陸丹迎，程少禹，章穎佳，劉志高，金夢(mèng)婷，董 彬，張壽洲，彭 豪，戴夢(mèng)怡，王卓為，趙宏波，申亞梅

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.深圳市/中國(guó)科學(xué)院 仙湖植物園，廣東 深圳 518004）

景寧木蘭Magnoliasinostellata是木蘭科Magnoliaceae木蘭屬M(fèi)agnolia植物，屬于典型的極小種群瀕危樹(shù)種。景寧木蘭幼苗生長(zhǎng)需要一定的蔭庇環(huán)境[1]，但過(guò)度遮陰會(huì)抑制景寧木蘭幼苗的光合速率[2]。自然狀態(tài)下，群落所形成的遮陰是影響群落內(nèi)瀕危植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素[3]。景寧木蘭多生長(zhǎng)于光照充足的針葉群落，在針闊混交群落和闊葉群落分布較少[4]。據(jù)此推斷，群落所形成的遮陰會(huì)削弱景寧木蘭的生長(zhǎng)勢(shì)，是導(dǎo)致景寧木蘭瀕危的重要因素。光是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子。植物的整個(gè)生命周期都受到不斷變化的光環(huán)境影響。光敏色素是植物重要的光感受器，能夠感受環(huán)境中光信號(hào)的變化。光敏色素作用因子(phytochrome interacting factors, PIFs)能夠感知紅光和遠(yuǎn)紅光信號(hào)，在光信號(hào)傳導(dǎo)和植物生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用。光信號(hào)在通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，能夠誘導(dǎo)一系列生理生化反應(yīng)。光敏色素作用因子是光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要調(diào)控因子，屬于bHLH超家族的第15亞族，其家族成員都具有高度保守的bHLH結(jié)構(gòu)域。bHLH結(jié)構(gòu)域由約15個(gè)氨基酸的堿性結(jié)構(gòu)域(basic region)和60個(gè)氨基酸的HLH(helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)域組成[5]。目前對(duì)PIF家族轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在模式植物擬南芥Arabidopsisthaliana中。PIF轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了擬南芥的光調(diào)控反應(yīng)，并在光敏色素介導(dǎo)的光信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中處于主導(dǎo)地位[6]。黑暗條件下，AtPIF1能夠抑制擬南芥種子的萌發(fā)，AtPIF3、AtPIF4、AtPIF5能夠促進(jìn)葉綠素分解并抑制葉綠體活性，從而最終導(dǎo)致葉片衰老[7]。遮陰條件下，AtPIF1能夠通過(guò)調(diào)控AtHB1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)下胚軸的伸長(zhǎng)[8]；AtPIF4、AtPIF5和AtPIF7通過(guò)促進(jìn)AtFT和AtTSF的表達(dá)從而促進(jìn)擬南芥開(kāi)花[9]；AtPIF4、AtBZR1和AtARF6通過(guò)整合生長(zhǎng)素信號(hào)與BR和光敏色素通路來(lái)協(xié)同促進(jìn)擬南芥下胚軸的伸長(zhǎng)[10]。由此可見(jiàn)，PIF家族轉(zhuǎn)錄因子是遮陰條件下光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子。據(jù)此推測(cè)，PIF家族轉(zhuǎn)錄因子在光照強(qiáng)度對(duì)木蘭屬瀕危樹(shù)種生長(zhǎng)發(fā)育的影響及光受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到重要作用。因此，本研究對(duì)景寧木蘭PIF家族轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析鑒定，探究其在極端遮陰條件下的表達(dá)模式，從而為揭示光介導(dǎo)的景寧木蘭生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制、群落引起的遮陰而導(dǎo)致景寧木蘭瀕危的內(nèi)在機(jī)制奠定基礎(chǔ)，最終為珍稀植物景寧木蘭的保育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

