王旻凱，吳擁軍，魏新亭

(1. 鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學公共衛(wèi)生學院，河南 鄭州 450001)

腦膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，WHO根據(jù)其組織病理學惡性程度將其分為Ⅰ～Ⅳ級[1]。目前對于膠質(zhì)瘤的治療方法較為有限，主要為安全范圍內(nèi)最大限度手術(shù)切除結(jié)合術(shù)后放化療，而高級別膠質(zhì)瘤患者在接受積極治療后總生存期仍較短[2]。為了實現(xiàn)膠質(zhì)瘤治療的新突破，膠質(zhì)瘤相關(guān)基因成為了近年來的研究熱點[3-6]。

FCR受體3A(FCGR3A)又名CD16a，編碼IgG受體Ⅲa的Fc段，該受體作為一種跨膜糖蛋白主要表達于自然殺傷細胞并參與多種免疫反應(yīng)。使用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)對癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫進行分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CGR3A在浸潤性乳腺癌、腎透明細胞癌、胰腺癌、胃癌中相對表達量較正常對照組織顯著增加，且高表達者預(yù)后較差，而FCGR3A在腦膠質(zhì)瘤中的表達水平及生物學功能仍不清楚。本研究分析了FCGR3A在腦膠質(zhì)瘤中的表達情況及生物學特性，并評估了FCGR3A相對表達量與腫瘤中免疫細胞浸潤程度及腫瘤惡性進展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床資料從中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜(Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫中分別納入1 018例和668例腦膠質(zhì)瘤患者，下載其mRNA測序數(shù)據(jù)以及臨床資料，剔除平均相對表達量不足0.1的基因。CGGA數(shù)據(jù)庫中共納入1 018例患者，其中男601例，女417例；年齡8～79(43±12)歲；WHO分級Ⅱ級291例，Ⅲ級334例，Ⅳ級388例，分級不明5例；組織病理學診斷為星形細胞瘤389例，少突細胞瘤112例，少突星形細胞瘤124例，膠質(zhì)母細胞瘤388例，分類不明5例。從TCGA數(shù)據(jù)庫納入668例，其中男345例，女270例，性別不詳53例；年齡14～89(46±15)歲；WHO分級Ⅱ級247例，Ⅲ級260例，Ⅳ級160例，分級不明1例；組織病理學診斷為星形細胞瘤192例，少突細胞瘤188例，少突星形細胞瘤128例，膠質(zhì)母細胞瘤160例。將患者根據(jù)其腫瘤組織病理學分類、膠質(zhì)瘤亞型標準、WHO分級、異檸檬酸脫氫酶(iocitrate dehydrogenase，IDH)基因突變狀態(tài)的不同進行分組，分析FCGR3A在不同分組中表達水平的差異。

1.2 生存分析CGGA數(shù)據(jù)庫中937例患者隨訪資料完整，F(xiàn)CGR3A相對表達量中位數(shù)為3.228(0.394～6.504)；TCGA數(shù)據(jù)庫中666例患者隨訪資料完整，F(xiàn)CGR3A相對表達量中位數(shù)為2.703(0.499～5.965)；將2個數(shù)據(jù)庫中的患者依據(jù)FCGR3A相對表達量與其所在數(shù)據(jù)庫該基因相對表達量中位數(shù)的關(guān)系歸為高、低表達組，采用Kaplan-Meier法對高、低表達組患者的總生存期進行分析。通過單因素、多因素Cox回歸分析影響腦膠質(zhì)瘤患者生存的因素，并分析FCGR3A相對表達量對腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響。

1.3 基因功能富集分析使用R軟件4.0.2(https://www.r-project.org/)進行分析，通過Pearson相關(guān)檢驗篩選與FCGR3A表達相關(guān)的基因，篩選條件為|r|>0.6，P<0.05。使用R軟件clusterProfiler包對篩選得到的基因進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析。

1.4 免疫細胞浸潤分析采用Charoentong等[7]標記的28種免疫細胞對應(yīng)基因集，分別對CGGA和TCGA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用R軟件GSVA包進行免疫浸潤程度評分，并分析FCGR3A相對表達量與腫瘤組織中免疫細胞浸潤程度的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 FCGR3A在腦膠質(zhì)瘤中的表達結(jié)果CGGA數(shù)據(jù)庫中，F(xiàn)CGR3A高表達于惡性程度最高的膠質(zhì)母細胞瘤、間質(zhì)型膠質(zhì)瘤，相對表達量隨腫瘤WHO分級升高而增加，且FCGR3A在惡性程度較高的IDH野生型膠質(zhì)瘤中也呈現(xiàn)高表達(圖1)。FCGR3A的上述表達特征在TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得了相似的結(jié)果(圖2)。

圖1 FCGR3A在CGGA數(shù)據(jù)庫不同分組中的表達情況

圖2 FCGR3A在TCGA數(shù)據(jù)庫不同分組中的表達情況

2.2 FCGR3A表達水平與腦膠質(zhì)瘤患者總生存期的關(guān)系對生存資料完整的腦膠質(zhì)瘤患者進行生存分析顯示，CGGA和TCGA數(shù)據(jù)庫中FCGR3A高表達組的患者累積生存率顯著低于低表達組(圖3)。對CGGA數(shù)據(jù)庫中442例臨床資料完整的初次手術(shù)病例進行單因素Cox回歸分析顯示，F(xiàn)CGR3A相對表達量、病理類型、WHO分級、年齡、術(shù)后化療、IDH突變、1p/19q染色體共缺失、O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase，MGMT)基因啟動子甲基化影響患者的生存期(P均<0.05)，而性別和是否接受放療并不是影響因素；多因素Cox回歸分析顯示，F(xiàn)CGR3A相對表達量、WHO分級，年齡、術(shù)后化療、IDH基因突變、1p/19q共缺失是腦膠質(zhì)瘤患者總生存期的獨立影響因素(P均<0.05)。見表1。

