理后，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先低后高再回落的變化趨勢。

圖 4 水分脅迫下三葉青塊根黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Figure 4 Change of content of flavonoid in T.hemsleyanum under water stress

2.4 水分脅迫對(duì)三葉青塊根黃酮合成關(guān)鍵酶活性的影響

水分脅迫對(duì)三葉青塊根黃酮合成關(guān)鍵酶活性的影響較大。水澇脅迫4 d后，PAL活性顯著提高(P＜0.05)，并且在脅迫4 d時(shí)達(dá)到峰值，之后下降且在脅迫16 d時(shí)顯著低于對(duì)照(P＜0.05)。干旱脅迫16 d后，PAL活性顯著高于對(duì)照(P＜0.05)，并且在脅迫16 d時(shí)達(dá)到峰值，之后下降且在脅迫32 d時(shí)顯著低于對(duì)照(P＜0.05)。即PAL活性呈先上升后下降的趨勢，脅迫處理前期大于對(duì)照，脅迫后期則低于對(duì)照 (圖 5)。

圖 5 水分脅迫下三葉青塊根PAL活性的變化Figure 5 Change of activities of PAL in T.hemsleyanum under water stress

水分脅迫影響三葉青CHS活性。水澇脅迫4 d后，CHS活性顯著高于對(duì)照(P＜0.05)，且在脅迫處理的12 d達(dá)到最大值，之后回落到與對(duì)照近似水平。干旱脅迫16 d后，干旱處理的CHS活性顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，并且在脅迫16 d達(dá)到峰值，之后下降至與對(duì)照近似水平。整個(gè)研究過程中，水澇和干旱處理的CHS活性呈先上升后下降的趨勢，且酶活性大于對(duì)照組，對(duì)照組基本不變(圖6)。

圖 6 水分脅迫下三葉青塊根CHS活性的變化Figure 6 Change of activities of CHS in T.hemsleyanum under water stress

與對(duì)照相比，水澇脅迫12 d后，CHI活性顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，并且在脅迫處理的12 d達(dá)到峰值，之后開始下降。干旱脅迫下，CHI活性在8～16 d迅速增加，且在脅迫16 d顯著高于對(duì)照(P＜0.05)，之后開始下降(圖7)。總體來說，水澇和干旱的CHS活性呈先上升后下降的趨勢，且酶活性大于對(duì)照組，而對(duì)照組的CHI活性一直比較穩(wěn)定。此外，相比于CHS活性，CHI對(duì)脅迫的響應(yīng)略有延緩，說明CHI可能在CHS之后起作用。

圖 7 水分脅迫下三葉青塊根CHI活性的變化Figure 7 Change of activities of CHI in T.hemsleyanum under water stress

2.5 水分脅迫下黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與黃酮合成關(guān)鍵酶的相關(guān)性分析

從表1可以看出：干旱和水澇脅迫下，三葉青黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PAL、CHS、CHI活性之間均表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，個(gè)別呈顯著相關(guān)(P＜0.05)，表明黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)受酶活性的調(diào)控。脅迫處理組的PAL與CHS、CHI之間呈正相關(guān)，但相關(guān)不顯著(P＞0.05)；CHS和CHI之間呈極顯著相關(guān)(P＜0.01)，表明CHS和CHI共同促進(jìn)黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。

表 1 水分脅迫下黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PAL、CHS、CHI之間的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between flavonoid content, PAL, CHS and CHI under water stress

3 討論與結(jié)論

水分影響三葉青的光合作用，而葉綠體作為光合作用的反應(yīng)場所，其結(jié)構(gòu)的完整性是影響光合作用正常運(yùn)行的關(guān)鍵。本研究在三葉青葉綠體超微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)：脅迫使三葉青葉綠體數(shù)量減少且不斷向細(xì)胞中央靠攏，可能是三葉青葉片發(fā)黃的原因。王順才等[21]在研究干旱脅迫對(duì)3種蘋果屬M(fèi)alus植物的葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響時(shí)也證實(shí)了這一點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)：干旱和水澇下，葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，葉綠體膨大變圓，淀粉粒大量積累無法運(yùn)出，質(zhì)體小球的數(shù)量增多、體積變大、顏色變淺。楊鳳軍等[22]研究了干旱脅迫對(duì)番茄Lycopersiconesculentum葉面葉綠體超微結(jié)構(gòu)后表明：逆境導(dǎo)致質(zhì)體小球數(shù)量增加；因?yàn)橘|(zhì)體小球是類囊體降解脂類聚集的結(jié)果，其數(shù)量的變化可作為葉細(xì)胞受損的標(biāo)志[23]。本研究還觀察到水澇和干旱的三葉青葉綠體基粒片層失去整齊緊密排列結(jié)構(gòu)，變得松散模糊，沒有界限，這與李冬林等[24]的研究結(jié)果一致；表明水澇和干旱使三葉青葉片葉綠體膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，失去生理活性，從而影響三葉青的光合作用和營養(yǎng)生長。