景寧木蘭來(lái)自浙江省杭州市青山湖花園中心苗圃培育的3年生扦插苗。2019年6月下旬，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致且無(wú)病蟲(chóng)害的扦插苗作為材料，置于溫度為(25±2) ℃、光照強(qiáng)度為2 000～2 500 lx、相對(duì)濕度為40%～60%的人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)，光照與黑暗時(shí)間各12 h，定期澆水保持土壤濕潤(rùn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3層遮陽(yáng)網(wǎng)形成的光照強(qiáng)度是景寧木蘭自然生境光照條件之一，會(huì)顯著削弱景寧木蘭的生長(zhǎng)勢(shì)[1]。2019年7月上旬開(kāi)始遮陰處理，本研究于浙江省杭州市臨安區(qū)浙江農(nóng)林大學(xué)人工氣候室內(nèi)，用3層黑色遮陽(yáng)網(wǎng)及竹竿搭建極端遮陰處理(25%光照，ST)裝置，以模擬遮陰條件下的景寧木蘭野外生存環(huán)境。以100%全光照為對(duì)照(ck)。所有盆栽苗葉片之間無(wú)重疊。每個(gè)處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。分別自實(shí)驗(yàn)開(kāi)始處理第0、1、3、5、10、20、30天時(shí)，拍照記錄植株表型變化、采集景寧木蘭植株的中層葉片裝入錫紙袋中，并迅速置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)入?80 ℃冰箱中儲(chǔ)存，用于植物RNA的提取及后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 景寧木蘭PIF家族轉(zhuǎn)錄因子的篩選 基于實(shí)驗(yàn)室已有的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，在NR、NT、Swiss-Prot這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋?zhuān)醪阶⑨尩?6個(gè)PIF轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因，將這些基因編碼蛋白質(zhì)逐個(gè)進(jìn)行NCBI Blast和NCBI CDD預(yù)測(cè)，去除重復(fù)序列及冗余轉(zhuǎn)錄本后，最終得到9個(gè)PIF家族轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)序列。利用MEGA 5.0對(duì)景寧木蘭PIF轉(zhuǎn)錄因子序列與擬南芥PIF轉(zhuǎn)錄因子序列進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)TOLEDO等[5]命名擬南芥PIF家族的方法對(duì)9個(gè)景寧木蘭PIF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行命名。擬南芥PIF轉(zhuǎn)錄因子序列從擬南芥轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/)中獲得。

1.3.2 景寧木蘭 PIF 家族轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)分析 采用 Compute pI/Mw 在線工具預(yù)測(cè)景寧木蘭 PIF 轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量，采用在線網(wǎng)站Cell-PLoc 2.0預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位，利用NetPhos分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；利用MEME分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；利用DNAMAN比對(duì)分析保守結(jié)構(gòu)域；利用在線軟件heatmapper(http://www2.heatmapper.ca/expression/)繪制熱圖；為研究PIF轉(zhuǎn)錄因子家族的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA5.0將9個(gè)景寧木蘭MsPIF蛋白質(zhì)序列、15個(gè)擬南芥AtPIF蛋白質(zhì)序列[11]、6個(gè)玉米ZeamaysZmPIF蛋白質(zhì)序列(http://www.plantgdb.org/ZmGDB/)[12]、10個(gè)楊樹(shù)PopulustrichocarPtPIF蛋白質(zhì)序列(http://www.Phytozome.net/poplar.php)[13]進(jìn)行序列比對(duì)，并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行Bootstrap 測(cè)試，重復(fù)設(shè)置為 1 000 次。

1.3.3 極端遮陰條件下景寧木蘭PIF家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式 采用植物RNA提取試劑盒提取樣品總RNA。取 1 μg RNA 進(jìn)行第 1 鏈 cDNA 的合成。所用定量 PCR 試劑為 BCG qPCR Master Mix。根據(jù)景寧木蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。以景寧木蘭的EF1-α基因作為內(nèi)參基因[1]，利用Light Cycler 480II(Roche)儀器進(jìn)行目的基因qRT-PCR表達(dá)分析。反應(yīng)程序結(jié)束后，65～95 ℃每隔0.2 s作溶解曲線，采用 2???Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