圖3 FCGR3A基因低表達和高表達組腦膠質(zhì)瘤患者Kaplan-Meier生存曲線

表1 影響CGGA數(shù)據(jù)庫中442例腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的Cox回歸分析結(jié)果

2.3 基因功能富集結(jié)果使用Pearson相關(guān)檢驗篩選與FCGR3A表達相關(guān)的基因，篩選條件為|r|>0.6，P<0.05，分別從CGGA及TCGA數(shù)據(jù)庫獲得883和593個基因。GO分析顯示，F(xiàn)CGR3A及其相關(guān)基因與中性粒細胞激活、中性粒細胞介導的免疫反應(yīng)、T細胞激活、白細胞激活及增生、淋巴細胞激活等多種免疫活動密切相關(guān)。見圖4。

圖4 GO分析顯示FCGR3A及其相關(guān)基因的生物學功能

2.4 FCGR3A表達與免疫細胞浸潤在CGGA數(shù)據(jù)庫中，F(xiàn)CGR3A相對表達量增加與膠質(zhì)瘤組織中免疫細胞浸潤總評分升高呈正相關(guān)(r=0.827，P<0.001)，與膠質(zhì)瘤細胞純度負相關(guān)(r=-0.791，P<0.001)。FCGR3A相對表達量與28種免疫細胞對應(yīng)基因集的相關(guān)性分析熱圖顯示，大多數(shù)類型的免疫細胞浸潤程度與FCGR3A相對表達量呈顯著正相關(guān)，在TCGA數(shù)據(jù)庫中也獲得了相似的結(jié)果。見圖5。

3 討論

本研究中，我們分析了來自CGGA數(shù)據(jù)庫1 018例及TCGA數(shù)據(jù)庫668例膠質(zhì)瘤患者的臨床資料和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)FCGR3A相對表達量隨膠質(zhì)瘤WHO分級升高而增加，在WHO Ⅳ級的膠質(zhì)母細胞瘤中相對表達量最高。膠質(zhì)瘤分子四亞型中，間質(zhì)型膠質(zhì)瘤侵襲性最強、預(yù)后最差[8]；IDH基因突變多出現(xiàn)于低級別膠質(zhì)瘤及繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤中，預(yù)后較好[9]。我們的分析顯示，F(xiàn)CGR3A高表達于高惡性程度的間質(zhì)型膠質(zhì)瘤及預(yù)后較差的IDH野生型膠質(zhì)瘤中。對2種數(shù)據(jù)庫中的患者分別進行生存分析顯示，F(xiàn)CGR3A高表組的總生存時間較短，低表達組患者總生存期相對較長，結(jié)合Cox回歸分析的結(jié)果，我們認為FCGR3A高表達是腦膠質(zhì)瘤患者潛在的預(yù)后預(yù)測因子。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織中FCGR3A相對表達量增加伴隨著免疫細胞浸潤程度升高及腫瘤細胞純度的降低。腫瘤惡性進展的過程受免疫細胞浸潤、細胞外基質(zhì)改變、病理性血管生成等多種因素影響[10]。越來越多的證據(jù)表明腫瘤微環(huán)境在膠質(zhì)瘤進展中起著不可或缺的作用，且腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤程度可隨著腫瘤惡性程度增加而升高[11-12]。既往研究表明，中性粒細胞和巨噬細胞浸潤是判斷膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的可靠指標[12]，且不同類型的浸潤免疫細胞通過相互作用可促進膠質(zhì)瘤形成抵抗治療的穩(wěn)態(tài)[13-14]。研究還發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞能產(chǎn)生許多細胞因子，有助于不同類型的免疫細胞向腫瘤內(nèi)浸潤，從而形成一個適宜腫瘤細胞生長的微環(huán)境，并在腫瘤的生長、復(fù)發(fā)和干預(yù)治療等過程中發(fā)揮重要作用[11]。

通過對膠質(zhì)瘤組織中與FCGR3A表達相關(guān)的基因進行功能富集分析，我們發(fā)現(xiàn)其參與多種免疫相關(guān)生物學過程，特別是中性粒細胞激活、中性粒細胞介導的免疫反應(yīng)等生物學過程。在腫瘤微環(huán)境中，N2型中性粒細胞隨著腫瘤發(fā)展逐漸增多，通過生成髓過氧化物酶和精氨酸酶，產(chǎn)生活性氧和活性氮從而抑制T細胞的抗腫瘤作用[15]。此外，中性粒細胞還能通過增加膠質(zhì)母細胞瘤中的膠質(zhì)瘤干細胞數(shù)量，促進腫瘤進展[16]?；谝陨辖Y(jié)果，我們認為FCGR3A基因所編碼的膜蛋白作為一種膜受體，能夠激活多種免疫反應(yīng)，增加腦膠質(zhì)瘤中的免疫細胞浸潤程度并導致膠質(zhì)瘤出現(xiàn)惡性進展。

綜上所述，本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床資料，并對相關(guān)生物學功能進行分析，發(fā)現(xiàn)FCGR3A相對表達量與腦膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)。FCGR3A高表達是腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨立危險因素，可作為腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的預(yù)測指標，可能成為潛在的治療靶點。