次生代謝過程是連接生態(tài)環(huán)境與藥效成分含量的中間環(huán)節(jié)，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物在植物自我保護(hù)、生理調(diào)節(jié)等生命活動(dòng)方面起著重要作用[25]，并且是藥用植物的主要藥效成分。環(huán)境影響次生代謝產(chǎn)物的形成和積累[26]。目前，關(guān)于非生物因子影響藥用植物次生代謝產(chǎn)物的研究已有很多，ZHU等[27]研究認(rèn)為：柴胡Bupleurumchinense在水分脅迫下通過增加次生代謝產(chǎn)物的含量來提高抗氧化能力，進(jìn)而抵制因水分脅迫產(chǎn)生的自由基；有研究發(fā)現(xiàn)：低溫培養(yǎng)的黃豆Glycinemax，其大豆黃素和染料木苷的代謝水平顯著增高[28]；LI等[29]在研究擬南芥Arabidopsis thaliana應(yīng)對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)：黃酮類化合物含量上升。三葉青作為中藥材，其藥用活性成分主要有黃酮類化合物、酚酸類化合物、萜類化合物等次生代謝產(chǎn)物，本研究發(fā)現(xiàn)：水分脅迫促進(jìn)了三葉青黃酮的積累，導(dǎo)致總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于對(duì)照，說明水澇和干旱使三葉青黃酮代謝增強(qiáng)，增加了三葉青塊根單位干質(zhì)量的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。小麥Triticum aestivum、丹參Salviamiltiorrhiza等在水分脅迫下同樣出現(xiàn)了黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升的情況[30?31]。

PAL是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，可催化苯丙氨酸生成香豆酸、肉桂酸等中間產(chǎn)物，并且可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為綠原酸、香豆素，也能夠形成酯，再經(jīng)歷多條途徑，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素、類黃酮等物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)：藥用植物在遭遇逆境脅迫時(shí)，PAL活性提高，當(dāng)脅迫過嚴(yán)重時(shí)，PAL活性變?nèi)鮗32]，本研究也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。脅迫前期，PAL活性增強(qiáng)，催化苯丙氨酸代謝，促進(jìn)黃酮代謝的進(jìn)行；隨著脅迫時(shí)間加長，PAL活性降低。CHS和CHI分別是黃酮類化合物合成途徑中的第1個(gè)和第2個(gè)關(guān)鍵酶，脅迫會(huì)上調(diào)CHS、CHI活性[33]。本研究中，CHS和CHI活性在PAL之后增強(qiáng)，而黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)也在這時(shí)達(dá)到峰值，這與酶作用途徑中的順序一致；而在脅迫后期，PAL、CHS、CHI活性不斷下降，三葉青黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有所回落，這可能是由于脅迫使三葉青生長受到威脅，嚴(yán)重抑制各種生命活動(dòng)，各種酶的活性也不斷下降。

郭肖等[34]對(duì)水芹Oenanthejavanica黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和PAL活性的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：黃酮含量與PAL活性的變化趨勢一致。本研究發(fā)現(xiàn)：三葉青塊根中PAL、CHS、CHI活性與黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，且部分指標(biāo)顯著相關(guān)(P＜0.05)，表明三葉青黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與關(guān)鍵酶活性相關(guān)，關(guān)鍵酶活性增強(qiáng)可能是引起三葉青黃酮高積累的關(guān)鍵因素。許多研究也證明了這一點(diǎn)，如LI等[35]研究發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)基因煙草Nicotianatabacum的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與CHI活性呈正相關(guān)；在溫度與水分脅迫下，參與銀杏Ginkgo biloba黃酮類代謝的PAL、CHS基因表達(dá)量的變化趨勢與類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢基本一致[36]。

水分脅迫影響三葉青的生長，表現(xiàn)為葉片塊根受損、葉綠體超微結(jié)構(gòu)損傷、黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及黃酮合成途徑相關(guān)酶活性變化等。三葉青通過產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)以應(yīng)對(duì)水分脅迫，適度的水分脅迫可通過增強(qiáng)黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶活性以增強(qiáng)抗逆性，同時(shí)增加黃酮的產(chǎn)量，提高三葉青的藥材品質(zhì)。