表 1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物Table 1 Primers used for qRT-PCR analysis

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 采用 SPSS 19.0 進(jìn)行方差分析并用 SigmaPlot 14 繪圖，對(duì)平均值采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行比較，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列鑒定及理化性狀分析

利用ExPASy對(duì)9個(gè)基因編碼的氨基酸進(jìn)行理化性質(zhì)進(jìn)行分析(表2)，發(fā)現(xiàn)9個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)大小不等，最小的為MsPIF1，編碼188個(gè)氨基酸，最大的為MsPIF3，編碼735個(gè)氨基酸。9個(gè)蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)為5.18(MsbHLH68)～8.22(MsPIF8)，表明不同的PIF家族蛋白質(zhì)在不同的微環(huán)境中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。9個(gè)PIF家族蛋白質(zhì)均屬于不穩(wěn)定、親水性蛋白質(zhì)。

表 2 MsPIF 基因家族Table 2 MsPIF gene family of M.sinostellata

2.2 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

通過(guò)在線軟件Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)對(duì)9個(gè)PIF基因家族成員的氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)(表2)，9個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)均定位于細(xì)胞核內(nèi)，符合其轉(zhuǎn)錄因子的功能，可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞核基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮功能。

2.3 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)分析

蛋白質(zhì)磷酸化在很多植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用[14]。蛋白質(zhì)磷酸化的可逆性使得植物細(xì)胞能夠快速響應(yīng)外部環(huán)境變化[15]。在正常光條件下，PIF家族轉(zhuǎn)錄因子與光敏色素相互作用，從而導(dǎo)致PIF蛋白質(zhì)的磷酸化和降解[16]。而在低光照條件下，PIF蛋白質(zhì)的磷酸化和降解受到抑制[17]。因此，分析PIF蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)對(duì)研究其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能有重要意義。利用NetPhos對(duì)9個(gè)PIF家族蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析(表2)，發(fā)現(xiàn)9個(gè)蛋白質(zhì)均具有絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)，且Ser的磷酸化位點(diǎn)最多，Tyr的磷酸化位點(diǎn)最少。其中磷酸化位點(diǎn)最多的是MsPIF3，為94個(gè)，MsPIF1的磷酸化位點(diǎn)最少，僅7個(gè)。

2.4 蛋白質(zhì)的基序分析

進(jìn)一步利用MEME在線軟件分析MsPIF蛋白質(zhì)[16]，共鑒定到6個(gè)基序(表3)。結(jié)果顯示(圖1)：9個(gè)蛋白質(zhì)含有不同數(shù)目的基序，MsPIF4和MsPIF8含有的基序最多，為5個(gè)，而MsbHLH48中含有的基序最少，僅2個(gè)。bHLH家族蛋白質(zhì)均含有bHLH基序，該基序由位于N端的basic基序(圖2A)和位于C端的HLH基序(圖2B)組成[5]。9個(gè)PIF家族蛋白質(zhì)均含有basic基序及HLH基序。不同蛋白質(zhì)的同源異型基序之間存在一定差異。MsPIF4、MsPIF3和 MsPIF8 中含有 APB 基序 (active phyB-binding motif)(圖 2C)，表明其可以與 PhyB(phytochrome B)相結(jié)合，從而對(duì)下游基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[16]。此外，MsPIF4和MsPIF3中還含有APA基序(active phyA-binding motif)(圖2D)，表明其既可以與PhyA(phytochrome A)相結(jié)合也可以與PhyB相結(jié)合。

表 3 景寧木蘭 PIF 家族蛋白質(zhì)的主要 MEME基序 Table 3 Major MEME motif sequences in M.sinostellata PIF protein

圖 1 MsPIF 蛋白質(zhì)的基序Figure 1 Motif of MsPIF protein

圖 2 MsPIF家族蛋白質(zhì)的basic、HLH、APB和APA基序蛋白質(zhì)序列比對(duì)Figure 2 Sequence alignment of basic, HLH, APB and APA motif protein sequences of MsPIF

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

運(yùn)用MEGA5對(duì)所得景寧木蘭的蛋白質(zhì)序列與擬南芥、玉米、楊樹(shù)中的序列對(duì)比分析(圖3)，采用鄰接法及Bootstrap分析(1 000次重復(fù))構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[18]。結(jié)果表明：植物PIF家族蛋白質(zhì)表現(xiàn)出多樣性，可以分為7個(gè)進(jìn)化分枝。其中，9個(gè)MsPIF蛋白質(zhì)分布在α、β、γ、δ、η、ε等6個(gè)進(jìn)化枝。15個(gè)AtPIF蛋白質(zhì)分布在α、β、γ、δ、ζ、ε等6個(gè)進(jìn)化枝，其中ζ為擬南芥所特有。ZmPIF蛋白質(zhì)僅分布于β和δ進(jìn)化枝，10個(gè)PtPIF蛋白質(zhì)分布在α、β、γ、δ、ε等5個(gè)進(jìn)化枝。從進(jìn)化樹(shù)可以看出，MsPIF8、MsPIF4、MsPIF1、MsPIF3及MsbHLH23均與相應(yīng)的擬南芥蛋白質(zhì)與楊樹(shù)蛋白質(zhì)聚類(lèi)在一起，表明其親緣關(guān)系較為接近。MsbHLH68、MsbHLH66、MsbHLH48匯聚于η枝，為景寧木蘭所特有。

圖 3 景寧木蘭、擬南芥、玉米和楊樹(shù)的PIF家族蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化分析Figure 3 Phylogenetic tree analysis of MsPIF protein and AtPIF protein sequences in M.sinostellata, A.thaliana, Z.mays, P.trichocarpa

2.6 長(zhǎng)期極端遮陰條件下MsPIF家族基因的表達(dá)

光照是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可或缺的因素，極端遮陰處理過(guò)程中，景寧木蘭葉片表型變化十分明顯(圖4)。處理10 d，景寧木蘭葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)；處理20 d，褐色斑點(diǎn)面積增大，植株開(kāi)始萎蔫；處理30 d，大量葉片干枯脫落，植株萎蔫嚴(yán)重。

圖 4 遮陰處理過(guò)程中景寧木蘭的表型變化Figure 4 Phenotypic changes of M.sinostellata during shading treatment

PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)9個(gè)基因均擴(kuò)出預(yù)期條帶(圖5)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖6)表明：遮陰處理1 d時(shí)，MsbHLH23和MsbHLH66的表達(dá)水平顯著上調(diào)，MsbHLH1、MsbHLH48、MsPIF8、MsPIF3的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，其余基因表達(dá)水平無(wú)顯著變化。遮陰處理3 d時(shí)，MsPIF8的表達(dá)顯著低于對(duì)照，其余基因的表達(dá)均顯著上調(diào)。遮陰處理5 d時(shí)，MsPIF8的表達(dá)仍顯著降低，MsbHLH68、MsbHLH23、MsbHLH66、MsbHLH1、MsbHLH48 的表達(dá)顯著上調(diào)，其余基因的表達(dá)無(wú)顯著差異。遮陰處理 10 d 時(shí)，MsPIF8、MsPIF7、MsPIF3 的表達(dá)均顯著下調(diào)，MsbHLH68、MsbHLH23、MsbHLH66、MsPIF4的表達(dá)顯著上調(diào)。遮陰處理20 d時(shí)，MsPIF8、MsbHLH23、MsPIF1的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照顯著下調(diào)，MsbHLH68和MsbHLH66的表達(dá)顯著上調(diào)，其余基因無(wú)顯著差異。遮陰處理30 d時(shí)，MsPIF8、MsbHLH23的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照顯著下調(diào)，MsbHLH68、MsbHLH1、MsbHLH66、MsbHLH48、MsPIF3的表達(dá)顯著上調(diào)。其中，MsbHLH23的表達(dá)變化比其他基因更為明顯，遮陰處理5和10 d時(shí)的表達(dá)量分別上調(diào)為對(duì)照的52.77與20.03倍。

圖 5 qRT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物特異性Figure 5 Specificity of qRT-PCR amplification products

圖 6 遮陰條件下景寧木蘭 PIF 轉(zhuǎn)錄因子的 qRT-PCR 分析Figure 6 qRT-PCR analysis of PIF transcription factor under shading treatment of M.sinostellata

基因的表達(dá)模式與基因功能關(guān)系密切，基于獲得的景寧木蘭處理組的qRT-PCR數(shù)據(jù)，采用heatmap在線軟件對(duì)這些基因的差異表達(dá)進(jìn)行分層聚類(lèi)分析(圖7)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MsPIF1、MsPIF3、MsPIF4、MsPIF8的表達(dá)模式十分相似，其表達(dá)均在處理3 d時(shí)明顯升高，隨后逐漸下降。MsbHLH48的表達(dá)在處理0～30 d逐漸上調(diào)，其中處理30 d時(shí)的表達(dá)上調(diào)最為明顯。MsbHLH1、MsbHLH68、MsbHLH66、MsbHLH23的表達(dá)模式均為先逐漸上調(diào)后逐漸下調(diào)，其中MsbHLH1和MsbHLH23的表達(dá)在處理5 d顯著上調(diào)，MsbHLH68和MsbHLH66的表達(dá)分別在處理10和20 d明顯上調(diào)。

圖 7 長(zhǎng)期極端遮陰條件下景寧木蘭 PIF 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式Figure 7 Pattern of expression of PIF family during shading treatment period of M.sinostellata

3 討論

3.1 景寧木蘭中 PIF 家族轉(zhuǎn)錄因子

PIF家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中。目前PIF家族轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中研究的最為透徹，共有15個(gè)[5]。在其他物種中，楊樹(shù)至少存在10個(gè)[13]，玉米有6個(gè)[12]，水稻Oryzasativa有6個(gè)[19]。本研究從景寧木蘭中僅篩選到9個(gè)，這一方面是由于景寧木蘭本身具有特異性，另一方面可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)還不夠豐富造成的。NCBI blast及NCBI CDD預(yù)測(cè)結(jié)果表明：9個(gè)PIF蛋白質(zhì)均含bHLH結(jié)構(gòu)域，屬于PIF轉(zhuǎn)錄因子家族。同源性較高的蛋白質(zhì)通常功能也相似[18]。因此，本研究用所得9個(gè)景寧木蘭PIF家族轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白質(zhì)與6個(gè)ZmPIFs、10個(gè)PtPIFs 和15個(gè)功能明確的AtPIFs編碼蛋白質(zhì)作系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，主要根據(jù)與15個(gè)擬南芥PIF家族轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白質(zhì)進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近推測(cè)景寧木蘭PIF轉(zhuǎn)錄因子的功能。AtPIF3與PtPIF3a、PtPIF3b同源性較高，且與AtPIF3和ZmPIF3位于同一進(jìn)化枝，據(jù)此推測(cè)MsPIF3與AtPIF3功能相似。MsPIF4與PtPIF4、ZmPIF4、AtPIF4位于同一進(jìn)化枝。AtPIF3蛋白質(zhì)在植株剛剛暴露到光下時(shí)會(huì)急劇減少，在黑暗條件下會(huì)重新積累，在擬南芥幼苗階段，AtPIF3在光誘導(dǎo)的葉綠體發(fā)育中起到積極的作用[20]。AtPIF3、AtPIF4和AtPIF5在年齡引起的和黑暗引起的植物衰老中起到重要作用，其中AtPIF4通過(guò)調(diào)控葉綠素降解和維持葉綠體活性的相關(guān)基因從而促進(jìn)植株衰老[7]。AtPIF4能夠調(diào)控下游基因從而促進(jìn)擬南芥開(kāi)花[21]。

此外，AtPIF4能與AtBZR1共同調(diào)節(jié)下游光響應(yīng)的相關(guān)基因。AtPIF7與MsbHLH1同源性較高，推測(cè)其功能可能類(lèi)似。遮陰條件下，AtPIF7是調(diào)控?cái)M南芥莖伸長(zhǎng)的重要因子[17]。AtPIF7是調(diào)節(jié)植物去黃化的弱負(fù)反饋因子，與PhyB結(jié)合的過(guò)程中通常不伴隨著可以監(jiān)測(cè)到的磷酸化和分解[22]。MsPIF8與AtPIF8同源，推測(cè)其功能相似。與AtPIF3不同，AtPIF8蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紅光下的積累比在黑暗條件中或紅光條件下更多，AtPIF8能夠抑制由PhyA介導(dǎo)的種子萌發(fā)、下胚軸伸長(zhǎng)等生命活動(dòng)[23]。MsbHLH23與AtbHLH24功能相似，AtbHLH24在抑制種子萌發(fā)和維持種子休眠狀態(tài)中具有重要作用[24]。AtbHLH24能夠激活細(xì)胞分裂素信號(hào)，同時(shí)激活生長(zhǎng)素生物合成和雄蕊內(nèi)部結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運(yùn)基因，并且在花瓣和果實(shí)發(fā)育中起到重要作用[25]。MsbHLH68，MsbHLH66和MsbHLH48共同匯集于同一進(jìn)化枝，其功能還需要進(jìn)一步挖掘。但是，即使是同一分支內(nèi)蛋白質(zhì)功能也可能存在差異，并且不同物種之間具有較大的差異[18]。因而關(guān)于MsPIF家族蛋白質(zhì)的具體功能還需要通過(guò)后續(xù)研究。

3.2 景寧木蘭內(nèi)在瀕危機(jī)制

群落層片造成的遮陰會(huì)降低下層植被的生長(zhǎng)率與成活率[26]。本研究極端遮陰處理組的景寧木蘭在處理過(guò)程中逐步萎蔫死亡。光敏色素作用因子(PIFs)在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要調(diào)節(jié)作用。PIFs作為光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的負(fù)調(diào)控因子，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過(guò)程都有調(diào)控作用[27?32]。PIF家族轉(zhuǎn)錄因子是光敏色素介導(dǎo)的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的負(fù)反饋因子[28]。遮陰條件下，PIF蛋白質(zhì)大量積累，從而調(diào)控植物發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)?？紤]到植物的個(gè)體差異和基因表達(dá)差異，本研究的每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)都作了相應(yīng)的空白對(duì)照。本研究中，長(zhǎng)期極端遮陰條件下，景寧木蘭的PIF類(lèi)家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平多數(shù)顯著上調(diào)，只有MsPIF8的表達(dá)水平顯著下調(diào)。在擬南芥中，與其他PIF家族成員相比，AtPIF8能夠與PhyB結(jié)合但效果微弱[23]。MsPIF8的表達(dá)模式與前人的研究結(jié)論存在差異，可能與物種特異性相關(guān)，有關(guān)MsPIF8的功能還需要進(jìn)一步研究。MsPIF1、MsPIF3和MsPIF4的表達(dá)模式與前人的研究結(jié)論[29]吻合。黑暗條件下，AtPIF1的表達(dá)上調(diào)，從而抑制葉綠素的合成與種子萌發(fā)；AtPIF3、AtPIF4的表達(dá)顯著上調(diào)，從而促進(jìn)葉綠素的降解與葉片衰老[29]。植物群落造成的遮陰使得AtPIF4的表達(dá)上調(diào)，從而使成花誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，最終誘導(dǎo)擬南芥提早開(kāi)花[21]。PIF功能十分復(fù)雜，景寧木蘭PIF家族轉(zhuǎn)錄因子在遮陰調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用還需要進(jìn)一步研究。